北虫草菌糠中多糖的提取及成分测定.pdf

DOI：10.13876/J.cnki.ydnse.230050第 42 卷 第 3 期2023 年 9 月延安大学学报（自然科学版）Journal of Yanan University（Natural Science Edition)Vol.42 No.3Sep.2023北虫草菌糠中多糖的提取及成分测定冯辽辽1，2，马一翔2，刘广平2，黄琰莹2，刘萱2，贺晓龙1，2（1.陕西省黄土高原菌产业生态循环发展工程技术研究中心；2.延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000）摘要：优化北虫草菌糠中多糖的提取工艺，测定北虫草菌糠中多糖的含量，期望为全面开发利用北虫草菌糠提供一定的理论依据。以北虫草菌糠为原料，利用水提醇法提取菌糠中的多糖，通过响应面法研究了提取时间、温度、料液比对北虫草菌糠中多糖的提取率及提取量的影响，并用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生法研究了菌糠中多糖的组成及比例。北虫草菌糠中多糖的最佳提取条件是温度为55，料液比为1 30，提取时间为1 h，得到多糖的提取率为13.95%，多糖含量为279 mg/kg，并提取得到12种单糖。此提取工艺可以用于后续的免疫活性物质的提取研究。关键词：北虫草菌糠；虫草多糖；响应面法中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1004-602X（2023）03-0029-06北虫草（Cordyceps militaris）又称为北冬虫夏草和蛹虫草，是我国的一种传统食药用真菌，隶属于子囊菌门的虫草属，具有天然的药用价值和营养价值1，其主要活性成分之一是北虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides，CMP）。菌糠作为培养北虫草的固体培养基，在其收获后往往残留大量的菌丝体，同样含有北虫草的多种有效成分，如虫草多糖、虫草素、氨基酸、Fe、Ca、Zn、Mg等微量元素及一些食用菌生长的代谢产物2-8，含量接近于子实体中的一半，且具有数量庞大价格低廉的优势。JAYAKUMAR等9研究发现，从虫草中提取的多糖CME-1有抗癌作用；谭超杰等10发现北虫草多糖是北虫草的抗疲劳主要活性成分；李志涛等11发现在一定的剂量内，提取到的蛹虫草多糖能明显促进小鼠脾细胞的增殖，表明蛹虫草多糖具有免疫调节活性的作用；多糖可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖值12。目前，CMP 主要从北虫草的子实体中提取获得，但北虫草的子实体有限，且现有方法的提取率均较为有限。现有研究对北虫草多糖的提取主要集中于以子实体为原料，而对菌糠中的有效成分提取和测定则尚无成熟工艺，导致培养北虫草过程中所产生的大量菌糠都作为了废弃培养料，没有得到高效利用，由此造成资源浪费和环境污染。本文以废弃北虫草菌糠为原料，采用水提醇法提取多糖，并对其成分进行测定。1材料与方法1.1 材料 北虫草菌糠（延安大学食用菌实验室培养北虫草后收集）。1.2 仪器 RE-52CS旋转蒸发仪（上海亚荣）；JP-040S超声清洗仪（深圳洁盟）；DZF-6020D电热恒温干燥箱（上海齐欣）；JY96-IIN 小型粉碎仪（宁波新芝）；DK-8D电热恒温水浴锅（上海一恒）；UW-620H电子 天 平（日 本 岛 津）；Agilent 1100 液 相 色 谱 仪（HPLC，安捷伦）。1.3试验方法1）北虫草菌糠预处理收稿日期：2023-07-24基金项目：陕西省科技计划项目（2023-YBNY-277）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（S202210719124）；延安大学大学生创新创业训练计划项目（D2021114）作者简介：冯辽辽（1988），女，陕西子长人，延安大学实验师。生物与生态科学 延安大学学报（自然科学版）第 42 卷 将北虫草菌糠放在托盘上，65 干燥至恒重。待菌糠完全干燥后，利用粉碎仪粉碎，然后用80目筛网过筛，弃去滤渣，收集北虫草菌糠粉末，室温密封保存备用。