血浆游离DNA含量和完整性.态变化在食管癌中的临床价值_马春芳.pdf

目的 探讨食管癌病人血浆游离DNA（cf-DNA）的含量和完整性（以cf-DNA长片段ALU247与短片段ALU115含量的比值表示）在食管癌诊治中的临床意义。方法 选择2020年6月至2022年5月苏州市第九人民医院收治的50例食管癌病人、50例食管良性肿瘤病人、50例健康对照者为前瞻性研究的研究对象，分别纳入食管癌组、食管良性病变组以及健康对照组，用微量血液基因组提取试剂盒（Qiagen）提取血浆cf-DNA，并以实时荧光定量PCR法检测cf-DNA含量，收集其中25例食管癌病人术后血浆并检测 cf-DNA 含量，动态监测 cf-DNA 在术前术后的变化。检测食管癌病人糖类抗原 199（CA199）、癌胚抗原（CEA）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）含量，比较cf-DNA和肿瘤标志物在食管癌中的诊断价值。结果 食管癌组、良性病变组、健康对照组术前食管癌血浆 ALU115含量 4.30（2.06，8.36）g/L，1.98（1.38，3.02）g/L，1.63（0.87，2.66）g/L；ALU247含量1.40（0.91，4.10）g/L，0.63（0.37，1.27）g/L，0.26（0.15，0.43）g/L；cf-DNA 完整性 0.41（0.29，0.69），0.33（0.25，0.50），0.18（0.11，0.28）（均P0.05）；ALU115 术前4.41（2.04，8.87）g/L，术后1.05（0.66，1.75）g/L 以及完整性 术前0.49（0.27，0.77），术后0.30（0.17，0.37）在术前术后相比差异有统计学意义（P0.05）；在食管癌分期、分化程度、是否有远处转移上血浆cf-DNA差异有统计学意义（P0.05）；相比传统肿瘤标志物，血浆cf-DNA的诊断效能更高，当ALU247含量取0.65 g/L时，受试者操作特征（ROC）曲线下面积最大，为0.95。结论 血浆cf-DNA检测在食管癌诊治、预后中有一定的临床价值。关键词：食管肿瘤；血浆游离DNA；糖类抗原199（CA199）；癌胚抗原（CEA）；鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）Clinical value of dynamic changes of plasma cell free DNA content and integrity in esophageal carcinomaMA Chunfang,LI Xiangxiang,YANG HonglinAuthor Affiliation:Laboratory Department of Suzhou Ninth Peoples Hospital,Suzhou,Jiangsu 215000,ChinaAbstract：Objective To investigate the clinical significance of plasma cell free DNA(cf-DNA)content and integrity in the diagnosis and treatment of esophageal cancer.Methods Fifty patients with esophageal cancer,50 patients with benign esophageal tumors,and 50 healthy controls admitted to the Suzhou Ninth Peoples Hospital from June 2020 to May 2022 were selected as study subjects for the prospective study,and were included in the esophageal cancer group,the group with benign esophageal lesions,and the control group,respectively.A micro blood genome extraction kit(Qiagen)was used to extract cf-DNA,and real-time fluorescence quantitative PCR was utilized to evaluate the plasma cf-DNA content.The postoperative plasma of 25 esophageal cancer patients was collected,and the cf-DNA content was quantified,as well as the variations in cf-DNA before and after surgery,which were dynamically identified.At the same time,the levels of tumor markers carbohydrate antigen 199(CA199),carcinoembryonic antigen(CEA)and squamous cell carcinoma antigen(SCC)were also examined in patients with