液质联用技术在生物毒素检测中的应用_27页.pdf

液质联用技术在生物毒素检测中的应用液质联用技术在生物毒素检测中的应用浙江省疾病预防控制中心任一平浙江省疾病预防控制中心任一平生物毒素检测方法的趋势生物毒素检测方法的趋势前处理简单前处理简单低成本低成本高通量高通量高灵敏度高灵敏度高选择性高选择性高效率高效率提供分子结构信息提供分子结构信息什么样的仪器设备才能达到上述要求？只有什么样的仪器设备才能达到上述要求？只有质谱质谱！通用型的选择性检测器。提供分子结构信息，可以得到确证结果。SIM、MRM都具有高灵敏度。抗干扰能力强。色谱分离已经不是最主要问题。质谱仪的类型和离子化的方式质谱仪的类型和离子化的方式 质谱的类型：MS、MS/MS、MSn、TOF、Q-TOF、SECTOR、FT-ICR-MS等。离子化方式：EI、NCI、PCI、APCI、ESI、APPI（大气压光质解析电离源）、MALDI（基值辅助激光解析离子化）。可以与GC、LC、IC、CE等联接。用于多残留检测的主要有GC-MS、GC-MS/MS、GC-MSn、LC-MS/MS、GC（LC）-TOF。单四极质谱单四极质谱 离子通过改变四极杆的DC/RF电压而被扫描DC/RF为一个常量DC/RF为一个常量离子阱质谱离子阱质谱原理与四极杆的非常相似,离子被存储在RF和DC场中,扫描出精确m/z的离子,可以做多极质谱，称为时间串联质谱。飞行时间质谱飞行时间质谱?所有离子同时启动所有离子同时启动?小的离子移动速度快小的离子移动速度快?测量已知距离下的速度测量已知距离下的速度(飞行时间飞行时间)磁质谱 SECTOR磁质谱 SECTOR离子通过变化的磁场和电场被传输主要用于Dioxins,PCB,PBB,PBDE等检测?未知化合物未知化合物?化合物的鉴定与确认化合物的鉴定与确认?谱图检索谱图检索?已知化合物已知化合物?高效、高灵敏度分析高效、高灵敏度分析结构确认结构确认定量定量?分子量信息分子量信息用质谱检测的目的是什么?电子轰击源，化学源电子轰击源，化学源70ev的轰击能量，硬电离方式，可以进行谱库检索化学源是在离子源中加入缓冲气，达到软电离的目的大气压电喷雾源大气压电喷雾源大气压化学电离源大气压化学电离源串接四极质谱仪串接四极质谱仪碰撞诱导解离室（碰撞池 CID）碰撞诱导解离室（碰撞池 CID）三级四极杆工作模式(一)三级四极杆工作模式(一)?MS模式这种模式用于分析未解离的离子质量。扫描M1、CID中没有引入裂解气体,M2为射频电场模式。也可以使M1处于射频模式,扫描M2电场实现质量测定MS扫描采集 MS Ion ScanMS扫描采集 MS Ion ScanMS1MS2CollisionCellScanningRf only,pass all masses在第一个四极杆做选择范围的在第一个四极杆做选择范围的Scanning Scanning。碰撞室和第二个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。碰撞室和第二个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。在第一个四极杆做选择范围的在第一个四极杆做选择范围的Scanning Scanning。碰撞室和第二个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。碰撞室和第二个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。三级四极杆工作模式(二)三级四极杆工作模式(二)前体离子(母离子)扫描(precursor/parent ion scanning)此模式是:扫描 M1电压，M2设定为只传输某一特定质荷比离子，CID为碰撞室。与中性丢失扫描相似，前体离子扫描检测离子混合物中在CID碰撞室丢失特定基团的离子。与中性丢失扫描不同的是前体离子扫描模式直接检测断裂的基因(报告离子,reporter ion)。检测器检测到报告离子时,已知M1的电压,所以可以确定产生这一特定碎片的前体离子的质量。因此前体离子扫描模式可以被用来检测肽混合物中某些含有特定结构特征的肽段。Monitor specific fragment ion母离子扫描母离子扫描MS1CollisionCellMS2StaticCIDScanning三级四极杆工作模式(三)三级四极杆工作模式(三)MS/MS模式(也称为子离子扫描法,product ion scan)在一个给定的时间点,1设定为仅传输某一选定质荷比的离子,此离子进入CID后,经碰撞诱导解离,产生的碎片离子通过扫描M2进行检测。这样得到与M1选择的初始离子相关的碎片离子质谱图。M1选择母离子,在CID内进行诱导碰撞，M2分析碎片离子,这一分析过程不断循环,用以选择分析不同质量的离子。