从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较.pdf

中国农学通报2011,27(7):227-230ChineseAgricultural Science Bulletin0 引言随着生命科学的飞速发展，对生命奥秘的探索已经深入到分子水平。从凝胶中回收DNA是分子生物学实验中经常遇到的问题，特别是对100 bp以下的小片段的电泳回收更是分子生物学的重要内容。小片段DNA的回收一般采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)1。研究表明，从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度较高，可适用于分子生物学中较高要求的实验2-4。虽然目前有几种常用的回收方法5-7，也有几家知名生物试剂公司开发了相应的试剂盒，但这些回收方法不是操作较繁琐就是回收成本较高。因此，探索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的基金项目：国家自然科学基金“茶氨酸生物合成的基因转录调控研究”（3087157）；湖南农业大学人才稳定基金“茶树重要功能基因的克隆与鉴定”（07WD22）。第一作者简介：章蕾，女，1986年出生，湖南浏阳，硕士在读。通讯地址：410128 湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室，E-mail：。通讯作者：刘仲华，男，1965年出生，湖南衡阳，教授，博士生导师，茶叶科学和药用植物资源功能成分研究。通信地址：410128 湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室，E-mail：larkin-。收稿日期：2011-01-05，修回日期：2011-03-17。从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较章 蕾，袁 玲，黄建安，吴文亮，陈东生，刘仲华（湖南农业大学茶学教育部重点实验室/国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙 410128）摘 要：从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段是分子生物学中的常用技术，尤其针对于DNA小片段的回收。本试验对比了两种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的方法（煮沸法和水浴法），并用无水乙醇和3 mol/L醋酸钠共沉淀纯化DNA小片段。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测回收结果，通过紫外检测进行定量分析，结果显示：水浴法比煮沸法的回收率高。水浴法结合乙醇沉淀法还具有经济和操作简单的优点，可以广泛应用。关键词：非变性聚丙烯酰胺凝胶；DNA小片段；回收；纯化中图分类号：Q7文献标志码：A论文编号：2011-0003Comparative Study on Two Methods of Recycling Short DNA Fragmentsfrom Nondenaturing Polyacrylamide GelZhang Lei,Yuan Ling,Huang Jian an,Wu Wenliang,Chen Dongsheng,Liu Zhonghua(Key Lab of Tea Science of Ministry of Education,Hunan Agricultural University/National Research Center of Engineering&Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanical,Changsha 410128)Abstract:Recycling DNA fragments from polyacrylamide gel is a common technique in molecular biology,especially for recycling DNA short fragments.In this experiment,two methods(boiling method and water-bathmethod)were used to extract short DNA fragments which were co-precipitated with absolute ethanol and 3 mol/L sodium acetate together.The results were compared by polyacrylamide gel electrophoresis.At last,shortDNA fragments was analyzed by the method of ultraviolet absorption.It showed that the recovery rate of shortDNA fragments in water-bath method was higher than boiling method.Water-bath method combined withethanol precipitation for extracted short DNA fragments had many advantages,such as economical andconvenient which should be advocated to use widespread.Key words:nondenaturing polyacrylamide gel;short DNA fragments;recovery;purification中国农学通报http:/实用方法尤为重要。