宜春明月山富硒土壤中耐硒酵母菌株的筛选与鉴定_包珍.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 4 期 168 研究探讨宜春明月山富硒土壤中耐硒酵母菌株的筛选与鉴定包珍，严美婷，许莉倩，肖勇生江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院（宜春 336000）摘要从宜春明月山毛竹林采集的富硒土壤中,筛选出耐硒酵母菌株并进行鉴定。采用PDA培养基、营养琼脂培养基、马丁氏培养基筛选出耐亚硒酸钠浓度较高的酵母菌株,根据菌株形态学特征和26S rDNA基因序列分析,对其进行分类鉴定。从土壤中分离得到7株耐硒菌株,其中2株具有典型酵母菌特征的菌株,经鉴定结果表明:菌株A1为Saitozymapodzolica,菌株P为Cyberlindnerasaturnus。得到2株耐硒酵母菌株,丰富了耐硒酵母资源。关键词富硒土壤,耐硒酵母菌株,鉴定Screening and Identification of Se-tolerant Yeast Strains in the Se-rich Soil of Mingyue Mountain in YichunBAO Zhen,YAN Meiting,XU Liqian,XIAO YongshengFood Inspection and Testing Institute of Jiangxi General Institute for Inspection,Testing and Certification(Yichun 336000)Abstract Se-tolerant yeast strains were screened and identified from se-rich soils collected from Phyllostachyspubescens forests in YichunMingyue Mountain.PDA medium,nutrient agar medium and Martins medium were used to screen the yeast strains with high disodium selenite concentration.The morphological characteristics and 26S rDNA gene sequences of the strains were analyzed,to carry on the classification appraisal to it.Seven Se-tolerant strains were isolated from the soil,among which two strains had typical yeast characteristics.The identification results showed that strain A1 was Saitozymapodzolica,and strain P1 was Cyberlindnerasaturnus.Two Se-tolerant yeast strains were obtained,which enriched the Selenium-resistant yeast resources.Keywords se-rich soil;se-tolerance yeast strains;identification基金项目：江西省重点研发计划项目（20192BBFL60033）硒是人体必需的15种微量元素之一，是人体内许多种酶的活性基团，硒对人体健康有着直接或间接的影响，是很好的抗氧化剂，有抗肿瘤、防衰老和增强机体免疫力等多种功能1-4。科学研究表明：缺硒会引起人体许多生理功能的下降，从而导致克山病、糖尿病、大骨节病、心脑血管病、神经退行疾病等多种疾病的发生5-8。江西省宜春市是全国三大天然富硒地之一，根据2018年宜春市全域开展的硒资源普查，全市有1 545万亩（1亩=666.67 m2）富硒土壤和潜在富硒土壤，占全市国土面积的55%9。但由于自然界中的硒元素多以人类不能直接吸收和使用的无机硒形式存在，于是，如何将无机硒转化为有机硒，就成了人们研究的重点。酵母菌可以在细胞内将含硫氨基酸替换为硒生成硒代氨基酸，从而实现无机硒向对身体无毒害作用的有机硒转化，因此，对耐硒酵母菌的筛选驯化具有十分重要的科学价值10-11。研究通过采用PDA培养基、营养琼脂培养基、马丁氏培养基筛选出耐亚硒酸钠浓度较高的菌株，根据菌株形态学特征和菌株26S rDNA基因序列进行分析后，对其进行种属分类鉴定，为宜春富硒土壤资源转化为经济资源提供了生物种质资源和技术手段，丰富了富硒酵母菌株的资源12。1材料与设备1.1土壤样品土壤样品采集自宜春明月山地区毛竹林，选取毛竹笋根系旁的土壤，除去表面沙土和杂物，采集深度2030 cm左右的土样多点混匀，去除石块、根茎、落叶等，用自封袋密封带回实验室，以备筛选耐硒菌株时使用。1.2培养基和试剂PDA培养基、营养琼脂培养基、马丁氏培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；98%亚硒酸钠（郑州百利化工产品有限公司）。AX523ZH电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；SW-CJ-2D洁净工作台（苏州净化设备有限公司）；BSP-400生化培养箱（上海博迅仪器有限公司）；LDZD-150L灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SHA-CA水浴恒温振荡器（常州荣华仪器制造有限公司）；CX31显微镜（OLYMPUS）。2试验方法2.1菌株的筛选采集回的土壤样品，经原子荧光法检测后土壤中 169 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期总硒含量大于0.6 mg/kg作为试验土壤样品。