实际上,可以设定程序自动在MS和MS/MS模式间切换,将MS检测到的离子进行CID分析,并记录 碎片离子的谱图,整个过程不需要用户介入这一过程称为数据依赖的CID(data-deperkdent CID)子离子扫描子离子扫描Product Ion Scansto produce MS-MS spectrafor confirmation and structural elucidationCollCellisionMS2ScanningStaticMS1三级四极杆工作模式(四)三级四极杆工作模式(四)中性丢失扫描模式(neutral loss scan mode)此模式中Q1和Q3的电压同步扫描,但保持一个特定m/z值的电压差(off set)。Q2是碰撞室，Q1和Q3的电压差值与Q2内碰撞消除的一个特定中性分子的质量一致。因此，在离子混合物中，只有碰撞裂解后能丢失这一特定基团的离子才会被Q3传输到检测器。中性丢失中性丢失Neutral Loss/Gainto monitor loss or gain of specific moietyNeutral Loss/Gainto monitor loss or gain of specific moietyMS1CollisionCellMS2ScanningCIDScanning三重四极 MS/MS MRM检测方式(五)三重四极 MS/MS MRM检测方式(五)MS1CollisionCellMS2StaticCIDStatic多离子反应监测多离子反应监测 Multiple Reaction Monitoring(MRM)minimises matrix interferencehigh sensitivityaccurate and reproducible quantitation例一质谱测定:例一质谱测定:ProgesteroneProgesterone孕酮孕酮200220240260280300320340360380400m/z0100%315.1316.1M+H+OOCH3CH3CH3全扫描全扫描(M/Z200-400)MS1MS2CollisionCellStatic(m/z 315.1)Scanning子离子扫描Product Ion Scan子离子扫描Product Ion Scan第一个四极杆让固定第一个四极杆让固定StaticStatic荷/质比的母离子通过，而第二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描荷/质比的母离子通过，而第二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描ScanningScanning。第一个四极杆让固定第一个四极杆让固定StaticStatic荷/质比的母离子通过，而第二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描荷/质比的母离子通过，而第二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描ScanningScanning。Argon gasArgon gasPrecursorPrecursorProductsProducts六极杆碰撞室六极杆碰撞室氩气氩气 在碰撞室里，离子的动能转换成内能。碰撞条件(断裂)可通过控制加以改变：碰撞能量(离子进入碰撞室的速度)碰撞的的机遇(碰撞气的压力)OCH3CH3CH3O母离子母离子OCH2CH2H3CCH3OCH3子离子子离子孕酮的子离子产物孕酮的子离子产物300305310315320325330m/z0100%315.1316.1Mass Spectrum from MS1100125150175200225250275300325m/z0100%109.097.0Product ion spectrum from MS2多离子反应检测(MRM)多离子反应检测(MRM)第一和第二四极杆质量分析器均固定质量/电菏比Static第一四极杆只让母离子通过，第二四极杆让子离子通过。第一和第二四极杆质量分析器均固定质量/电菏比Static第一四极杆只让母离子通过，第二四极杆让子离子通过。MS1MS2CollisionCellStatic(m/z 315.1)Static(m/z 109.0)Argon gasArgon gasPrecursor(s)Precursor(s)Product(s)Product(s)MRM 子离子检测图孕酮MRM 子离子检测图孕酮0.501.001.502.002.503.003.50Time0100%2.751ng/mLProgesteronem/z 315.1 109.0m/z 315.1 109.0欧盟2003/181/EC 法规欧盟2003/181/EC 法规根据欧盟规定，动物用药分为两类：Group A 为禁用为药物(Banned Drugs)為不得检出且完全禁止使用，法規对于这类药物的检验方法有：根据欧盟规定，动物用药分为两类：Group A 为禁用为药物(Banned