2）水提醇沉法提取多糖称取 2 g 北虫草菌糠粉末，依据 1 10、1 20 和1 30不同的料液比加入纯净水，室温浸泡1 h后，分别在55、65 和75 下熬煮0.5 h或1 h，自然冷却，4层纱布过滤不溶性滤渣，收集滤液；80 旋转蒸发浓缩滤液，待滤液完全干燥后，加入2 mL纯净水，超声助溶，使旋转蒸发瓶内壁上的干燥提取物完全溶于纯净水中；将蒸发瓶中2 mL 纯净水溶液与95%乙醇以1 4的比例混匀，4 静置24 h；将纯净水和95%乙醇的混合液4 000 rpm离心10 min，弃沉淀，取上清液加入玻璃培养平皿上，65 烘干液体，称重并记录，计算北虫草菌糠中虫草多糖的提取率。提取率的计算公示为：提取率（%）=上清液烘干后平皿质量（g）-加上清液前平皿质量（g）/菌糠质量（g）100%。3）响应面分析选择最佳的提取条件根据前面3组不同的提取效果，以北虫草菌糠中多糖提取率（L）为响应值，根据 Design-Expert12软件中Box-Behnken实验原理，进行响应面分析。1.4多糖成分鉴定将北虫草菌糠中提取出来的多糖（培养皿上图 1，图 1 红色箭头所指黄色的部分）溶于纯净水中，冷冻干燥获得北虫草多糖的粉末，送公司使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生法，HPLC检测北虫草多糖的组成及比例。1）多糖样品水解称取20 mg多糖样品，置于50 mL离心管中，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液5 mL后，充N2封管后，在100 的烘箱中水解2 h，冷却后打开盖，取1 mL 后再加入1 mL甲醇，在70 水浴下用N2吹干，重复加甲醇并用N2吹干2次去除TFA，最后加入0.3 mol/L的NaOH溶液1 mL，对残渣进行充分溶解。2）单糖衍生取400 L混合单糖标准液和多糖水解液，放于5 mL 试管中，再加入 400 L PMP 甲醇溶液混匀；70 水浴反应 2 h后，取出并放置冷却至室温，加0.3 mol/L的HCl溶液400 L，再加水1 200 L后，再加入等体积氯仿摇匀静置，弃去氯仿相，重复2次，将水相过 0.45 m水系微孔膜，供HPLC分析。3）检测条件以古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和、岩藻糖作为单糖标准品，100 mmol/L磷酸钠缓冲液（A液）和乙腈（B液）作为流动相，使用250 mm4.6 mm，粒度5 m的C18色谱柱，30 柱温，250 nm波长，1 mL/min流速，进样量 5 L，用 A 液和 B 液不同比例进行洗脱（表2）。4）数据处理实验结果均为3次平行实验，GraphPad Prism 6 图1不同温度不同料液比提取0.5 h后的北虫草多糖注：首位的1、2、3依次表示提取温度为55、65 和75；末尾的1、2、3依次表示料液比为1 10、1 20和1 30。表2洗脱程序步骤1234567洗脱液比例/%A86837850508686B14171250501414洗脱时间/min109282931323630第 3 期冯辽辽 等：北虫草菌糠中多糖的提取及成分测定软件用于统计计算，ANOVA 单因素方差分析用于实验组内比较，Design-Expert12软件进行全面分析。2结果与分析2.1提取0.5 h时温度和料液比对多糖提取的影响从表3可以看出，在同样的温度下，随着料液比的升高，北虫草菌糠中多糖的提取质量逐渐升高，提取得率也相应的升高；在同样的料液比下，随着温度的升高，北虫草菌糠中多糖的提取率逐渐降低。从图1可以看出，3种不同温度下提取0.5 h后，不同液料比提取上清液烘干后北虫草菌糠中多糖在平皿上的残留痕迹，通过计算含有残留北虫草菌糠中多糖平皿与未添加提取上清液前平皿的质量差值，得到3种温度下，不同液料比提取0.5 h后多糖的含量。研究结果表明，料液比为1 30，55 时获得的北虫草菌糠中多糖的质量最高，为 0.2550.004 g，提取率为12.75%。2.2提取1 h时温度和料液比对多糖提取的影响从表4可以看出，在同样的料液比下，随着温度的升高，北虫草菌糠中多糖的提取质量逐渐降低，提取率也相应的降低；但在同样的温度下，随着料液比的升高，多糖的提取质量逐渐升高，提取得率也相应的升高。研究表明，料液比为1 30，55 时获得的多糖质量最高，为0.2790.005 g，提取率为13.95%。2.3响应面优化设计实验响应面分析实验中影响因素和结果如表 5 所示。