微生物培养基.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,微生物培养基,微生物培养基,第1页,培养基,：是指一切可供微生物细胞生长繁殖和合成各种代谢产物营养物质。,碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长辅助因子,培养基作用,：,满足菌体生长,促进产物形成,培养基,微生物培养基,第2页,培养基,3.1,培养基配制基础要求,3.2,培养基成份及起源,3.3,培养基类型及功效,3.4,发酵培养基设计和优化,微生物培养基,第3页,3.1,培养基基础要求,单位培养基能够产生最大量目标产物；,能够使目标产物合成速率最大；,能够使副产物合成量最少；,质量稳定、价格低廉、易长久取得；,不影响通气搅拌性能和后处理。,微生物培养基,第4页,3.2,培养基成份及起源,培养基基础要素,碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长调整物质。,微生物培养基,第5页,一、碳源,主要功效：,1,）为菌体生长繁殖提供能源和合成菌体所必需成份；,2,）为合成目标产物提供所需碳素成份,微生物培养基,第6页,常见碳源,:,特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。,糖类,油脂,有机酸,低碳醇等,微生物培养基,第7页,1,、糖类,发酵培养基中使用最广泛碳源,;,主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等,糖类,来 源,葡萄糖,乳糖,淀粉,蔗糖,纯葡萄糖、水解淀粉,纯乳糖、乳清粉,大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉等,甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等,工业上常见糖类及起源,微生物培养基,第8页,葡萄糖,最易利用，几乎全部微生物都能利用,葡萄糖常作为培养基一个主要成份，而且作为加速微生物生长一个有效糖。,但过多葡萄糖会过分加速菌体呼吸，以至培养基中溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物（如丙酮酸、乳酸、乙酸等）不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，造成,pH,下降，影响一些酶活性，从而抑制微生物生长和产物合成。,微生物培养基,第9页,糖蜜,制糖结晶母液，它是制糖工业副产物,;,含有丰富糖、氮类化合物、无机盐和维生素等，是微生物发酵培养基价廉物美碳源,;,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达,50%-75%,。,糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖含量和无机盐含量上有所不一样，即使同一个糖蜜因为加工方法不一样其成份也存在差异，所以使用时要注意。,微生物培养基,第10页,淀粉糊精,多糖，也是常见碳源,;,需经胞外酶水解成单糖后再被吸收利用,;,使用淀粉可克服葡萄糖代谢过快弊病，价格也比较低廉，在发酵工业中被普遍使用。,常见淀粉为玉米、甘薯、马铃薯、木薯淀粉。,微生物培养基,第11页,油和脂肪也能被许多微生物作为碳源和能源,这些微生物都含有比较活跃脂肪酶，在脂肪酶作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧参加下，深入氧化成,CO,2,和,H,2,O,，并释放出大量能量。,当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多氧，不然大量脂肪酸和代谢中有机酸会积累，从而引发,pH,下降，并影响微生物酶系统作用。,常见豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等,2,、油和脂肪,油、脂肪,甘油脂肪酸,CO,2,H,2,O,ATP,脂肪酶,氧气,微生物培养基,第12页,一些微生物对各种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强氧化能力，能够有机酸或有机酸盐作为碳源。,有机酸利用常会使,pH,上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴伴随碱性物质产生，使,pH,深入上升。,如以醋酸盐为碳源时，反应以下：,CH,3,COONa+2O,2,2CO,2,+H,2,O+NaOH,3,、有机酸,微生物培养基,第13页,伴随石油工业发展，微生物工业碳源也有所扩充。