Drugs)為不得检出且完全禁止使用，法規对于这类药物的检验方法有：最低检出极限要求(Minimum Required Performance Limit，MRPL)最低检出极限要求(Minimum Required Performance Limit，MRPL)如：硝基呋喃、氯霉素、孔雀绿、兴奋剂等Group B 为合法可使用的兽药(Legal Medicine)对 于 不 同 的 药 物 规 定 有 不 同 的如：硝基呋喃、氯霉素、孔雀绿、兴奋剂等Group B 为合法可使用的兽药(Legal Medicine)对 于 不 同 的 药 物 规 定 有 不 同 的 最 大 允 許 殘 留 量(Maximum ResidueLimit，MRL)。最 大 允 許 殘 留 量(Maximum ResidueLimit，MRL)。如：四环素类(10种)、磺胺类(20种)、喹诺酮类(20种)等如：四环素类(10种)、磺胺类(20种)、喹诺酮类(20种)等欧盟法规欧盟法规各种离子的鉴别点数各种离子的鉴别点数关于鉴别点（关于鉴别点（intentification piontintentification piont)鉴别点数的规定鉴别点数的规定欧盟2002/1657/EC 法规（质量控制）欧盟2002/1657/EC 法规（质量控制）80%-110%大于1080%-110%大于1070%-110%70%-110%1-101-1050%-120%50%-120%小于等于 1范围真实浓度（小于等于 1范围真实浓度（g/kg）g/kg）没有标准物质(CRM)时，准确度可以通过测定空白基质中加入已知量分析物的回收率获得。准确度：重复分析标准物质，测定的含量（经回收率校正后）平均值与真值的偏差指导范围如下:没有标准物质(CRM)时，准确度可以通过测定空白基质中加入已知量分析物的回收率获得。准确度：重复分析标准物质，测定的含量（经回收率校正后）平均值与真值的偏差指导范围如下:准确度测定的规定准确度测定的规定分析过程的质量控制分析过程的质量控制精密度(变异系数)精密度(变异系数)16 1 000 16 1 000 g/kg23100 g/kg23100 g/kg32*10 g/kg32*10 g/kg45*1 g/kg45*1 g/kgg/kg重现性重现性%CV%CV质量分数质量分数在重复性条件下，实验室内CV通常在上述数值的一半到三份之二之间。在实验室内重现性条件下进行的分析，其实验室内CV不应大于上述重现性CV。质量分数低于100 g/kg时，用Horwitz方程给出无法接受的高值。因此，浓度低于100 g/kg的CV应尽可能低.在重现性条件下，对参考标准或加标样重复分析的实验室间变异系数（CV），不得超出Horwitz方程计算的水平。该方程如下：CV=2xE(1-0.5logC在重复性条件下，实验室内CV通常在上述数值的一半到三份之二之间。在实验室内重现性条件下进行的分析，其实验室内CV不应大于上述重现性CV。质量分数低于100 g/kg时，用Horwitz方程给出无法接受的高值。因此，浓度低于100 g/kg的CV应尽可能低.在重现性条件下，对参考标准或加标样重复分析的实验室间变异系数（CV），不得超出Horwitz方程计算的水平。该方程如下：CV=2xE(1-0.5logC)?对于每个诊断离子，信噪比 3:1 对于每个诊断离子，信噪比 3:1?测定至少一对离子丰度比测定至少一对离子丰度比?相对离子丰度最大容许偏差 不能超过下表50%50%10%30%20%10%到20%25%15%20%到50%20%10%50%CI-GC-MS、GC-MS相对离子丰度最大容许偏差 不能超过下表50%50%10%30%20%10%到20%25%15%20%到50%20%10%50%CI-GC-MS、GC-MSn nLC-MS、LC-MSLC-MS、LC-MSn n（相对）EI-GC-MS（相对）相对丰度（%基峰）（相对）EI-GC-MS（相对）相对丰度（%基峰）分析过程的质量控制对质谱确证方法的要求分析过程的质量控制对质谱确证方法的要求关于微囊藻分类微囊藻（Micocystis)是蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科微囊藻属微囊藻包括：假丝微囊藻铜绿微囊藻具缘微囊藻不定微囊藻水华微囊藻等微囊藻（Micocystis)是蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科微囊藻属微囊藻包括：假丝微囊藻铜绿微囊藻具缘微囊藻不定微囊藻水华微囊藻等关于微囊藻毒素微囊藻（Micocystis)其中多数会产生毒素：MC-RR、微囊藻（Micocystis)其中多数会产生毒素：MC-RR、-LR、-LR、-YR、-LW、-LF、LA、LY 七十多种。基本结构：七环肽，包括5个D-型氨基酸和2个可变的L-型氨基酸组成。两种L-型氨基酸的不同组合构成了微囊藻毒素的不同异构体。