esophageal cancer to compare the difference between the diagnostic significance of cf-DNA and tumor markers in esophageal cancer.Results Preoperative plasma ALU115 content in esophageal cancer 4.30(2.06,8.36)g/L,1.98(1.38,3.02)g/L,1.63(0.87,2.66)g/L;ALU247 content 1.40(0.91,4.10)g/L,0.63(0.37,1.27)g/L,and 0.26(0.15,0.43)g/L;and free DNA integrity 0.41(0.29,0.69),0.33(0.25,0.50),0.18(0.11,0.28)in the esophageal cancer group,benign lesion group and healthy control group,showed statistically significant differences among the three groups(P0.05);The difference in ALU115 preoperative 4.41(2.04,8.87)g/L,postoperative 1.05(0.66,1.75)g/L as well as integrity preoperative 0.49(0.27,0.77),postoperative 0.30(0.17,0.37)was statistically significant when compared before and after surgery(P0.05);Additionally,there were statistical differences in plasma cf-DNA according to the stage,level of differentiation,and existence of distant metastases in esophageal cancer(P 0.05).Compared with the conventional tumor markers,the diagnostic accuracy of plasma cf-DNA was greater,and the area under the ROC curve was the maximum at 0.95 when the ALU247 level was taken as 0.65g/L.Conclusion Testing for plasma 临床医学引用本文：马春芳，李翔翔，杨鸿林.血浆游离DNA含量和完整性的动态变化在食管癌中的临床价值 J.安徽医药，2023，27（10）：1986-1990.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.10.017.1986网络首发时间：2023-09-05 14:57:56网络首发地址：https:/ 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Oct，27（10）cf-DNA has certain clinical value for the diagnosis and therapy of esophageal cancer.Key words：Esophageal Neoplasms;Plasma cell free DNA;Carbohydrate antigen 199(CA199);Carcinoembryonic antigen(CEA);Squamous cell carcinoma antigen(SCC)食管癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，每年我国新发病例占全球的50以上。由于食管癌早期症状并不明显、加上内镜检查也不容易耐受，所以一般初诊都在预后较差的中晚期。因此，寻找简单、高效、无创的肿瘤指标对食管癌的辅助诊治至关重要。血液中的游离DNA（cf-DNA）是游离于细胞外的一种DNA，是目前研究的热点。某种程度上看，cf-DNA水平的变化和性质的改变能够反映原发肿瘤的特点1，为肿瘤的研究提供了更为便捷的方法。本次临床前瞻性研究即检测并探讨血浆cf-DNA在食管癌辅助诊断和预后中的临床意义。1资料与方法1.1一般资料选择2020年6月至2022年5月苏州市第九人民医院收治的50例食管癌病人、50例食管良性肿瘤病人、50例健康对照者为研究对象，分别纳入食管癌组、食管良性病变组以及健康对照组。食管癌中男 18 例，女 32 例。年龄范围 3585岁，中位年龄 65 岁。按 UICC/AJCC 2017 年第八版食管癌 TNM 分期标准分期，其中 0期 3例、期 13例、期10例、期14例、期10例。食管良性病变组中男19例，女31例，年龄范围3685岁，中位年龄64岁。对照组中男18例，女32例，年龄范围3582岁，中位年龄66岁。纳入标准：内窥镜下活检诊断为食管癌；临床资料完整；均接受食管癌根治术治疗。排除标准：患有其他恶性肿瘤；患有慢性病、传染病等其他疾病；继发性食管癌或复发病。