新疆和静县羊腐蹄病细菌分离鉴定及耐药性分析_肖开提.pdf

2023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）新疆和静县羊腐蹄病细菌分离鉴定及耐药性分析肖开提1，丁剑1，2，3，古丽娜尔1，李爽1，范冰洁1，张思岚2，付强2，许健3，史慧君2，刘亚涛1*（1.新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，乌鲁木齐830000；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052；3.动物疫病防控全国重点实验室/兰州大学动物医学与生物安全学院/中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730000）摘要：【目的】为了解新疆和静县草原放牧羊腐蹄病致病原因，【方法】2020-2022年采集和静县额勒乌鲁乡夏季草场放牧患腐烂蹄病羊蹄部组织病料和棉拭子样品60份进行病原菌分离鉴定。采用细菌分离、细菌学生化反应、动物实验、药敏试验，细菌鉴定和耐药性分析。【结果】对采集病料进行细菌学分离，共分离到6株细菌混合感染，分别对各菌株进行动物实验，其中3株菌均可引起小鼠死亡，对小鼠的致死率80%。细菌鉴定3株菌分别为坏死杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过荧光PCR鉴定方法确定病料中有节瘤拟杆菌；药敏试验结果显示，4株菌共同对丁胺卡那、头孢西丁、氧氟沙星、氟苯尼考敏感，对环丙沙星、诺氟沙星、头孢吡肟、头孢噻吩敏感性不同，对链霉素、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、头孢呋辛、阿奇霉素、磺胺甲基嘧啶、头孢他啶耐药。【结论】新疆和静县额勒乌鲁乡羊腐蹄病是多种细菌混合感染或继发感染，明确了主要病原菌及其敏感药物，并根据药敏实验结果加其他药物开展治疗，病羊痊愈，为该地区羊腐蹄病的防治提供了科学依据。关键词：巴音布鲁克羊；腐蹄病；细菌鉴定；耐药分析中图分类号：S858.26文献标识码：A文章编号：1003-6377（2023）04-0034-07巴音布鲁克大草原位于和静县城西北部，为典型的高寒草原草场、高寒草甸草场、高寒沼泽草场和山地草甸草场1，是和静县额勒乌鲁乡牧民的夏季草场。在巴音布鲁克草原春秋潮湿多雨季节，羊群长时间的处于泥泞当中，引发羊腐蹄病，给养羊场（户）造成很大的经济损失2。羊腐蹄病又被称为坏死杆菌病，是由坏死杆菌和节瘤拟杆菌混合感染引起的。临床首先表现为趾间皮炎3，在潮湿的多雨季节，草场泥泞，诱发节瘤拟杆菌感染羊，羊蹄长期处于泥泞环境，蹄趾间皮肤造成趾间皮炎，趾间皮肤的损伤为坏死杆菌和其他细菌的感染深层组织创造了条件，从而造成化脓性病变引起蹄部肿胀，造成传染性恶性腐蹄病4。在条件适宜的前提下，对羊感染率是基金项目：新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目“新疆巴音布鲁克羊腐蹄病防治技术的研究”（2020D03018）；新疆维吾尔自治区自然科学基金“新疆巴音布鲁克羊消化道线虫病流行病学调查及耐药性分析”（2021D01B76）；新疆维吾尔自治区教育厅培育类项目“乌鲁木齐市牛羊布病传播风险及经济损失评估”（XJEDU2022P040）。作者简介：肖开提（1966-），男，硕士研究生，研究员，主要从事动物传染病诊断检测防控。E-mail:591588603 通讯作者：刘亚涛（1970-），男，硕士研究生，正高级兽医师，主要从事动物疫病防控。E-mail:收稿日期：2023-05-02，修回日期：2023-05-2510.16863/ki.1003-6377.2023.04.00634100%，但山羊、鹿、牛等很少感染。节瘤拟杆菌是一种革兰氏阴性严格厌氧菌，其中D型节瘤拟杆菌有致病性，有特殊的腐臭味，而且非常难以培养，所以很难确诊。坏死杆菌也是一种革兰氏阴性严格厌氧菌，具有多种晶体形态，在不同的营养状态，该菌可表现出不同的形态，于新形成的患病组织中或幼龄培养物中常常呈现长丝状，在营养琼脂平板和老龄培养物中多呈现为球形或短杆形5。显微镜下进行观察，可以看到长丝状和短杆状两种形态6。坏死杆菌能够独立引起感染，也能与其它病原体（尤其是化脓曲霉菌和利氏卟啉单胞菌）协同感染7，可通过粪便传播。多雨季节，潮湿的充满泥泞粪便的羊圈为D型节瘤拟杆菌感染创造条件，而泥泞的粪便又为坏死杆菌感染真皮和深层组织创造了厌氧环境3。