MC-RR和MC-LR是其中毒性最大的两种异构体-YR、-LW、-LF、LA、LY 七十多种。基本结构：七环肽，包括5个D-型氨基酸和2个可变的L-型氨基酸组成。两种L-型氨基酸的不同组合构成了微囊藻毒素的不同异构体。MC-RR和MC-LR是其中毒性最大的两种异构体Micocystis结构图HOCH3HCH3HCH3HHNHHNNR2NR1NHHH3COCOOHHOCH3CH2OH3CHOHCOOHHHCH3OHADDAD-GluMdhaD-AlaD-Me-AspL-PhenL-LeuLFL-TryL-LeuLWL-TyrL-LeuLYL-AlaL-LeuLAL-ArgL-LeuLRL-ArgL-TyrYRL-ArgL-ArgRRR2R1Name检测方法1、酶联免疫法酶联免疫法（国标初筛法）目前国内已建立检出限：0.01ng/ml以下,易出现假阳性。2、高效液相色谱法高效液相色谱法（国标定量法）目前国内已建立检出限：0.1ug/ml3、液质联用法液质联用法（确认与定量法）目前国内未建立检出限：0.01ng/ml以下酶标板ELISA板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。ELISA板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。加样在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本，加酶结合物，加底物。1、加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡；2、每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；3、酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本，加酶结合物，加底物。1、加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡；2、每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；3、酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。保温温育常采用的温度有37、室温和4等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37经1-2小时，产物的生成可达顶峰。室温较37可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡。抗原抗体反应在4过夜反应更为彻底。温育常采用的温度有37、室温和4等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37经1-2小时，产物的生成可达顶峰。室温较37可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡。抗原抗体反应在4过夜反应更为彻底。洗涤（决定实验的成败）ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。显色HRP-TMB显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。HRP-TMB显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。常用实验试剂包被液：包被液：磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.4），Tris-HCl(pH=7.8),缓冲液或碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6),4保存磷酸盐缓冲液（PBS pH=7.4），Tris-HCl(pH=7.8),缓冲液或碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6),4保存洗涤液洗涤液：pH7.4 PBS-Tween-20：pH7.4 PBS-Tween-20封闭液封闭液：含1%BSA的PBS缓冲液，4保存：含1%BSA的PBS缓冲液，4保存终止液终止液：1mol/LH：1mol/LH2 2SOSO4 4计算每个标准或样品的平均OD450值，并按以下公式算出B计算每个标准或样品的平均OD450值，并按以下公式算出B0 0根据标准样品的B根据标准样品的B0 0值与对应微囊藻毒素浓度的对数之间的关系做出标准曲线。值与对应微囊藻毒素浓度的对数之间的关系做出标准曲线。