本研究经苏州市第九人民医院伦理委员会审核批准（批号KY2022-042-01），病人或其近亲属知情同意。1.2血浆cf-DNA的收集和提取收集：取初次入院食管癌病人 EDTA 抗凝血 5 mL，1 600 g 离心 10 min；取上清4、2 850 g离心10 min，置于80 冰箱中备用。提取：按QIACube DNA试剂盒（同一批号）提取DNA，提取分装后置80 冰箱保存。1.3标准品的制备以及引物的设计和合成提取人基因组DNA作为标准品，由紫外分光光度测定仪测定其原始浓度，倍比稀释至 0.04、0.4、4、40、400 g/L。实 验 所 采 用 的 两 对 引 物（ALU115 和ALU2472）相关信息见表1。1.4荧光定量PCR的体系及反应条件参照Real Master Mix（SYBR Green）说明书，采用 SYBR Green方法进行荧光定量 PCR，反应条件：94 预变性 1 min；94、30 s，62、20 s，72、30 s，共 45 次循环。见表2。荧光定量PCR仪（罗氏Light Cycler 480）上扩增提取的DNA，质粒标准品，阴性对照（双蒸水），同时建立阳性对照和空白对照。由罗氏PCR仪自带分析软件得出荧光阈值Ct值，建立标准浓度曲线。cf-DNA浓度根据标准曲线定量分析测得。同时熔解曲线无杂峰，保证了目的产物的纯度。样本结果取两复孔检测的均值。1.5统计学方法用 SPSS 19.0进行数据分析，表示方法取中位数和四分位数间距（入选数据均不符合正态分布）。分别采用 Mann-Whitney U 检验和Kruskal-Wallis H 检验进行两组数据和多组数据之间的比较。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1标准曲线的建立成功构建浓度梯度的-actin 质粒标准品的扩增曲线。回归方程：Y=3.226 logX+18.79，R2=0.991，扩增效率E=1.021。2.2食管癌、食管良性病变、对照组血浆cf-DNA比较总体比较，ALU115、ALU247、完整性在三组之间比较差异有统计学意义（P0.001），见表3。2.3血浆cf-DNA在食管癌中的动态变化收集其中25例食管癌病人根治手术术后3 d的血浆进行检测，显示ALU115以及完整性在食管癌病人术前术后之间的差异有统计学意义（P0.05），见表4。2.4血浆cf-DNA在入选食管癌临床病理参数之间的分布结果表明，ALU115、ALU247在食管癌有无远处转移上差异有统计学意义（P0.05）；完整性在表1ALU基因引物序列引物ALU115ALU247长度/bp115247引物序列正向5-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3反向5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3正向5-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3反向5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3表2荧光定量PCR反应体系反应体系1SYBR Green Real Master Mix200 nmol/L正向引物200 nmol/L反向引物双蒸水DNA模板总体积体积/L91172201987安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Oct，27（10）食管癌分化程度、分期上差异有统计学意义（P0.05）。见表5。2.5cf-DNA、肿瘤标志物在食管癌中的诊断效能对比对食管癌组血清及健康对照组血清中相关肿 瘤 标 志 物 糖 类 抗 原 199（CA199）、癌 胚 抗 原（CEA）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）的含量进行采集检测。整体分析，AUC曲线下面积以ALU247最大，为0.95；ALU247取0.65 g/L时，灵敏度0.84，特异度0.96。相应各指标的灵敏度、特异度见表6。3讨论1948年首次在人体外周血中发现游离核酸，然而很长一段时间以来，它的意义和重要性都不为人们所重视和研究。直至近年来，越来越多的研究投入到游离核酸和循环肿瘤细胞3-5等领域，关于其和自身免疫病，恶性肿瘤等疾病的相关性也得到了越来越广泛的探讨。其中游离核酸的研究主要聚焦于定量和表观遗传学的改变，包括 cf-DNA 的完整性、微卫星不稳定性、杂合性丢失（LOH）、甲基化以及基因突变等6-9。在外周血游离脱氧核糖核酸定量方面，不同的研究采用了包括-actin10、GAPDH11等管家基因在表4食管癌25例根治术前后cf-DNA比较组别术前术后U值P值ALU115/（g/L）4.41（2.04，8.87）1.05（0.66，1.75）3.400.001ALU247/（g/L）1.41（0.91，4.54）0.23（0.12，0.55）1.380.168ALU247/ALU1150.49（0.27，0.77）0.30（0.17，0.37）5.950.001注：ALU115 为 115bp ALU 序列 cf-DNA 含量，ALU247 为 247bp ALU序列游离DNA含量，ALU247/ALU115为游离DNA的完整性。