本试验在前人的研究基础上，对比了两种从非变性PAGE胶中回收和纯化目标DNA（51 bp）的简易方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料 pBluescript II SK(+)PPRE vector，PPRE是一段合成的长51 bp的DNA片段，其中5端含KpnI酶切位点，3端含XhoI酶切位点。1.1.2 试剂 Fast Digest KpnI(Fermentas)；Fast DigestXhoI(Fermentas)；10Fast Digest Buffer(Fermentas)；双蒸水；丙烯酰胺；N,N-亚甲基双丙烯酰胺；过硫酸铵；10TBE；1TBE；TEMED；Loading Buffer（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰，40%蔗糖水溶液）；20 bp DNALadder Marker(TaKaRa)；无水乙醇：用前冰上预冷；乙酸钠：3 mol/L，pH 5.2，用前冰上预冷。1.2 试验方法1.2.1 目的 DNA 的获取 pBluescript II SK(+)PPREvector用Fast Digest KpnI和Fast Digest XhoI双酶切后得到目的片段PPRE（51 bp）。采用20 L Fermentas酶切反应体系，于37水浴酶切反应30 min，非变性聚丙烯酰胺凝胶检测(如图1)。1.2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 12%非变性PAGE胶的制备参照文献8，但未加变性剂尿素。1.2.3 PAGE胶电泳 待PAGE胶聚合后，将玻璃板安装在电泳仪上，于电泳槽中加入足量的1TBE 缓冲液，拔出梳子。电泳之前，在 DNA 样品中加入等体积Loading Buffer 并充分混合，取 8 L 上样。以 20 bpDNA Ladder Marker 作为分子量标准。上样后，于120 V恒电压电泳至第二条loading Buffer带至胶板的2/3处。此过程在冰上进行，以获得较好的电泳效果。1.2.4 溴化乙锭染色 将凝胶轻轻浸入0.5 g/mL的溴化乙锭中，使染液正好将凝胶全部浸没。室温染色30 min后，将凝胶取出，紫外检测。1.2.5 从PAGE胶中回收DNA片段 在凝胶尚未完全干燥时用洁净的手术刀片切取欲回收的DNA条带（所切 的 DNA 条 带 尽 可 能 少 带 凝 胶），放 入 1.5 mLEppendorf管内，加100 L双蒸水洗涤，离心并吸弃双蒸水，保留凝胶用于下一步的回收。以下是两种进一步回收DNA的方法。（1）煮沸法：向保留有凝胶的Eppendorf管中加入100 L 双蒸水，用枪头尖将凝胶碾碎，100煮沸15 min。以12000 rpm离心5 min后，将上清液（DNA粗回收液）移至一新的Eppendorf管中9。（2）水浴法：向另一保留有凝胶的Eppendorf管中加入100 L双蒸水，用枪头尖将凝胶碾碎，37水浴12 h。以12000 rpm离心5 min后，将上清液（DNA粗回收液）移至一新的Eppendorf管中10。1.2.6 DNA的纯化 于上清液（DNA粗回收液）中加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/l0体积3 mol/L的醋酸钠（pH 5.2），-20放置1 h；4，12000 rpm离心20 min，吸弃上清；用75%乙醇洗涤沉淀2次；4，12000 rpm离心2 min，吸弃上清；待乙醇挥发干净后，用双蒸水溶解沉淀11。非变性聚丙烯酰胺凝胶检测（如图2）。1.2.7 PAGE 胶电泳检测目的 DNA 将纯化回收的DNA 样品加入等体积 Loading Buffer 充分混合，取8 L上样。以20 bp DNA Ladder Marker作为分子量标准。上样后，于120 V恒电压电泳至第二条loadingBuffer 带至胶板的 2/3 处。用 0.5 g/mL 溴化乙锭染色，紫外检测。2 结果与分析2.1 目的DNA的获取从图1可看出，pBluescript II SK(+)PPRE vector用Fast Digest KpnI和Fast Digest XhoI双酶切后得到了目的片段PPRE（51 bp），表明此次双酶切反应成功，验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶检测小片段DNA的可行性；此次双酶切反应运用了Fermentas 公司的快酶，即Fast Digest KpnI和Fast Digest XhoI，反应时间大大缩短，省时省力，进一步验证了快酶的可行性；1号和2M12500bp200bp100bp80bp60bp40bp20bpM：20 bp DNALadder Marker；1：双酶切后的产物；2：双酶切后的产物图1 pBluescript II SK(+)PPRE vector双酶切后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 228章 蕾等：从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较号泳道中是同一样品，即pBluescript II SK(+)PPREvector用Fast Digest KpnI和Fast Digest XhoI双酶切后的产物，两个泳道中条带位置和亮度基本一致；1号和2 号 泳 道 点 样 孔 处 均 有 一 条 较 亮 的 条 带，这 是pBluescript II SK(+)PPRE vector 经 Fast DigestKpnI 和 Fast Digest XhoI 双酶切后余下的条带，约为2900 bp。