标准曲线的绘制阴性对照标准或样品ODODB=0结果的计算OD标准标准/样品样品OD阴性对照阴性对照00.20.40.60.81-2-10123log(c)B0y=-0.4674x+0.6907-0.4-0.200.20.40.60.811.21.4-2-10123log(c)B0根据标准曲线选取根据标准曲线选取”S S”曲线中的直线部分：y =曲线中的直线部分：y =“x x”表示微囊藻毒素浓度的LOG值，再求其反对数得到相应的微囊藻毒素浓度(ng/ml)表示微囊藻毒素浓度的LOG值，再求其反对数得到相应的微囊藻毒素浓度(ng/ml)(High Performance Liquid Chromatography HPLCHigh Performance Liquid Chromatography HPLC)高效液相色谱仪器与设备1、高效液相色谱仪（带梯度洗脱泵，UV检测器，柱温箱）2、色谱分离柱ODS C-18 5um,4.6150mm3、超声波细胞破碎机4、离心机（14,000转/分，可分离1.5mL离心管）5、固相萃取小柱ODS C-18 Waters PN6、旋转蒸发仪7、其他玻璃仪器1、高效液相色谱仪（带梯度洗脱泵，UV检测器，柱温箱）2、色谱分离柱ODS C-18 5um,4.6150mm3、超声波细胞破碎机4、离心机（14,000转/分，可分离1.5mL离心管）5、固相萃取小柱ODS C-18 Waters PN6、旋转蒸发仪7、其他玻璃仪器水样样品预处理500mL水样500mL水样1 GF/C 滤膜2 0.45m 醋酸纤维酯滤膜3 直接测定或-20保存1 GF/C 滤膜2 0.45m 醋酸纤维酯滤膜3 直接测定或-20保存SPE小柱富集纯化SPE小柱富集纯化90%甲醇洗脱，浓缩90%甲醇洗脱，浓缩H P L C 分析H P L C 分析藻类样品预处理50-100mg藻样50-100mg藻样超声破碎（适当程度）超声破碎（适当程度）SPE小柱富集纯化SPE小柱富集纯化90%甲醇洗脱，浓缩90%甲醇洗脱，浓缩H P L C 分析H P L C 分析75-85%甲醇三次萃取、浓缩75-85%甲醇三次萃取、浓缩分离纯化SPE小柱再生SPE小柱再生上样上样10mL甲醇、10mL水、抽干10mL甲醇、10mL水、抽干将样液循一次将样液循一次6mL90%甲醇溶液洗脱甲醇溶液洗脱氮气吹干至氮气吹干至1mL内内流动相定容至流动相定容至2mL离心进样离心进样色谱条件 C18 柱（4.6x250mm）C18 柱（4.6x250mm）流动柱温40，流动柱温40，流速1.0mL/min，流速1.0mL/min，流动相：A 50 mM 磷酸缓冲液,pH3.0,B 甲醇A/B（40/60）流动相：A 50 mM 磷酸缓冲液,pH3.0,B 甲醇A/B（40/60）进样量：20uL/次进样量：20uL/次 检测波长：238nm检测波长：238nmHPLC方法的操作要点1、藻类样品的细胞壁破碎应使用超声波细胞破碎法。2、萃取液可在5%的醋酸溶液或75-85%甲醇溶液两者之间选择。3、藻类样品必须萃取三次。4、固相萃取的柱必须严格再生。5、过SPE柱可重复过两遍，有利藻类毒素的充分吸附。1、藻类样品的细胞壁破碎应使用超声波细胞破碎法。2、萃取液可在5%的醋酸溶液或75-85%甲醇溶液两者之间选择。3、藻类样品必须萃取三次。4、固相萃取的柱必须严格再生。5、过SPE柱可重复过两遍，有利藻类毒素的充分吸附。色谱图M in u t e s024681 01 21 4AU0.0 00.0 20.0 40.0 60.0 8AU0.0 00.0 20.0 40.0 60.0 8LRC h a n n e l AN a m eM in u t e s024681 01 21 4AU-0.0 0 50.0 0 00.0 0 50.0 1 00.0 1 50.0 2 00.0 2 5AU-0.0 0 50.0 0 00.0 0 50.0 1 00.0 1 50.0 2 00.0 2 5 LRC h a n n e l AN a m e色谱图Minutes02468101214AU-0.020.000.020.040.060.080.100.12AU-0.020.000.020.040.060.080.100.12 LRChannel AName结果计算X XX XRR RR X XYR YR X XLR LR C VXC VXXRXR W 1000 式中：W 1000 式中：X X 水华样品中三种微囊藻毒素异构体的总含量mg/g X水华样品中三种微囊藻毒素异构体的总含量mg/g XXRXR水华样品中单个微囊藻毒素异构体的含量mg/gC 水华样品中单个微囊藻毒素异构体的含量mg/gC HPLC测得浓度HPLC测得浓度mg/mLV V 试样定容体积试样定容体积 mLW W 试样称重试样称重 mgLC-MS/MS法分离纯化由于该方法对所有的毒素灵敏度均大于国家标准的限量值（ug/L），所以可以将加内标后的水样，通过0.22 um微孔滤膜过滤后，直接进样分析。无须同HPLC法进行大容量的富集，这无疑大大地提高了实验效率。