由表6可以看出，提取率L值所建立的二次多项模型如下：L9.46-1.75A-0.175B15C+0.15AB-0.09AC0.25BC0.582A2+0.207B2-1.09C2，式中A为温度，B为提取时间，C为料液比，校正系数0.917 3，R20.963 8，回归方程充分拟合。各因子对提取率L值的影响为：CAB，其中，C、A及和二次元项C2的影响非常显著，而交互项AB、AC和BC的影均不显著，说明A、B、C对提取率L值的综合影响并非线性关系。2.4不同提取条件组合对多糖提取率的影响由图2可以得出，检验交互项对提取率L值的影响之中，发现提取温度和料液比之间的交互作用（图2B）明显优于提取时间和液料比的交互作用（图2C）以及温度和提取时间的交互作用（图2A），吻合于方差分析结果。表43种不同温度下提取1 h获得的多糖质量与提取率料液比1 101 201 30温度/55质量/g0.1790.0060.2390.0110.2790.005提取率/%8.9511.9513.9565质量/g0.1190.0090.1970.0040.1990.006提取率/%5.959.859.9575质量/g0.0940.0140.1820.0070.1960.007提取率/%4.709.109.80表33种不同温度下提取0.5 h获得的多糖质量与提取率料液比1 101 201 30温度/55质量/g0.1690.0080.2340.0120.2550.004提取率/%8.4511.7012.7565质量/g0.1450.0070.1950.0090.2230.007提取率/%7.259.7511.1575质量/g0.0840.0110.1650.0060.1840.008提取率/%4.208.259.20表5响应面分析实验设计方案及结果试验号1234567891011121314151617运行9310812711516171314115624A/5575557555755575656565656565656565B/h0.50.5110.750.750.750.750.510.510.750.750.750.750.75C1 201 201 201 201 101 101 301 301 101 101 301 301 201 201 201 201 20L/%11.708.2511.959.108.654.6013.129.437.255.9511.159.959.239.359.759.119.8731延安大学学报（自然科学版）第 42 卷 通过Design Expert软件，能够得出数学模型的二次回归方程，结合二次回归方程能计算出北虫草菌糠中多糖的最佳提取方法：温度为55，液料比为1 30，提取时间为0.5 h，此时提取率的预测L值为 13.26。重复 3次后得到提取率实测 L值平均为13.40，和预测值并没有显著的差异，证明该模型是正确的，使用响应面分析有助于北虫草菌糠中多糖提取方工艺的优化。2.5多糖的HPLC分析以 14种单糖标准品（200 mg/L）混合制备标样进行液相色谱分析，在1530 min之间检测出14种单糖的标准图谱（见图3），分别为古洛糖醛酸、甘露糖醛酸，甘露糖，核糖，鼠李糖，氨基葡萄糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，氨基半乳糖，木糖，半乳糖，阿拉伯糖，岩藻糖。将实验中提取到的多糖样品进行HPLC分析，结果如图4和表7所示。多糖样品中检测共到了12种单糖，未发现甘露糖醛酸、和氨基半乳糖。其中葡萄糖的含量最高为986.05 mg/g，在 12 种单糖中最高，古洛糖醛酸的含量最低为0.23 mg/g。多糖的成分多于标准品的成分，表明其复杂程度要高于标准品，还需进一步纯化。表6菌糠多糖提取率方差分析组合模型A/B/hCABACBCABC残差失拟项误差项总回归平方和68.3224.640.245 036.980.090 00.032 40.002 51.420.179 55.032.56120.439 770.88自由度911111111173416均方7.5924.640.245 036.980.090 00.032 40.002 51.420.179 55.030.366 30.708 10.109 9F20.7267.270.668 9100.960.245 70.088 50.006 83.890.490 213.756.44P0.000 30.000 10.440 40.000 10.635 30.774 80.936 50.089 30.506 40.007 60.051 9显著性*注：*表示P0.05差异显著；*表示P温度时间，其中料液比、温度和二次元项C2（料液比）的影响非常显著，这与姜慧明等19研究的提取温度对响应值的影响比水料比显著结果不一致。