表3食管癌、食管良性病变与健康对照组的ALU115、ALU247、ALU247/ALU115比较/M（P25，P75）分组健康 对照组良性病变食管癌H值P值例数505050ALU115/（g/L）1.63（0.87，2.66）1.98（1.38，3.02）4.30（2.06，8.36）32.340.001ALU247/（g/L）0.26（0.15，0.43）0.63（0.37，1.27）1.40（0.91，4.10）68.560.001ALU247/ALU1150.18（0.11，0.28）0.33（0.25，0.50）0.41（0.29，0.69）34.970.001注：ALU115为115bp ALU序列游离DNA含量，ALU247为247bp ALU序列游离DNA含量，ALU247/ALU115为游离DNA的完整性。与健康对照组比较，P0.05。与良性病变组比较，P65岁性别 女 男吸烟史 无 有高血压 无 有分化程度 中-高 低临床分期 0+远处转移 无 有肿瘤部位 胸上段 胸中段 胸下段占比/例（%）23（46）27（54）32（64）18（36）40（80）10（20）30（60）20（40）19（38）31（62）16（32）34（68）44（88）6（12）25（50）12（24）13（26）ALU115/（g/L）4.08（1.65，7.81）5.02（2.58，9.55）4.30（1.97，7.56）4.81（2.33，10.30）4.81（1.97，8.41）3.34（2.37，7.89）5.26（1.58，8.96）4.30（2.36，6.07）4.26（1.80，7.54）5.20（2.13，9.00）3.12（1.57，9.00）4.53（2.69，8.37）4.17（1.91，7.89）11.85（3.53，22.08）4.35（1.84，8.41）4.22（2.22，7.46）4.91（2.86，10.40）U（H），P值0.89，0.3711.62，0.1050.13，0.8950.07，0.9440.77，0.4401.00，0.3181.94，0.009（0.33），0.847ALU247/（g/L）1.20（0.74，3.55）1.60（1.20，4.35）1.41（0.89，4.41）1.91（0.82，2.96）1.41（0.89，4.11）1.70（0.85，6.00）1.81（0.81，6.04）1.32（0.91，2.06）1.31（0.74，1.98）1.90（0.89，5.29）1.21（0.59，3.54）1.51（1.09，4.70）1.31（0.72，2.95）3.72（2.22，12.86）1.42（0.89，4.41）1.31（0.80，4.71）1.91（1.14，4.68）U，P值0.67，0.5061.25，0.2110.45，0.6531.48，0.1391.55，0.1121.41，0.1572.30，0.0020.40，0.819完整性0.47（0.30，0.69）0.36（0.26，0.70）0.43（0.29，0.69）0.36（0.24，0.76）0.39（0.28，0.69）0.42（0.31，0.70）0.54（0.32，0.80）0.30（0.21，0.48）0.37（0.29，0.55）0.49（0.28，0.84）0.38（0.28，0.58）0.47（0.28，0.77）0.41（0.28，0.66）0.42（0.50，0.80）0.47（0.28，0.73）0.38（0.26，0.71）0.40（0.29，0.58）U（H），P值0.12，0.9010.55，0.5800.29，0.7712.69，0.1071.50，0.0121.00，0.0230.51，0.501（0.30），0.861注：ALU115为115bp ALU序列游离DNA含量，ALU247为247bp ALU序列游离DNA含量。1988安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Oct，27（10）内的不同内参基因，管家基因的稳定存在与表达决定了其可用于脱氧核糖核酸定量，但不同基因拷贝量的差异也决定了其结果的差异。由于相对于编码基因而言，其甲基化程度较低，受到的冲击较小，近年来更多研究倾向于采用非编码DNA，如ALU等重复序列12。这项研究就是采用食管癌病人血浆cf-DNA做ALU基因定量以及完整性的研究。目前的研究主要认为，生物体细胞坏死或凋亡是生物释放进入循环系统的核酸来源之一。Choi等13研究证明在细胞体外培养实验中不伴巨噬细胞存在时坏死细胞不产生游离DNA，当存在巨噬细胞时，cf-DNA大量出现。近年来也有研究认为，循环系统中的肿瘤细胞也可释放循环游离核酸进入循环系统，成为cf-DNA的来源之一14。正常细胞凋亡所产生的cf-DNA片段较小，约为100 bp，而细胞坏死所产生的DNA片段较大，故肿瘤细胞坏死所产生的长片段cf-DNA在机体发生恶性肿瘤等疾病状态下含量相对较高，这为研究完整性提供了理论依据15。因此本研究采用了115 bp的ALU115和247 bp的ALU247基因片段，统计结果表明，食管癌病人cf-DNA的含量均高于健康对照组，同时食管癌病人完整性高于对照组，原来可能是癌症导致肿瘤细胞以及正常细胞的坏死较多，外周血中长片段的 cf-DNA含量也相应较高，这与Chen等12在乳腺癌，Fan等13在肺癌中的研究相符。血浆cf-DNA在食管癌临床病理参数之间的分析结果表明，ALU115、ALU247在食管癌有无远处转移上差异有统计学意义（P0.05）；完整性（ALU247/ALU115）在食管癌分化程度和分期上差异有统计学意义（P0.05）。