色谱条件Acquity UPLC BHE130 C18柱(2.1100 mm、粒径1.7 m)，柱温：30；样品温度：室温，进样体积：10uL，流速：0.3mL/min，Acquity UPLC BHE130 C18柱(2.1100 mm、粒径1.7 m)，柱温：30；样品温度：室温，进样体积：10uL，流速：0.3mL/min，洗脱梯度203040506070809010002.544.54.958时间(min)强洗脱溶剂比例(%)强洗脱溶剂的选择乙腈/甲醇(60/40)甲醇五种MCYST在不同流动相对离子化的影响流动相MCYST-RR峰面积MCYST-YR峰面积MCYST-LR峰面积MCYST-LW峰面积MCYST-LF峰面积不含有添加剂191891622618837461131333320.1%TFA19611026273325260775990.1%甲酸13932891728236722582445210.2%甲酸1646810936303738801324880420mM醋酸铵1084766136693493111521430.1%甲酸+20mM 醋酸铵1406412197200541192442889410.2%甲酸+20mM 醋酸铵153591192818824115541275030流动相MCYST-RR峰面积MCYST-YR峰面积MCYST-LR峰面积MCYST-LW峰面积MCYST-LF峰面积不含有添加剂191891622618837461131333320.1%TFA19611026273325260775990.1%甲酸13932891728236722582445210.2%甲酸1646810936303738801324880420mM醋酸铵1084766136693493111521430.1%甲酸+20mM 醋酸铵1406412197200541192442889410.2%甲酸+20mM 醋酸铵153591192818824115541275030五种MCYST在不同类型色谱柱的比较STD acquityTime1.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.804.004.204.404.604.805.005.20%01001.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.804.004.204.404.604.805.005.20%01001.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.804.004.204.404.604.805.005.20%01001.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.804.004.204.404.604.805.005.20%0100mcyst-060912-030 Sm(Mn,2x2)MRM of 6 Channels ES+TIC6.21e5mcyst-060912-016 Sm(Mn,2x2)MRM of 6 Channels ES+TIC5.74e5mcyst-060912-023 Sm(Mn,2x2)MRM of 6 Channels ES+TIC4.44e5mcyst-060912-018 Sm(Mn,2x2)MRM of 6 Channels ES+TIC6.09e5bacda symmetry300 C18(4.6*75mm i.d.particle size 3.5um pore size 300 A)b symmetry300 C18(2.1*100mm i.d.particle size 3.5um pore size 300 A)c acquity UPLC BEH130 C18(2.1*100mm i.d.particle size 1.7um pore size 130 A)效果最好d acquity UPLC BEH C18(2.1*100mm particle size 1.7um pore size A)质谱条件离子源参数：离子源参数：电喷雾：正离子毛细管电压：3.50kV锥孔电压：40V离子源温度：120锥孔反吹气流量：55 L/hr脱溶剂气温度：350脱溶剂气流量：600L/hr。