,正烷烃（普通指从石油裂解中得到,14-18,碳直链烷烃混合物）已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂工业发酵中。,石油工业发展促使乙醇产量增加，乙醇代粮发酵工艺发展也十分快速，自然界中能同化乙醇微生物和能同化糖质微生物一样普遍，种类也相当多，乙醇作碳源其菌体得率比葡萄糖作碳源还高，因而乙醇已成功地应用于发酵工业许多领域中，如利用乙醇生产单细胞蛋白,4,、烃和醇类,微生物培养基,第14页,二、氮源,有机氮源,豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等,无机氮源,铵盐、硝酸盐等,（因为细胞内含氮物质都以氨基或亚氨基形式存在，故铵态氮能够直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后才能被利用）,微生物培养基,第15页,无机氮源和尿素、玉米浆等可被快速利用，为,速效氮,；,蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，,属,迟效氮,微生物培养基,第16页,氮源物质常对培养液,pH,产生影响,(NH,4,)SO,4,2NH,3,+H,2,SO,4,NaNO,3,+4H,2,NH,3,+2H,2,O+NaOH,反应中所产生,NH,3,被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。,在常见无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液,pH,下降，为,生理酸性物质,；,硝酸钠被同化时则引发培养液,pH,上升，为,生理碱性物质,微生物培养基,第17页,作用,：各种不一样,起源,：,C,、,N,源，以盐形式补充,用量,：依据详细产品，以试验决定,使用注意点,A.,对于其它渠道有可能带入过多某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑,三、无机盐和微量元素,微生物培养基,第18页,B,、使用时注意盐形式（,pH,改变）,例：,黑曲酶,NRRL-330,生产,-,淀粉酶，,pH,对酶活影响,pH,酶活,不加,4.25 120,分钟,加,K,2,HPO,4,5.45 30,分钟,加,KH,2,PO,4,4.62 75,分钟,微生物培养基,第19页,四、生长因子,概念：,微生物生长不可缺乏微量有机物质。,类别：,维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物,微生物培养基,第20页,不是全部微生物都必需，只是对于一些自己不能合成这些成份微生物才是必不可少营养物质。,如以糖质原料为碳源谷氨酸生产菌均为生物素缺点型，以生物素为生长因子。,又如当前所使用赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌各种突变株，均为生物素缺点型，同时也是一些氨基酸如高丝氨酸缺点型，需要生物素和一些氨基酸作为生长因子。,微生物培养基,第21页,提供生长因子农副产品原料,1,）玉米浆,（,corn steep liquor,CSL,）,用亚硫酸浸泡玉米而得浸泡液浓缩液，也是玉米淀粉生产副产品,即使主要用作氮源，但它含有丰富氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常见作为提供生长因子物质。,微生物培养基,第22页,五、水,生理功效：,1,）是微生物机体主要组成个别,2,）进行代谢反应介质,3,）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能经过细胞表面进行正常活动；,4,）水比热高，能有效吸收代谢过程中放出热，使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热良导体，有利于散热，可调整细胞温度。,微生物培养基,第23页,对于发酵工厂来说，恒定水源是至关主要，因为在不一样水源中存在各种原因对微生物发酵代谢影响甚大，尤其是水中矿物质组成对酿酒工业和淀粉糖化影响甚大。,水源质量主要参数包含,pH,值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,微生物培养基,第24页,六、前体,(precursor),概念：,指一些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其本身结构并没有多大改变，不过产物产量却因加入前体而又较大提升。,微生物培养基,第25页,发觉：,最早是从青霉素生产中被发觉。