2.2 两种回收DNA方法的比较从图2可看出，煮沸法和水浴法的回收产物经乙醇沉淀纯化后，均获得了预期大小（51 bp左右）的目的片段（PPRE）。这进一步验证了煮沸法和水浴法回收DNA小片段的可行性；1号和2号泳道中均没有出现杂带，这说明经乙醇沉淀纯化处理的回收产物在纯度上已经可以用于后续试验，进一步验证了用聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA的纯度较高；2号泳道目的条带（PPRE）的亮度明显高于1号泳道，这说明水浴法回收DNA 小片段的回收率高于煮沸法，可以广泛用于DNA小片段的回收。3 结论与讨论近年关于 DNA 回收和纯化的简易方法报道较多12-16，但这些方法大都针对基于琼脂糖凝胶的回收和纯化，而从非变性PAGE胶中回收和纯化DNA的报道极少。从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA在基因工程实验中具有承上启下的作用，回收的成功率相当重要，而短片段DNA的回收较为困难，至今还没有十分完善的方法。无论是采用哪种方法都有其缺点，有的价格昂贵，有的操作繁琐，有的回收率非常低，有的则兼而有之。本试验采用煮沸法和水浴法（直接洗脱法）回收DNA小片段，均得到了目的条带，验证了直接洗脱结合乙醇沉淀纯化处理的聚丙烯酰胺凝胶回收方法回收DNA小片段的可行性。而且这两种回收方法操作简便，省时省力，无需特殊设备，经济消耗少。通过试验验证：水浴法的回收率更高，建议使用。沉淀是浓缩核酸最常用的方法，大分子量核酸样品的沉淀方法很多，操作简单，效果比较好。而小分子量DNA（特别是50 bp的寡聚核苷酸）的沉淀方法往往依赖于高速或超速冷冻离心机，且操作步骤繁锁，一般实验室难以满足实验条件。本试验在DNA纯化这一步采用了最常用的乙醇沉淀法17，得到的DNA纯度较高，无杂带，浓度易控制，经济简单。从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA时要注意如下几点：（1）在凝胶尚未完全干燥时时切胶；刀片一定要干净，不要沾染其他DNA；所切条带要尽量细，以保证所含DNA分子为同一分子的纯度。（2）从聚丙烯酰胺凝胶上切取的DNA要用去离子水洗涤，以去除表面的杂质。（3）煮沸虽然可以促进DNA分子的释放，但持续高温会破坏DNA分子，不要超过20 min。（4）用于纯化回收的无水乙醇、醋酸钠和75%的乙醇都提前预冷。待乙醇挥发干净后（以免干扰后续试验），再用双蒸水或TE溶解沉淀。（5）需长期保存的DNA样品用TE保存。总之，水浴法结合乙醇沉淀纯化处理的聚丙烯酰胺凝胶回收方法虽然相对于价格昂贵的进口胶回收试剂盒来说，它的回收率可能稍低一些，但是它是一种非常经济简单的方法，能够被绝大多数实验室所采用。参考文献1J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆（第二版）M.北京:科学出版社,1992:325-326.2Cama M I C S,Leite R P(Jr),Cordeiro A R,et al.TransgenicsweetpotatoplantsobtainedbyAgrobacteriumtumefaciens-mediated 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229中国农学通报http:/5王宏,李春海,陈高明,等.mRNA差异显示技术中差异条带的回收与再扩增J.中国肿瘤临床,1999,26(5):350-351.6李拥军,敖红,孙桂金.mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较J.生物技术,2005,15(3):43-44.7李卫东,孟祥文,李伟,等.一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶回收、克隆DNA的方法J.中华医学遗传学杂志,1997,14:380-381.8黄建安.茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究D.湖南长沙:湖南农业大学,2004.65.9陈亮明,张冬林,李志辉,等.PAGE银染和条带回收方法的改进J.中南林业科技大学学报,2007,27(6):163-165.10J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆（第二版）M.北京:科学出版社,1992:332-333.11罗立廷,王珏,姚琴,等.一种有效回收短片段PCR产物的方法J.生物技术,2006,16(3):47-48.12蒋安,梁慧,陈旭,等.回收琼脂糖凝胶中DNA的简便方法J.生物技术通报,2006,(2):102-103.13庄飞云,茅淑敏,娄群峰,等.简便实用的琼脂糖凝胶回收DNA片段方法J.生物技术通讯,2003,14(3):202-203.14张亮,赵晓瑜,康现江,等.一种有效回收小分子DNA片段的方法J.生物技术通报,2007,(1):99-100.15罗立廷,王珏,姚琴,等.一种有效回收短片段PCR产物的方法J.生物技术,2006,16(3):47-48.16朱晓峰,安小平,陈锦辉,等.一种简便、高效、经济的从凝胶中回收DNA的方法J.生物技术通讯,2006,17(4):603-604.17高传军,金春钰,李卓.从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA方法的研究进展J.中国科技论文在线,2005,1-5.230