为了解巴音布鲁克草场羊群腐蹄病的致病原因，2020-2022年采集患腐蹄病病羊的组织样品和棉拭子样品进行细菌分离鉴定，检测其致病性和耐药性，为当地巴音布鲁克羊腐蹄病的防治提供基础，提出适合本地区的最佳防治方案，以期促进地方畜牧业的健康发展。1材料与方法1.1病料来源2020-2022年采集和静县巴音布鲁克草原患趾间皮炎、腐蹄病病羊蹄痂和腐烂蹄肢等部位病料组织和棉拭子共计60份，采集时清洗患病羊蹄肢病变组织，去除污泥，无菌采集病料样品，放入装有BHI液体培养基试管中，低温运送至实验室。1.2主要试剂与仪器鲜血琼脂培养基、厌氧液体培养基、营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、营养肉汤、麦康凯培养基均购自北京陆桥生物科技有限公司；自制厌氧肉肝汤培养基；焦性没食子酸、10%氢氧化钠、细菌鉴定卡、药敏卡均购自新疆恒利达科技；微量生化管、药敏片购自杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染液（杭州微生物试剂有限公司）；VITEK2Compact 全自动微生物生化鉴定及药敏系统（梅利埃）；QuantStudio 5 Real-Time荧光定量PCR仪;高效液相质谱仪（SCIEX）；46周16 g左右BALB/c小鼠（雌雄不分）购自新疆医科大学实验动物中心。1.3细菌的分离培养将采集的60份病料组织和棉拭子每两份病料为一组分别接种于营养肉汤培养基和肝片肉汤厌氧培养基内，37，24 h进行增菌培养；观察培养结果，染色镜检，分别挑取厌氧和需氧培养物再分别接种于鲜血琼脂培养基、营养琼脂培养基上分别进行需氧和厌氧分离培养，厌氧培养主要采用焦性没食子酸厌氧培养法置于厌氧袋中37 恒温分离培养24 h；分别接种于SS琼脂培养基、麦康凯培养基上，置于37 恒温进行鉴别分离培养24 h；观察菌落形态，挑取单个不同形态菌落进行革兰氏染色镜检观察，按照此操作直至细菌分离纯化到单个菌落。1.4动物实验取12只BALB/c小鼠随机分为6组，其中5组为攻毒组，另一组为对照组。攻毒组分别经腹腔注射培养获得5株纯培养物，每只注射0.2 mL，12 h观察一次并记录各组小鼠发病和死亡的情况。1.5生化鉴定1.5.1VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统细菌鉴定无菌挑取动物试验培养物，分别根据菌落革兰氏染色和生长特性接种于不同的细菌鉴定卡和药2023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）352023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）敏试验卡中，置于VITEK2Compact细菌鉴定仪上进行检测，记录生化检测表结果。1.5.2微量发酵管生化试验挑取VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统库中检测不到的一株革兰氏阴性厌氧菌分别接种葡萄糖、半乳糖等10余种糖类进行微量发酵管生化试验，同时开展硝酸还原、靛基质、明胶分解、凝乳等试验5。1.6药敏试验取革兰氏球菌和革兰氏阴性杆菌接种于4.5%生理盐水，按药敏卡比浊浓度要求稀释至0.65麦氏单位，并分别接种球菌和阴性杆菌药敏卡中，置于VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统中读取药敏结果；由于革兰氏阳性厌氧杆菌没有相应的药敏卡，故进行纸片法药敏实验，无菌挑取单个致病性菌落按上述方法调整比浊浓度并均匀涂于营养琼脂培养基上，将17种药敏片（环丙沙星、诺氟沙星、头孢噻吩、氟苯尼考、氧氟沙星、链霉素、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、头孢吡肟、丁胺卡那、头孢呋辛、先锋、阿奇霉素、磺胺甲基嘧啶、头孢他啶、头孢西丁）间隔24 mm均匀贴在几个培养基上按焦性没食子酸厌氧培养法置于厌氧袋中37 恒温培养24 h，观察并测量抑菌圈直径。药敏结果参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判定3。1.7荧光PCR鉴定用全自动核酸提取仪提取分离到致病菌的病料组织基因组DNA，以提取的细菌基因组DNA为模板，根据坏死杆菌和节瘤拟杆菌探针法荧光定量 PCR 试剂盒说明书进行体系配制和PCR扩增。2结果2.1细菌的分离镜检从30组培养物中分离到5株细菌，菌在营养琼脂培养基上呈光滑、微隆起白色菌落，在麦康凯培养基上呈红色菌落；菌在营养琼脂培养基上呈透明菌落；菌在麦康凯培养基上不生长，在鲜血琼脂上呈灰白色圆形菌落，无溶血环；菌在鲜血琼脂上呈灰白色不透明菌落，溶血；菌在营养琼脂培养基上呈边缘整齐的透明菌落，在鲜血培养基上呈光滑隆起灰白有溶血环的小型菌落。