西藏牦牛腹泻性大肠杆菌的分离鉴定.pdf

742023年 第53卷 第4期试验研究大肠杆菌（Escherichiacoli）是人和动物肠道的正常菌群之一，也是一种重要的人畜共患病病原菌1，常引起食品安全和公共卫生安全问题2，严重威胁人类生命健康3。常见的致病性大肠杆菌主要包括肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）、产vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）和尿道致病性收稿日期：2023-03-21基金项目：西藏自治区重点研发及转化项目“牛主要传染病防治技术研究”（XZ202201ZY0007N-01）。作者简介：苏中华，兽医师，主要从事高原动物传染病防控工作。E-mail：大肠杆菌（UPEC）4-5，可引起牲畜发生乳房炎、子宫内膜炎、腹泻、肠炎、肠毒血症和败血症等，严重时致死6-7。牦牛是西藏重要的特色家畜，在养殖过程中经常受到大肠杆菌病的侵害。研究显示，大肠杆菌与牦牛败血症、肠毒血症以及痢疾等疾病的发生密切相关，对西藏牦牛产业发展造成了严重危害8。那曲地区是西藏自治区重要的牧业区和牦牛养殖区，长期以来由大肠杆菌引西藏牦牛腹泻性大肠杆菌的分离鉴定苏中华1，陈建春2，央珍1，益西旺扎3，曾江勇4，索朗拉吉5，次仁拉姆5，王冬经4（1.西藏自治区动物疫病预防控制中心，西藏拉萨850000；2.西藏自治区昌都市卡若区畜牧站，西藏昌都854000；3.西藏自治区山南市浪卡子县伦布学乡农牧综合服务中心，西藏山南851100；4.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨850000；5.西藏自治区兽医生物药品制药厂，西藏拉萨850000）摘要：为探讨西藏那曲市申扎县牦牛腹泻的原因，本试验无菌采集11份腹泻牦牛粪便样品进行细菌分离培养、染色镜检，对检测菌株的16SrRNA基因进行扩增、测序，序列上传至GenBank进行比对，并使用DNAStar进行同源性分析，构建遗传进化树。分离结果表明，11份样品中共分离出5株菌株，在MAC培养基上菌落呈粉红色，革兰氏染色镜检后发现所有菌株均为阴性且两端钝圆的直杆菌；16S rRNA基因同源性分析结果显示，5株分离株16S rRNA序列同源性在90%以上，与大肠杆菌参考序列的同源性达到95.2%以上；遗传进化树显示，XZ-1、XZ-5分离株与大肠杆菌AT125株、PAK/SA4株亲缘关系较近，XZ-2、XZ-3和XZ-4分离株与大肠杆菌RM13322株亲缘关系较近，经以上鉴定可知分离菌为大肠杆菌。关键词：西藏；牦牛；大肠杆菌；分离鉴定中图分类号：R378.2+1文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）04-0074-072023年 第53卷 第4期75试验研究起的腹泻疾病在当地普遍流行9。2022年冬天，西藏那曲市申扎县部分牦牛出现腹泻症状，为探究那曲市申扎县牦牛的腹泻原因，本研究无菌采集腹泻牦牛的粪便进行细菌分离培养，共得到5株分离菌，通过PCR扩增其16SrRNA序列，并测序比对，最终确定引起牦牛腹泻的病原菌为大肠杆菌，旨在为当地相关部门及时采取有效措施，防控和治疗大肠杆菌引起的牦牛腹泻提供科学依据。材料与方法1.1样品来源无菌采集西藏那曲市申扎县腹泻牦牛粪便11份，置于-20冰箱，保存备用。1.2主要试剂胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、大豆酪蛋白琼脂（TSA）培养基、麦康凯（MAC）培养基、琼脂糖，均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；2TaqPCRMasterMix、DNAMarkerDL5000、核酸染料，均购于TaKaRa公司；50TAE，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技（北京）有限公司。1.3主要仪器生物安全柜，购置于美国Nuaire公司；全温振荡培养箱，购置于苏州培英实验设备有限公司；恒温恒湿培养箱，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；优普超纯水制造系统，购置于成都超纯科技有限公司；电泳仪，购置于北京六一仪器厂；PCR仪、凝胶成像系统，均购置于Bio-Rad公司。