质量分析器参数:质量分析器参数:低端分辨率LF Lens1:12.0V高端分辨率HM Lens1:12.0V；入口透镜电压：1V碰撞梯度：0.5出口电压：2V；低端分辨率LF Lens2:12.0V高端分辨率HM Lens2:12.0V MCYST的碎片机理（LR、YR、LA、LY、LW、LF）RR的特征离子和碎片机理质量条件参数注：注：a：所选择的母离子：所选择的母离子 b：所选择的定量子离子：所选择的定量子离子60213.356135.060213.356135.0b bN.D.986.8N.D.986.8a a986.2MCYST-LF986.2MCYST-LF60213.360135.0 60213.360135.0 b bN.D.1025.8N.D.1025.8a a1025.2MCYST-LW1025.2MCYST-LW59213.359135.059213.359135.0b bN.D.1002.3N.D.1002.3a a1002.2MCYST-LY1002.2MCYST-LY60213.357135.060213.357135.0b bN.D.910.9N.D.910.9a a910.0MCYST-LA910.0MCYST-LA55213.355135.055213.355135.0b b498.4995.6498.4995.6a a995.2MCYST-LR995.2MCYST-LR55213.363135.055213.363135.0b bN.D1045.8N.D1045.8a a1044.0MCYST-YR1044.0MCYST-YR30620.028135.030620.028135.0b b520.1520.1a a1038.41038.2MCYST-RR1038.41038.2MCYST-RR20397.423278.220397.423278.2b bN.D.556.5N.D.556.5a a555.6亮氨酸脑腓肽555.6亮氨酸脑腓肽碰撞能量(eV)特征离子M+2碰撞能量(eV)特征离子M+22+2+离子准分子离子M+1离子准分子离子M+1+分子量名称分子量名称标准品的总离子流色谱图标准品定量离子色谱图定量检出限各标准品浓度均为1ug/L其LOQ均在0.2ug/L左右空白水样检测结果标准曲线Compound name:YRCorrelation coefficient:r=0.999178,r2=0.998357Calibration curve:0.113707*x+-0.0107396Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:NoneConc0.001.002.003.004.005.006.007.008.00Response0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900Compound name:RRCorrelation coefficient:r=0.999392,r2=0.998784Calibration curve:0.687772*x+0.0087244Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:NoneConc0.001.002.003.004.005.006.007.008.00Response0.001.002.003.004.005.00Compound name:LRCorrelation coefficient:r=0.999662,r2=0.999324Calibration curve:0.138101*x+-0.015116Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:NoneConc0.001.002.003.004.005.006.007.008.00Response0.000.200.400.600.801.00标准曲线Compound name:LWCorrelation coefficient:r=0.996604,r2=0.993220Calibration curve:0.102739*x+-0.0306631Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:NoneConc0.001.002.003.004.005.006.007.008.00Response0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700Compound name:LACorrelation coefficient:r=0.999394,r2=0.998789Calibration curve:0.130939*x+-0.0101696Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:NoneConc0.001.002.003.004.005.006.007.008.00Response0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.00Compound name:LYCorrelation coefficient:r=0.996483,r2=0.992978Calibration curve:0.158655*x+-0.0228715Response type:Internal Std(Ref 1),Area*(IS Conc./IS Area)Curve type:Linear,Origin:Exclude,W