分别挑取各分离菌落进行革兰氏染色、镜检可见中等大小革兰氏阴性杆菌（图1）；呈单个或成对或链状革兰氏阳性球菌（图2）；稍长革兰氏阳性杆菌（图3）；呈不规则的葡萄串或单个革兰氏阳性球菌（图4）；呈单个或丝状革兰氏阴性长杆菌5（图5）。图1增菌培养物（1 000）图2革兰氏阳性球菌（1 000）362023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）图3革兰氏阳性杆菌（1 000）图4革兰氏阳性球菌（1 000）图5革兰氏阴性杆菌（1 000）2.2动物试验结果注射革兰氏阴性长杆菌、革兰氏阴性中等杆菌和不规则的葡萄串或单个革兰氏阳性球菌的试验小鼠均在12 h内死亡，其余2组和对照组小鼠没有死亡，对死亡小鼠进行解剖、细菌分离染色镜检得到与注射菌相同的菌株。对照组无异常。2.3 生化鉴定结果2.3.1VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统细菌鉴定VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定结果显示：菌赖氨酸脱羧酶、半乳糖酸盐、酚红、甘露醇、麦芽糖、吲哚、-半乳糖苷酶、葡萄糖、L-阿拉伯糖、a-半乳糖苷酶、海藻糖、鼠李糖、-葡萄糖酸酶试验反应为阳性，鉴定结果菌为大肠杆菌；菌D-乳糖、D-半乳糖、D-甘露醇、麦芽糖、D-果糖、蔗糖、D-海藻糖、D-核糖产酸试验反应为阳性，D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖产酸试验反应为阴性，鉴定结果菌为金黄色葡萄球菌（图6）。图6金黄色葡萄球菌鉴定结果2.3.2微量发酵管生化试验葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、淀粉产酸试验均为阴性。不还原硝酸盐、产生靛基质、不分解明胶、胨化凝固牛乳等试验符合坏死杆菌生化特性8。2.4荧光PCR鉴定病料增菌培养物，在全自动核酸提取仪上提取核酸，用坏死杆菌和节瘤拟杆菌荧光PCR试剂盒进行PCR鉴定，核酸结果呈阳性（见图7）。372023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）图7节瘤拟杆菌荧光PCR扩增曲线2.5药敏试验结果药敏卡和纸片法显示共同对丁胺卡那、头孢西丁、氧氟沙星、氟苯尼考敏感，对环丙沙星、诺氟沙星、头孢吡肟、头孢噻吩敏感性不同，链霉素、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、头孢呋辛、阿奇霉素、磺胺甲基，头孢他啶耐药。3治疗2023年3月中旬选取和静县额勒乌鲁乡察汗乌苏村牧民布仁才此克和铁木尔巴图两家的病羊开始实验性治疗，首先我们要求两户牧民加强对圈舍及其运动场所的环境管理，保持其通风、干燥，及时清理粪便和淤泥，同时加强定期消毒，我们和畜主共同完成了对圈舍环境卫生的清理、整治、消毒工作，合理搭配饲料，加强营养，在饮水和饲料中添加微量元素等多种维生素，保障足够微量元素和维生素补充，在健康羊群圈舍周围及出入口撒熟石灰且经常更换，在羊圈舍的出入口挖深10 cm长宽各2 m的药浴池垫付塑料防止渗漏。加入5%10%硫酸铜溶药液对健康羊进行预防治疗11。对已患腐蹄病的羊只选用药敏实验敏感性强的广谱抗菌药第三代氯霉素类药氟苯尼考和第三代头孢菌素类药头孢噻呋钠注射液外加抗过敏、抗炎、抗风湿药物地塞米松和抗坏血病、慢性病辅助治疗药物的维生素C进行全身治疗，同时对蹄患病处用锰酸钾、75%酒精、双氧水碘酊、松节油等防腐药物对症治疗，包扎伤口外加防水塑料以防重复感染。通过710 d的治疗和预防工作，两家羊群中腐蹄病病羊全部治愈且没有发生新病例。4讨论因节瘤拟杆菌严格厌氧，且对培养基的要求高，如在含胰胳消化物或加0.020.05 mol/L精氨酸和10%马血清并在10%二氧化碳条件下培养才能生长，用常规培养基没有分离到该菌，但通过荧光PCR鉴定，证明这些病料当中有节瘤拟杆菌感染5，6。