,加入玉米浆后，青霉素单位可从,20U/ml,增加到,100U/ml,；,玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提升青霉素,G,产量。,微生物培养基,第26页,大多数前体，如苯乙酸对微生物生长有毒性，以及菌体含有将前体氧化分解能力，所以在生产中为了降低毒性和增加前体利用率，常采取少许屡次工艺。,微生物培养基,第27页,产品,前体,青霉素,G,青霉素,V,金霉素,灰黄霉素,红霉素,核黄素,类胡萝卜素,L-,异亮氨酸,L-,色氨酸,L-,丝氨酸,苯乙酸及其衍生物,苯氧乙酸,氯化物,氯化物,正丙醇,丙酸盐,-,紫罗酮,-,氨基丁酸,邻氨基苯甲酸,甘氨酸,微生物培养基,第28页,七、促进剂和抑制剂,1,、促进剂：,促进剂是指那些非细胞生长所必需营养物，又非前体，但加入后却能提升产量添加剂。,微生物培养基,第29页,促进剂,不是前体或营养物,可影响正常代谢，或促进中间代谢产物积累，或提升次级代谢产物产量,比如,巴比妥可增加链霉素产生菌抗自溶能力，推迟自溶时间，增加链霉素积累。,谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，加入红霉素可提升产量,25%,以上。,微生物培养基,第30页,2,、抑制剂,抑制一些代谢路径进行，同时刺激另一代谢路径，以致能够改变微生物代谢路径。,如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，能够使酒精发酵受到抑制，而转入甘油发酵,微生物培养基,第31页,产物,被抑制产物,抑制剂,链霉素,去甲链霉素,四环素,去甲金霉素,头孢霉素,C,利福霉素,B,甘露糖链霉素,链霉素,金霉素,金霉素,头孢霉素N,其它利福霉素,甘露聚糖,乙硫氨酸,溴化物、硫脲,硫磺化合物、乙硫氨酸,L-蛋氨酸,巴比妥药品,一些代谢产物抑制剂,微生物培养基,第32页,3.3,发酵培养基类型,按营养物质起源,按培养基形态,按生产用途,微生物培养基,第33页,发酵培养基类型,依据,类型,特 点,按营养物质起源,天然,异养微生物生长，普通自养型微生物不能生长,合成,定量工作研究用，生长慢，营养成份简单,按培养基形态,液体,培养种子和发酵时用,固体,用于菌种分离、保藏、观察、计数、判定等,半固体,液琼脂，微好氧细菌培养或运动能力确定,按生产用途,孢子,产孢子用,种子,供孢子发芽和菌体生长繁殖，营养丰富、完整，浓度不高,发酵,供菌体生长繁殖和最大程度地取得目标产物用,微生物培养基,第34页,1,、按培养基物质起源,1,）合成培养基,所用原料化学成份明确、稳定,如葡萄糖、硫酸铵,适于研究菌种基础代谢和过程物质改变等科研工作；在生产一些疫苗过程中，为了预防异性蛋白质等杂质掺入，也常见合成培养基；,营养单一、价格较高，不适于大规模生产,2,）天然培养基,原料是一些天然动、植物产品,如花生饼粉、蛋白胨等,起源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产,普通不需要另加微量元素、维生素等物质,因为成份复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,微生物培养基,第35页,2,、按培养基形态分,1,）固体,适于菌种和孢子培养与保留，也广泛应用于有子实体真菌类，如香菇、白木耳等生产；,多年来因为机械化程度提升，在发酵工业上又开始应用固体培养基进行大规模生产，其组分常见麸皮、大米、小米、木屑、禾壳等。,2,）半固体,琼脂,0.5%-0.8%,主用于判定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体效价测定等,3,）液体,发酵工业大规模使用培养基,微生物培养基,第36页,3.,按用途分,孢子培养基,种子培养基,发酵培养基,微生物培养基,第37页,供菌种繁殖孢子培养基，常见固体培养基。,1,）孢子培养基,微生物培养基,第38页,孢子培养基基础要求,：,配制时需注意：,A,）营养不要太丰富（尤其是有机氮源），不然不易产孢子。,如灰色链霉菌在葡萄糖,-,硝酸盐,-,其它盐培养基上都能很好地生长和产生孢子，但若加入,0.5%,酵母膏或酪蛋白后，就只长菌体而不产孢子,B,）所用无机盐浓度要适量，不然会影响孢子量和孢子颜色。,C,）注意,pH,和培养基湿度。,基础要求是能使菌体快速生长，产生较多优质孢子，且不易引发菌种发生变异。,微生物培养基,第39页,常见孢子培养基：,麸皮培养基,小米培养基,大米培养基,玉米碎屑培养基,用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制琼脂斜面培养基,大米和小米常见作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，是良好孢子培养基。