称取试验土壤样品10 g，倒入装有90 mL灭菌去离子水的锥形瓶中，在30 100 r/min条件下恒温振荡10 min后静置30 min。取1 mL上清液在含有14 g/mL亚硒酸钠的PDA培养基、营养琼脂培养基、马丁氏培养基上分别进行平板涂布分离，观察单株菌落在平板上的生长状态和菌落形态。挑取不同菌落形态、生长状况良好的单个菌落，在同样的培养基上进行划线培养纯化，将纯化后的菌种进行平板培养基梯度硒耐受筛选，筛选平板培养基中亚硒酸钠质量浓度梯度为20，40，80和120 g/mL，对耐硒能力较差的菌株在筛选过程中不断进行淘汰，筛选出耐硒能力强的菌株13-14。2.2菌株的鉴定观察平板上菌株的菌落特征，挑取菌落用革兰氏染色法在显微镜下观察菌株的形态结构。将符合典型酵母菌特征的菌株送广东省微生物分析检测中心进行生理生化和分子生物学鉴定。根据26S rDNA序列信息结果，在NCBI上进行BLAST比对，利用MEGA 7.0构建进化树，获得菌株种属信息。3结果与分析3.1耐硒菌株的筛选当亚硒酸钠质量浓度在选择性平板分离培养过程中达到120 g/mL时，菌株基本停止生长，最终在亚硒酸钠质量浓度为80 g/mL的平板上，获得耐硒能力较强的7个菌株，分别是：营养琼脂平板上分离得到三种不同形态的菌落，编号为Y3、Y7、A1；PDA培养基平板上分离得到两种不同形态菌落，编号为P1和P5；马丁氏培养基平板中分离得到两种不同形态的菌落，编号为M3和M5。3.2耐硒酵母菌株的鉴定3.2.1耐硒酵母菌株的形态特征图1菌株菌落形态及革兰氏染色对筛选出的菌株进行形态观察，经过观察：菌株A1菌落如图1（A）所示，菌落为白色、圆形、表面光滑湿润；菌株P1如图1（B）所示，菌落为白色、圆形、凸起、有皱褶、有明显的酵母发酵气味。在显微镜下用革兰氏染色法观察两株菌株的菌体形态特征，结果发现：菌株A1和P1均呈酵母菌细胞卵圆形、芽殖，如图1（C）和（D）所示。3.2.2耐硒酵母菌株的生理生化特征生理生化鉴定试验主要有糖类发酵、碳源同化等试验15。菌株A1、P1的生理生化反应结果见表1。由表1结果可看出：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、松叁糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、海藻糖可被菌株A1分解同化利用，醇类可同化肌醇、山梨醇。菌株P1只对葡萄糖，D-木糖，纤维二糖，蔗糖，棉子糖有分解利用作用。表1耐硒酵母菌株的生理生化特性试验反应结果菌株A1菌株P1萄萄糖GLU+甘油GLY-+2-酮基-萄萄糖酸盐2KGA+-L-阿拉伯糖ARA+-D-木糖XYL+阿东醇ADO-木糖醇XLT-半乳糖GAL+-肌醇INO+-山梨醇SOR+-甲基-D-葡萄糖甙MDG+-N-乙酰-葡萄糖甙NAG+-纤维二糖CEL+乳糖LAC+-麦芽糖MAL+-蔗糖SAC+海藻糖TRE+-松叁糖MIZ+-棉子糖RAF+注:+表示阳性,-表示阴性。3.2.3耐硒酵母菌株的分子生物学鉴定菌株A1和P1的26S rDNA测序结果在NCBI上的GeneBank进行Blast同源性比对，获得2株耐硒酵母菌株近缘种相似种属（见表2），结果发现菌株A1与Saitozymapodzolica同源性达100%，菌株P1与Cyber-lindnerasaturnus同源性99%以上。使用MEGA 7.0软件中构建系统进化树，如图2所示16-17，进一步表明菌株A1与Saitozymapodzolica聚为一支，菌株P1与Cyberlindnerasaturnus聚为一支。表2菌株26S rDNA同源性分析菌株近源物种相似性/%A1Saitozymapodzolica100P1土星形塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnerasaturnus99食品工业 2023 年第44卷第 4 期 170 研究探讨图2菌株26S rDNA基因序列系统发育树4结论研究通过对宜春明月山地区毛竹林土壤耐硒菌株进行筛选，筛选得到7株具有较强耐硒能力的菌株，经过形态学观察后对其中两株具有典型酵母菌形态特征的菌株进行分子生物学鉴定。经初步鉴定，其中菌株P1为Cyberlindnerasaturnus（土星形塞伯林德纳氏酵母），该菌株目前发现可用于科研或生产，主要用于生产2-乙酯，有较高的实际应用价值；A1为Saitozymapodzolica，暂未查明其具体使用用途。研究为下一步对富硒酵母蛋白、水溶性有机硒等产品研究和开发提供了理论依据，且耐硒酵母菌在土壤硒活化方面有巨大的应用潜力，对宜春明月山地区富硒土壤资源利用、富硒农产品开发等具有重要的现实意义。参考文献：1 段玉桦,余雍和,杨锐,等.耐硒菌株Lysinibacillusfusiformis D1的鉴定及清除自由基能力研究J.食品与发酵工业,2021,47(24):77-82.2 CHEN Y C,PRABHU K S,MASTRO A M.Is selenium a potential treatment for cancer metastasisJ.Nutrients,2013,5(4):1149-1168.3 KUROKAWA S,BERRY M J.Seleniumrole of the essential metalloid in healthJ.Metal Ions in Life Sciences,2013,13:499-534.4 屈兰竺,杨松杰,禚苏,等.微量必需元素硒的作用探析J.中国农学通报,2010,26(7):94-97.5 廖青,梁潘霞,邢颖,等.广西富硒区土壤耐硒菌株的分离及鉴定J.西南农业学报,2017(10):2303-2307.6 孙朝阳,张玉英,潘利华,等.高富硒酵母菌株的筛选及其富硒特性分析J.中国酿造,2020,9(39):116-120.7 RAYMAN M P.The argument for increasing selenium intakeJ.Proceedings 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