用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统阴性细菌鉴定卡、厌氧阴性细菌鉴定卡都没有读出结果的一株革兰氏阴性厌氧菌，改用微量发酵管生化试验和硝酸还原、靛基质、明胶分解、凝乳等试验，试验结果符合 伯杰氏系统细菌学手册 报道的坏死杆菌生长特性、细菌形态与生300.000275.000250.000225.000200.000175.000150.000125.000100.00075.00050.00025.0000Rn2468101214161820222426283032343638404244Cycle382023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）化鉴别特征8，节瘤拟杆菌因为是通过荧光PCR鉴定，没有分离到单个菌株所以没有进行生化鉴定。旧版本的资料显示羊腐蹄病发病原因是坏死杆菌先在趾间皮肤造成趾间皮炎破坏真皮层然后是节瘤拟杆菌感染深层组织4，这和新近出版的一些资料解释的病因刚好相反5，如果认真分析发病过程，是在潮湿多雨的季节或者冰雪融化的春季，圈舍和草场泥泞诱发寄生的结瘤拟杆菌感染羊长期泡在水中遭破坏的趾间皮肤，造成趾间皮炎，趾间皮肤的破坏为坏死杆菌和其他细菌的感染深层组织创造条件，从而使羊蹄部深层组织坏死化脓性感染导致蹄部肿胀，引起传染性恶性腐蹄病3，7。用VITEK2Compact全自动微生物生化鉴定及药敏系统药敏鉴定结果和常规制片法药敏试验对上述几种菌共同敏感的药物为丁胺卡那、头孢西丁、氧氟沙星、氟苯尼考敏感，对环丙沙星、诺氟沙星、头孢吡肟、头孢噻呋钠敏感性不同，对链霉素、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素头孢呋辛、阿奇霉素、磺胺甲基、头孢他啶耐药。而本次药敏试验所指敏感药物丁胺卡那、头孢西丁、氧氟沙星、呋喃妥因等几种都是人用药品，很难在市面上购买到，所以选用氟苯尼考和头孢噻呋钠加其他药物治疗。耐药性的产生使得药物治疗的作用局限性大，因此疾病预防显得尤为重要，畜主应努力提高饲养环境生物安全水平，提高饲养人员防病意识，加强日常消毒措施9。对于治疗预防该病，首先要加强对圈舍及其运动场所的环境管理，保持其通风、干燥，及时清理粪便和淤泥，同时加强定期消毒，在条件允许的情况下改用机械运输转场以避免长途跋涉转场对羊蹄造成的损伤10，同时建议科学饲喂，合理搭配饲料，加强营养，保障饲料中有足够微量元素和矿物质，在健康羊群圈舍周围及出入口撒熟石灰且要经常更换，而对已发病羊群选择敏感药物进行全身性治疗的同时对蹄部用锰酸钾、双氧水碘酊、松节油等药物针对性治疗，同时在羊圈舍的出入口安置5%10%硫酸铜溶液药浴池进行预防治疗11。5 结论根据分离到的4株致病菌的培养特性、形态及染色特征、生化特性、动物实验、细菌鉴定、荧光PCR鉴定结果，结合临床症状、剖检变化、药敏结果可以判定新疆和静县额勒乌鲁乡夏季草场区域羊腐蹄病和资料显示的一样，是由坏死杆菌、节瘤拟杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌混合感染和感染深层组织造成的。参考文献：1 梅晓红，吴春焕.巴州草原保护建设利用取得的成就及存在的问题J.当代畜牧，2016（33）：39-43.2 丁剑，古丽娜尔，张继红，等.新疆巴音布鲁克羊腐蹄病的细菌分离及鉴定J.草食家畜，2023（02）：38-41，53.3 CynthoaM.Kahn Scott Line，et al.默克兽医手册M.北京：中国农业出版社，2016.4 朱刚.羊腐蹄病的诊疗及防治措施J.中国畜牧业，2022（22）：108-110.5 孔宪刚.兽医微生物学M.北京：中国农业出版社，2013.6 杨旭夫.陈乃昌，等.兽医微生物学M.北京：中国农业出版社，1998.7 费恩阁，等.动物传染学M.北京：中国农业出版社，1995.8 东秀珠.蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册M.北京：北京科学出版社，2001.9 朱兆荣，刘娟，刘涛，等.畜牧兽医行政管理与执法司法M.重庆：重庆大学出版社，2014.392023年7月 第4期（总第221期）草食家畜（双月刊）10 刘娜.羊腐蹄病微生物多样性及主要病原菌分离与耐药性分析D.黑龙江八一农垦大学，2015.11 达能太，李国中.动物中毒病防治手册M.银川：宁夏阳光出版社，2015.Bacteria Isolation and Identification of Sheep Foot Rot Disease in HejingCounty of Xinjiang and Analysis of Drug ResistanceXIAO Kaiti1，DING Jian1，2，3，GULINAER1，LI Shuang1，FAN Bingjie1，ZHANG Silan2，FU Qiang2，XU Jian3，SHI Huijun2，LIU Yatao1*（1.Xinjiang Center for Animal Disease Prevention and Control,Urumqi830000,China；2.