提示食道癌的远处转移可以用cf-DNA含量来作为监测指标。同时，低分化食管癌病人的完整性也高于中-高分化食管癌病人，这表明血浆cf-DNA可以作为评价体内肿瘤负荷状态的指标，反映肿瘤的侵袭性和流行性。本研究还收集了部分病人术后3 d天之内的血浆做定量分析，结果表明，术后ALU115和完整性的含量均较术前降低，差异有统计学意义（P0.05）。原因可能是癌症病灶的切除大大降低了肿瘤细胞释放 DNA入血，因此长期监测病人术后 cf-DNA的含量可能有助于病人术后恢复情况的评估。本研究同时也选取了CEA、CA199以及SCC等广谱的肿瘤标志物，并比较其和cf-DNA对食管癌的诊断效能。结果表明，ALU115、ALU247以及完整性的 ROC 曲线下面积大于 CEA、CA199 和 SCC，差异有统计学意义（P0.05）。其中，ROC曲线下面积最高的是 ALU247。大量研究表明，单一的肿瘤标志物对癌症的诊断价值并不高16-19，相反其在恶性肿瘤的预后中有较高的价值。因此，将其与cf-DNA定量的指标结合起来，不仅可以在肿瘤的诊断中使用，而且在肿瘤的预后中也会有一定的价值。诊断食管癌的金标准还是病理活检，外周血cf-DNA检测仅仅能作为癌症诊治和动态监测的辅助观察指标。其对食管癌的临床意义还需更多的试验和探讨，包括样本量的增加，试验条件和方法的标准化等。现阶段对早期肿瘤的发现和诊断仍是一大障碍，因此循环cf-DNA以至循环肿瘤细胞等值得更加深入与广泛地研究。参考文献1 YUAN ZY，WANG XF，GENG X，et al.Liquid biopsy for esophageal cancer：is detection of circulating cell-free DNA as a biomarker feasible？J.Cancer Commun（Lond），2021，41（1）：3-15.2 ELZEHERY R，EFFAT N，FARAHATY REL，et al.Circulating cell-free DNA and DNA integrity as molecular diagnostic tools in hepatocellular carcinoma J.Am J Clin Pathol，2022，158（2）：254-262.3 YAN S，GUO W，LIU Y，et al.The role of folate receptor-positive circulating tumor cell analysis in the diagnosis of colorectal cancer：a retrospective cohort studyJ.International Journal of Clinical 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选取2020年7月至2021年7月西安市人民医院收治的2型糖尿病病人123例（123只眼）进行回顾性研究，根据是否发生糖尿病视网膜病变（DR）将病人分为：2型糖尿病非视网膜病变（NDR）组（50只眼）和非增生性糖尿病视网膜病变（NPDR）组（73只眼），此外选取58例（58只眼）正常眼（于该院进行健康体检）作为对照组。收集研究对象一般资料，包括年龄、性别、身体质量指数（BMI）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP），并进行比较；采用酶联免疫（ELISA）法检测血浆胰岛素水平；应用光学相干断层扫描血管成像（OCTA）观察cpVD和RNFL厚度；受试者操作特征（ROC）曲线评价cpVD与RNFL厚度对DR发生的预测价值。通过logistic回归分析DR发生的影响因素。结果 与对照组比较，NDR组和NPDR组病人RNFL厚度显著变薄 （96.6610.47）比（81.759.59）、（90.5610.33）m，cpVD显著降低，胰岛素水平显著降低（均P0.05）；与NPDR组相比，NDR组病人糖尿病病程及BMI、SBP、DBP水平均升高（P0.05）；NDR组和NPDR组病人血浆胰岛素水平与cpVD呈正相关（r=0.26，P0.05），与RNFL厚度呈正相关（r=0.24，P0.05），cpVD与RNFL厚度呈正相关（r=0.30，P0.05）；NDR组和NPDR组病人cpVD、RNFL厚度与糖尿病病程、BMI、SBP、DBP均呈负相关（P0.05）；logistic回归分析显示胰岛素水平、糖尿病病程是影响DR发生的因素（P0.05）；ROC结果显示，胰岛素、cpVD与RNFL厚度NPDR 发生的曲线下面积（AUC）及 95%CI 分别为 0.71（0.62，0.79）、0.62（0.53，0.71）、0.86（0.78，0.79），对应的灵敏度分别为83.56%、80.00%、88.00%，特异度分别为56.00%、41.10%、71.23%。三者联合NPDR发生的AUC 95%CI为0.89（0.83，0.94），灵敏度为87.67%，特异度为80.00%。结论 2型糖尿病病人血浆胰岛素水平与cpVD和RNFL厚度均呈正相关。血浆胰岛素水平可能作为预测视网膜功能的早期指标，RNFL厚度以及cpVD可作为诊断DR的指标。关键词：糖尿病视网膜病变；视盘周围血管密度；视网膜神经纤维层；胰岛素水平；因果律临床医学1990