1.4病原分离培养与染色镜检将无菌采集的腹泻牦牛粪便样品，置于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，37过夜培养；培养过夜的粪便样品在大豆酪蛋白琼脂（TSA）培养基上进行划线，37培养1618h；挑取单菌落在麦康凯（MAC）培养基上划线，37培养1618h后进行革兰氏染色及镜检。1.516S rRNA基因的PCR扩增按照DNA提取试剂盒的方法提取培养菌液的DNA，4保存备用。参照周婷婷等10和李路茜等11的方法进行PCR扩增，具体方法如下：以提取的分离菌株基因组DNA为模板，上海生工生物工程有限公司合成的16SrRNA基因通用引物为上下游引物进行PCR扩增（引物序列见表1）；反应体系为50 L：上游、下游引物（10 mol/L）各1.0 L，DNA模板2.0 L，2TaqPCRMasterMix25 L，ddH2O补足50 L；反应程序为：94 5min；9430 s，5850s，7290s，30个循环；725min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物送上海生工生物工程有限公司测序。1.6基因同源性及进化树分析测序结果在NCBI上应用BLAST进行16SrRNA基因比对，下载GenBank上已发表的大肠杆菌16SrRNA基因序列作为参考株，以屎肠球菌CAU8318和无乳链球菌ATCC13813为外源参考株（表2），进行同源性比较；采用DNAStar软件构建系统发育树，进行遗传进化分析。结果与分析2.1病原菌的分离培养从11份腹泻牦牛粪便样品中，分离出5株菌基因引物序列（5-3）PCR产物/bp来源16SrRNAF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1500上海生工生物工程有限公司合成R：GGTTACCTTGTTACGACTT表1引物序列762023年 第53卷 第4期试验研究表2参考株信息菌株登录号宿主分离地区大肠杆菌WP2株JQ993869.1鸭子印度大肠杆菌EC9952株CP104595.1人中国大肠杆菌E9株CP104500.1鸡美国大肠杆菌UC4224株CP104472.1奶酪意大利大肠杆菌GS04株CP079772.1鸭子中国大肠杆菌3985株CP103623.1人美国大肠杆菌STEC704株CP101965.1山羊中国大肠杆菌LH09-a株CP100544.1原鸡瑞士大肠杆菌A5株CP028769.1猪中国大肠杆菌KW21株CP117672.1水中国大肠杆菌PAK/SA4株MK778499.1不详巴基斯坦大肠杆菌AT125株OP755949.1不详中国大肠杆菌RM13322株CP050498.1牛美国屎肠球菌CAU8318MF424835.1牛奶中国无乳链球菌ATCC13813NR_040821.1牛奶日本4结果与分析2.1 病原菌的分离培养从 11 份腹泻牦牛粪便样品中，分离出 5 株菌株，在 TSA 培养基上培养发现菌落呈圆形、边缘整齐、半透明状且表面光滑；在 MAC 培养基上，菌落形态呈粉红色、圆形扁平、边缘整齐、表面光滑湿润；革兰氏染色及镜检显示菌株为阴性、两端钝圆的直杆菌。以上结果可初步鉴定分离菌株疑似为大肠杆菌。2.2 16S rRNA 基因 PCR 扩增以 5 株疑似大肠杆菌的纯培养物 DNA 为模板，扩增 16S rRNA 基因，得到 5 条 1 500 bp左右的目的条带（图 1），与预期结果一致，分别编号为 XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4 和 XZ-5。图1 16SrRNAPCR扩增结果株，在TSA培养基上培养发现菌落呈圆形、边缘整齐、半透明状且表面光滑；在MAC培养基上，菌落呈粉红色，圆形扁平、边缘整齐、表面光滑湿润；革兰氏染色及镜检显示菌株为阴性且两端钝圆的直杆菌。以上结果可初步鉴定分离菌株疑似大肠杆菌。2.216S rRNA基因PCR扩增以5株疑似大肠杆菌的纯培养物DNA为模板，扩增16SrRNA基因，得到5条1 500bp左右的目的条带（图1），与预期结果一致，分别编号为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4和XZ-5。