,微生物培养基,第40页,2,）种子培养基,供孢子发芽、生长和菌体繁殖培养基。,微生物培养基,第41页,营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这么可达较高溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。,种子培养基成份要考虑在代谢过程中能维持稳定,pH,，其成份还要依据不一样菌种主要特征而定。,普通种子培养基都用营养丰富而完全天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源轻易利用，有利菌体快速生长，所以在种子培养基中常包含有机氮源和无机氮源。,最终一级种子培养基成份最好能较靠近于发酵培养基，这么可使种子进入发酵培养基后能快速适应，快速生长。,微生物培养基,第42页,3,）发酵培养基,既要使种子接入后能快速生长，到达一定菌体浓度，又要使长好菌体能快速合成所需产物。所以，发酵培养基组成除有菌体生长所必需元素和化合物外，还要有合成产物所需特定元素、前体和促进剂等。,供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用培养基。,但若因生长和合成产物所需总碳源、氮源和其它营养物质总浓度太高，或生长和合成产物两个阶段各需最正确条件有求不一样时，则可考虑培养基用分批补料工艺来加以满足。,微生物培养基,第43页,生理代谢,菌种筛选,种子培养,发酵培养,微生物培养基,第44页,不一样发酵产物，不一样菌种所选择发酵培养基是不一样。,白酒,(chinese spirit),发酵：,固体发酵培养基；,果酒,(fruit spirit),发酵：果汁 ；,啤酒,(beer),发酵：,麦芽汁液体培养基；,酒精,(alcohol),发酵：,淀粉糖化醪；,氨基酸,(amino acid),发酵：,水解糖液加其它营养成份；,柠檬酸,(citric acid),发酵：,淀粉液化醪,；,乳酸,(lactic acid),发酵：,淀粉糖化醪；,甲烷,(methane),发酵：,复杂有机废物发酵；,抗生素,(antibiotic),发酵：,淀粉糖化醪,+,豆饼粉+麸皮粉,微生物培养基,第45页,一、培养基成份选择标准,普通只有小分子能够经过细胞膜进入细胞内进行代谢；,微生物能够利用复杂大分子是因为分泌各种水解酶，在体外将大分子水解为微生物能直接利用小分子,;,微生物起源和种类不一样，所分泌水解酶系不一样；,有微生物因为水解酶系缺乏，只能利用简单物质；,在考虑某一菌种对培养基总体要求时，在成份选择时应注意以下几方面问题：,1,、菌体同化能力,3.4,发酵培养基设计和优化,微生物培养基,第46页,在碳源和氮源选取时尤其要注意，许多碳源和氮源都是复杂有机大分子，如淀粉、黄豆饼粉等；用这类原料，微生物须具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶。,培养,不能分泌淀粉酶菌株，可先将淀粉糖化,有些微生物，如大多数氨基酸产生菌，缺乏蛋白水解酶，可先将有机氮源水解,培养基成份选择标准,(continued),以酿酒酵母为例：普通不含淀粉酶，不能利用可溶性淀粉；细胞内缺乏将硝酸根离子还原为铵离子所需催化酶，所以做培养基优化时，咱们用氮源时考虑各种氨盐等而少考虑各种硝酸盐类。,微生物培养基,第47页,酶制剂生产，也应考虑碳源分解代谢阻遏影响，对于许多诱导酶来说，易被利用碳源（如葡萄糖或果糖）不利于产酶。,培养基成份选择标准,(continued),2,、代谢阻遏和诱导,依据微生物特征和培养目标，注意快速利用碳（氮）源和慢速利用碳（氮）源配合，发挥各自优势，避其所短。,菌体利用葡萄糖时产生分解代谢物可能阻遏或抑制一些产物合成所需酶系形成或酶活性（葡萄糖效应）；在抗生素发酵时，种子培养基所含快速利用碳源和氮源往往比发酵培养基多；有时需考虑分批补料或连续补料。,有些产物会受氮源诱导与阻遏，如通常蛋白酶生产受培养基中蛋白质或多肽诱导，而受铵盐、硝酸盐、氨基酸阻遏，应考虑氮源以有机氮源（如蛋白质）为主。,微生物培养基,第48页,不一样生长阶段，对碳氮比最适要求可能不一样。普通来讲，因为碳源既作为碳架参加菌体和产物合成，又作为生命过程中能源，故百分比要求比氮源高。,培养基成份选择标准,(continued),3,、适当碳氮比,碳氮比对生长繁殖以及产物合成影响极其显著,氮源过多，会使菌体生长过旺，,pH,偏高，不利代谢产物积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量；,碳源过多则易形成较低,pH,；碳源不足则轻易引发菌体衰老和自溶。