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China；3.State Key Laboratory of Animal Disease Prevention and Control,College of Veterinary Medicine and Biological Safety,LanzhouUniversity,Lanzhou Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730000,China）Abstract:【Objective】In order to find out the causes of foot rot disease in grassland grazing sheep in Hejing County,Xinjiang.【Methods】A total of 60 samples consisting of histopathological tissues and cotton swabs from sheeps hooves grazing in summerpasture land in Hejing county were collected from 2020-2022 for isolation and identification of pathogenic bacteria.Specifically,the following items were carried out:bacteria isolation,biochemical reaction,animal challenge experiment,drug sensitivity test,bacteria identification and drug resistance analysis.【Results】The results showed that a total of 6 strains of bacteria were isolatedfrom the collected samples,among them,3 strains could cause death in mice,and the fatality rate was 80%.The 3 isolates wereidentified as Necrobacillus,Staphylococcus aureus and Escherichia coli.In addition,Bacteroides nodularis was detected out byfluorescent PCR.The results of drug sensitivity test showed that the above four strains were sensitive to amikacin,cefoxitin,ofloxacin,and florfenicol,resistant to streptomycin,penicillin,ampicillin,amoxicillin,kanamycin,cefuroxime,azithromycin,sulfamethazine,ceftazidime,and showed different sensitivity to ciprofloxacin,nofluxacin,cefepime and cephalothiophene.【Conclusion】The mixed infection or secondary infection of a variety of bacteria caused the sheep foot rot disease in Hejing county.The sheep were cured after drug administration according to the results of drug sensitivity test.The study would provide a scientificbasis for the prevention and control of sheep foot rot disease.Key words:Bayinbrook sheep;foot rot disease;bacterial identification;drug resistance analysis40