2.316SrRNA同源性分析将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果上传至NCBI进行BLAST比对，发现测序序列与GenBank数据库中已发表的大肠杆菌相似性达到99.43%100%。用DNAStar软件将5株分离菌16SrRNA序列与GenBank数据库的参考序列进行同源性分析，发现所选大肠杆菌参考株的16S rRNA序列同源性在98.0%以上，与屎肠球菌和无乳链球菌参考株16S rRNA序列同源性在77.2%以下；5株分离株16S rRNA序列同源性在91.8%以上，与大肠杆菌参考序列的同源性达到95.2%以上，与屎肠球菌和无乳链球菌参考株16S rRNA序列的同源性在75.6%以下（图2）。2.416S rRNA遗传进化分析根据西藏分离株与国内外大肠杆菌不同参考株及屎肠球菌、无乳链球菌参考株16S rRNA序列的同源性分析结果，构建遗传进化树（图3），2023年 第53卷 第4期77试验研究5图 2分离株与参考株 16S rRNA 序列同源性分析2.4 16S rRNA 遗传进化分析根据西藏分离株与国内外大肠杆菌不同参考株及屎肠球菌、无乳链球菌参考株 16S rRNA序列的同源性分析结果，构建遗传进化树（图 3），发现屎肠球菌、无乳链球菌参考株与大肠杆菌参考株、西藏分离株亲缘关系比较远，单独形成一个分支；大肠杆菌参考株与西藏分离株亲缘关系比较近，形成一个大的分支，其中 XZ-1、XZ-5 分离株与大肠杆菌 AT125 株、PAK/SA4 株在一簇，亲缘关系更近，XZ-2、XZ-3 和 XZ-4 分离株与大肠杆菌 RM13322 株在一簇，亲缘关系更近。图2 分离株与参考株16SrRNA序列同源性分析图3 分离株与参考株16SrRNA序列遗传进化树发现屎肠球菌、无乳链球菌参考株与大肠杆菌参考株、西藏分离株亲缘关系比较远，单独形成一个分支；大肠杆菌参考株与西藏分离株亲缘关系比较近，形成一个大的分支，其中XZ-1、XZ-5分离株与大肠杆菌AT125株、PAK/SA4株在一簇，亲缘关系更近，XZ-2、XZ-3和XZ-4分离株与大肠杆菌RM13322株在一簇，亲缘关系更近。讨论3.1大肠杆菌病在西藏牦牛中普遍存在大肠杆菌病是养牛业中一种比较常见的细菌性疾病12，主要引起牛腹泻，尤以犊牛腹泻782023年 第53卷 第4期试验研究最为严重，可导致犊牛死亡，对养牛业危害较大13。西藏牦牛大肠杆菌病是牦牛养殖中最常见、最重要的疾病之一14-15，全年均可发生，但以冬春季为高峰期16。有研究显示，大肠杆菌病在西藏牦牛中的发病率为10.1%，死亡率为2.5%，致死率为45.0%17。近年来，关于西藏牦牛大肠杆菌病的报道较多，陈明勇等9从西藏自然发病牦牛中分离到5株大肠杆菌，经鉴定为O142、O148、O158和O26血清型；王蕾等18从林芝地区565份牦牛粪便样品中分离到488株大肠杆菌，分离率高达86.4%；王刚等19从西藏拉萨、日喀则、山南、林芝、阿里、那曲个地区散养牦牛的腹泻粪便和病死牦牛的肠黏膜中分离到107株牦牛源大肠杆菌；除此之外，还有大量关于藏羊、藏猪、藏鸡大肠杆菌分离鉴定的报道20-22，表明大肠杆菌在西藏地区污染严重，在畜牧业养殖中流行较为普遍。本研究从西藏那曲地区申扎县11头腹泻牦牛粪便样品中分离到5株大肠杆菌，分离率为45.5%，进一步说明大肠杆菌病在西藏牦牛中普遍存在。3.2大肠杆菌病在西藏养殖业中流行的原因结合大肠杆菌生物特性和西藏畜牧养殖业现状，分析导致大肠杆菌病在西藏畜牧养殖业中流行的可能原因：一是与细菌的生活特性有关。大肠杆菌是人和动物肠道的常在菌，是自然环境中非常常见的细菌，是一种条件性致病菌23，常常容易被忽视。大肠杆菌为兼性厌氧菌，对营养要求不高，生长繁殖速度快；宿主种类多，常见的家畜/禽都是其感染的对象，还可以感染野生动物、特种经济动物，甚至水生动物24-27；传播途径广泛，可通过患病和带菌家畜污染的牧草、饮水等经消化道感染28。二是与西藏家畜养殖方式有关。首先西藏牦牛养殖的集约化程度不高，主要以传统放牧散养方式为主，而大肠杆菌在自然环境中分布广泛，导致牦牛接触到大肠杆菌的概率增加；其次西藏牦牛养殖主要依靠天然牧场放牧，而牧草受季节影响较大，西藏农牧民储草补饲意识不强，牦牛冬春季节缺少饲草，免疫力下降，出现“夏壮、秋肥、冬瘦、春死”的现象，使大肠杆菌致病概率增加。三是与日益严重的细菌耐药性有关。