,微生物培养基,第49页,pH,是微生物生长和代谢极为主要环境因子；,微生物在利用营养物质后，因为酸碱物质积累或代谢酸碱物质形成，会造成培养体系中,pH,波动；,发酵过程中调整,pH,方式普通不主张直接用酸碱来调整；,要确保发酵过程中,pH,能满足工艺要求，合理配制培养基是决定原因，因而在配制培养基选取营养成份时，除了考虑营养需求外，也要考虑其代谢后对培养体系,pH,缓冲能力影响。,培养基成份选择标准,(continued),4,、,pH,要求,微生物培养基,第50页,二、培养基优化,选择培养基成份，设计培养基配方，即使有一些理论依据，但最终确实定是经过试验方法取得。,培养基设计与优化大致步骤：,1,）依据前人经验和培养基配制基础理论，初步确定可能成份；,2,）经过单因子试验确定最为适宜培养基成份；,3,）经过多因子试验确定各成份最适浓度,微生物培养基,第51页,单因子试验比较简单。,对于多因子试验，为了经过较少试验次数取得所需结果，常采取一些合理试验设计方法，常见有,正交试验设计,、,响应面分析,等。,微生物培养基,第52页,类胡萝卜素高产菌,Y11,培养基优化,郭秒,食品与工业发酵，,（汉字关键期刊）,案例分析：,微生物培养基,第53页,原培养基,:,微生物培养基,第54页,初步确定可能培养基成份,(,以碳源为例,),微生物培养基,第55页,经过单因子试验确定适宜培养基成份,(,以碳源为例,),考虑到成本：,乙酸钠是较为适当碳源,深入试验：,乙酸钠浓度,0.2%,比很好,微生物培养基,第56页,结果：,碳源：,乙酸钠,0.2%,氮源：,氯化铵,0.2%,酵母膏,0.03%,无机盐：,复合无机盐,0.05%,微生物培养基,第57页,正交设计确定优化配方,正交试验设计,微生物培养基,第58页,1,、正交表记号及含义,正交表列数,（最多能安排原因个数，,包含交互作用、误差等）,正交表行数,（需要做试验次数）,各原因水平数,（,各原因水平数相等）,q,正交表,代号,微生物培养基,第59页,微生物培养基,第60页,微生物培养基,第61页,（改进后培养基）,（原培养基）,改进后培养基发酵结果,微生物培养基,第62页,正交试验设计,(Orthogonal experimental design),均匀分散，齐整可比,是一个高效率、快速、经济试验设计方法,日本著名统计学家田口玄一将正交试验选择水平组合列成表格，称为正交表,微生物培养基,第63页,1,、正交表记号及含义,正交表列数,（最多能安排原因个数，,包含交互作用、误差等）,正交表行数,（需要做试验次数）,各原因水平数,（,各原因水平数相等）,q,正交表,代号,微生物培养基,第64页,如,表示,？,表示各原因,水平数,为,2,，,做,8,次试验,，最多考虑,7,个,原因,（含交互作用）,正,交表,。,微生物培养基,第65页,微生物培养基,第66页,依据正交表数据结构看出，正交表是一个,n,行,c,列表，其中第,j,列由数码,1,，,2,，,Sj,组成，这些数码均各出现,N/S,次，比如表,11,中，第二列数码个数为,3,，,S,=3,，即由,1,、,2,、,3,组成，各数码均出现,3,次。,微生物培养基,第67页,正交表特点,1,、正交表中任意一列中，不一样数字出现次数相等；,表示：在试验安排中，所挑选出来水平组合是均匀分布（每个原因各水平出现次数相同）,均衡分散性,微生物培养基,第68页,2,、正交表中任意两列，把同行两个数字看成有序数,对时，全部可能数对出现次数相同。,表示：任意两原因各种水平搭配在所选试验中出现次数相等,整齐可比性,以上是设计正交试验表基础准则,微生物培养基,第69页,2,、正交试验表头设计,表头设计是正交设计关键，它负担着将各原因及交互作用合理安排到正交表各列中主要任务，所以一个表头设计就是一个设计方案。,微生物培养基,第70页,表头设计主要步骤,(1),确定列数,(2),确定各原因水平数,(3),选定正交表,(4),表头安排,(5),组织实施方案,微生物培养基,第71页,整个设计过程一句话归纳为：,“原因次序上列,水平对号入座,试验横着作”。,微生物培养基,第72页,方法,1,直观分析（极差分析）,（,1,）计算极差，确定原因主次次序,第,j,列极差,极差越大，说明这个原因水平改变对试验结果,影响越大，极差最大那个原因，就是最主要原因。,3,、结果统计方法,微生物培养基,第73页,微生物培养基,第74页,方法,2,方差分析法,基础思想与,双原因方差分析,方法一致：将总,离差平方和分解成各原因及各交互作用离差平方,和，结构,F,统计量，对各原因是否对试验指标含有,显著影响，作,F,检验。,微生物培养基,第75页,作 业,1,、某培养基影响原因与水平以下，试问应采取哪种正交表进行试验？,原因水平,玉米粉,（）,A,豆饼粉,（）,B,蛋白胨,（）,C,PH,D,1,0.5,4,0.5,5.0,2,1.0,5,0.6,5.5,3,1.5,6,0.7,6.0,微生物培养基,第76页,