西藏农牧民文化水平不高，对细菌的耐药性认识不足，关于细菌耐药性的宣传也不到位，在实际生产中广谱抗菌药滥用的现象仍然较为严重，造成西藏牦牛肠道大肠杆菌的耐药率极高，多重耐药现象较重。贡嘎等29在西藏牦牛大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性研究中发现，西藏牦牛大肠杆菌耐药率达到90.0%以上，多重耐药现象最少为7种，最多达到12种。3.3大肠杆菌病的综合防控措施一是加强饲养管理。圈舍潮湿阴冷、过热过冷、通风不良及饲料营养不足等都会降低牦牛免疫力，增加大肠杆菌感染的风险。因此，要积极营造良好的圈舍环境，做好圈舍通风换气，尤其是冬春季节，增加保暖设施，避免进风，及时储存草料，适当补饲精料，提高牦牛抵抗力，减少大肠杆菌的感染。二是搞好环境卫生。脏乱的圈舍环境更容易滋生大肠杆菌，因此要及时清理圈舍内的家畜粪便，经常更换垫草，增加对圈舍环境、饲喂器具等清洗消毒的频次，减少大肠杆菌的滋生。三是合理使用兽药。积极宣传细菌耐药性的危害，提高农牧民群众的认识；结合当地实际，为农牧民群众提供廉价高效的中兽药、藏兽药防控方案，尽量减少抗菌药的使用；治疗过程中提供多样化的抗菌药，避免长期使用一种抗菌药，提倡精准用药、交叉用药，降低大肠杆菌耐药性。小结本研究对那曲市申扎县采集的腹泻牦牛2023年 第53卷 第4期79试验研究参考文献1PATELJ,YINHB,BAUCHANG,etal.InhibitionofEscherichiacoliO157:H7andSalmonellaentericavirulencefactorsbybenzylisothiocyanateJ.Foodmicrobiology,2020,86(4):103303.2原中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学 检验致泻大肠埃希氏菌检验S.北京:中国标准出版社,2016.3邱正勇,张濛,吴玲玲,等.20152017年河南省食源性疾病致泻大肠埃希菌监测情况分析J.中国食品卫生杂志,2019,31(5):445-448.4徐建国,阚飙,张建中,等.现场细菌学M.北京:科学出版社,2011.5艾伟昌,方忠意,李金磊,等.河南省鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析J.畜牧与饲料科学,2018,39(1):4-7.6CHENW,LIUY,YINJ,etal.Cloning,expression,andimmunogenicityoffimbrial-F17AsubunitvaccineagainstEscherichiacoliisolatedfrombovinemastitisJ.BiomedResearchInternational,2017(2017):3248483.7严勇,李新圃,武小虎,等.牛源大肠杆菌研究进展J.中兽医医药杂志,2020,39(5):35-41.8HONGNINGW,JUANL,LANGT.ThemensurationofdrugresistanceofyaksE.coliJ.ProceedingsofthefourthInternationalCongressonyak,2004(5):34-39.9陈明勇,张冰,陈德成,等.西藏地区牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定J.中国预防兽医学报,2001(5):70-71.10周婷婷,凌晨,张慧敏,等.新疆某牛场大肠杆菌的分离鉴定及16SrRNA序列分析J.中国奶牛,2021(3):30-35.11李路茜,张媛媛,刘海灿,等.16SrDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的价值研究J.中国人兽共患病学报,2015,31(11):1017-1022.12苏战强,马凯琪,佟盼盼,等.1株多重耐药致病性大肠杆菌的分离鉴定与分子分群J.中国畜牧兽医,2019,46(4):1127-1134.13刘少昆.京津部分地区犊牛腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析D.长春:吉林农业大学,2016.14卓玛,赵燕娟,王刚,等.西藏班戈县牦牛源肠产毒性大肠杆菌的毒力基因检测J.甘肃畜牧兽医,2019,49(8):45-50.15卢姊豪,贡嘎,常攀,等.西藏牦牛肠出血性大肠杆菌HPI基因调查及耐药性分析J.江苏农业科学,2022,50(7):51-58.16尚婷婷,张耀相,林青,等.犊牛大肠杆菌病病原的分离鉴定J.动物医学进展,2012,33(6):143-146.17拉珍,索朗斯珠.牦牛大肠杆菌病的研究进展J.畜禽业,2013(8):8-10.18王蕾,郝亚男,童小乐,等.西藏林芝地区牦牛源大肠杆菌的耐药性分析J.中国奶牛,2018(5):35-39.19王刚,罗润波,贡嘎,等.西藏牦牛源大肠杆菌毒力基因检测与分型J.中国兽医学报,2017,37(10):1913-1918.20陈家露,蔡重振,次旦,等.西藏那曲市羊源大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究J.中国畜牧兽医,2019,46(12):3759-3767.粪便进行细菌分离，对分离的5株细菌进行鉴定，通过细菌分离培养和革兰氏染色镜检，初步判断致病菌为大肠杆菌；通过扩增16SrRNA基因序列，在NCBI上进行BLAST比对，并进行同源性、遗传进化分析，确定5株分离菌均为大肠杆菌。（下转第83页）2023年 第53卷 第4期83试验研究参考文献1张永翠,程光民,何孟莲,等.饲粮中添加酵母硒对杜寒杂交羊生长性能、氮代谢、屠宰性能及肉品质的影响J.动物营养学报,2019,31(12):5562-5570.2叶建萍.饲粮中添加酵母硒对育肥猪生长性能、屠宰性能及经济效益的影响J.中国饲料,2020(21):70-72.3李托,屈雷,朱海鲸,等.高羊毛氨酸硒对陕北白绒山羊羯羊生长性能、血液指标、瘤胃发酵、营养物质 表观消化率及氮代谢的影响J.动物营养学报,2022,34(12):7909-7922.4胡成.酵母硒对保育猪生长性能及腹泻防控效果试验J.养猪,2021(1):25-27.5郭元晟,张敏.有机硒对蒙古羊生长性能、抗氧化性能及免疫机能的影响J.饲料工业,2015,36(13):41-45.6马美蓉,贾莉,肖英,等.日粮中添加酵母硒与蛋氨酸硒对湖羊生长性能、羊肉品质及硒沉积的影响J.中国畜牧杂志,2021,57(3):155-158.7贺凤亭.不同水平酵母硒对肉羊生长性能的影响J.特种经济动植物,2022,25(10):9-10+17.8罗霄,方俊,刘刚,等.日粮中添加酵母硒对断奶仔猪生长性能及抗氧化性能的影响J.饲料工业,2015,36(6):6-10.9张春香,岳文斌,张晓峰,等.不同硒水平对山羊生长性能和血液理化指标的影响J.中国畜牧杂志,2007(9):36-39.（编辑：李娜）21王刚,索朗斯珠,强巴央宗.西藏藏猪源大肠杆菌毒力基因检测与分型J.甘肃畜牧兽医,2017,47(6):75-78.22贡嘎,益西措姆,扎西拉姆,等.藏鸡大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究J.中国畜牧兽医文摘,2016,32(7):55-56.23BLANCOM,BLANCOJE,MORAA,etal.Serotypes,virulencegenes,andintimintypesofShigatoxin(verotoxin)-producingEscherichiacoliisolatesfromhealthysheepinSpainJ.JournalofClinicalMicrobiology,2003,41(4):1351-1356.24李怡瑾,邱宇,田思璐,等.林麝肠源和圈舍土源大肠埃希菌的分离鉴定及其耐药基因的检测J.西北农业学报,2020,29(10):1492-150125张艳.虎源大肠杆菌的研究进展J.现代畜牧科技,2022,90(11):33-36.26闫爽,冯涛,王东阳,等.东北地区狐源大肠杆菌耐药性、整合酶及整合子基因的检测与相关分析J.中国预防兽医学报,2022,44(4):439-444.27吴率铭.海豚源致病性大肠杆菌噬菌体分离鉴定及生物特性的研究D.长春:吉林农业大学,2022.28芮亚培,李家奎,邱刚.西藏牦牛大肠杆菌耐药性调查J.中国兽医学报,2015,35(10):1610-1613.29贡嘎,王刚,拉珍,等.西藏牦牛大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性分析J.中国兽医杂志,2014,50(8):80-82.（编辑：张璐）（上接第79页）