3.2多糖的成分分析在北虫草菌糠中提取出来的多糖样品中共检测到了12种单糖，比14种单糖制备混合品少了甘露糖醛酸、氨基半乳糖，比标准样品多了核糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖四种单糖，可能的原因是同一培养程序，材料的差异、培养时间的长短、培养基、提取方法等因素的影响，其多糖得率也有差异21.因此，建立规范化、标准化的培养程序以获得稳定且培养阶段一致的北虫草菌糠样品是稳定多糖含量必需的。4结论温度、料液比对北虫草多糖提取率均有极显著影响，但其综合影响并非线性关系；北虫草菌糠提取多糖含量的最佳提取条件是温度为 55，液料比为 1 30，提取时间为 1 h，在此条件下，得到北虫草菌糠中多糖的提取率为 13.95%，多糖含量为279 mg/kg；在北虫草菌糠中共检测到多糖12种，其中葡萄糖的浓度最高为986.05 mg/g，古洛糖醛酸的浓度最低为0.23 mg/g。参考文献：1 左锦辉，贡晓燕，董银卯，等.蛹虫草的活性成分和药理作用及其应用研究进展J.食品科学，2018，39（21）：330-339.2 崔琳琳，袁甜，王洋，等.虫草素的抗肿瘤与抗转移作用的研究进展 J.食品工业科技，2021，42（4）：356-362.3 LEE J S，HONG E K.Immunostimulating activity of the polysaccharides isolated from Cordyceps militaris J.International Immunopharmacology，2011，11（9）：1226-1233.4 李海霞，王玲，李向培，等.不同剂量蛹虫草子实体对慢性疲劳综合征的改善作用 J.中国食用菌，2020，39（6）：49-52.5 江海涛，任源浩，吴雨龙，等.蛹虫草多糖对小鼠抗疲劳作用的研究 J.食用菌学报，2014，21（3）：55-59.6 LIU J Y，FENG C P，LI X，et al.Immunomodulatory and antioxidative activity of Cordyceps militaris polysaccharides in mice J.International Journal of Biological Macromolecules，2016，86：594-598.7 王立强，黄竹青，于淼，等.北虫草提取物抗衰老作用的初步研究 J.解放军预防医学杂志，2014，32（6）：487-489.8 金田，石俊英.近五年北虫草药理作用研究进展 J.食品与药品，2011，13（9）：358-361.9 HUANG Y K，SHEU J R，JAYAKUMAR T，et al.Anti-cancer effects of CME-1，a novel polysaccharide，purified from the mycelia of Cordyceps sinensis against B16-F10 melanoma cells J.Journal of Cancer Research and Therapeutics，2014，10（1）：43.10 谭超杰，王博，邹文奇，等.中药组合物多糖的提取工艺及抗氧化活性研究 J.北华大学学报（自然科学版），2022，23（2）：218-224.11 李志涛，孙金旭，刘海鹏，等.蛹虫草多糖的提取及对小鼠脾细胞增殖的影响 J.食品研究与开发，2020，41（2）：117-123.12 杨灵丽，龚荣英，罗成浩，等.基于网络药理学和分子对表7HPLC多糖检测结果单位：mg/g样品北虫草菌糠中多糖10.2320.00355.2140.15515.8361.0570.5581.659986.05100.00117.521244.751326.191418.24注：样品编号代表单糖，同图3注。33延安大学学报（自然科学版）第 42 卷 接探讨蛹虫草对糖尿病作用机制研究 J.贵州科学，2023，41（1）：53-59.13 王小爱，梁建东，高小娇，等.细脚虫草多糖液体发酵及分离纯化工艺研究 J.食品与机械，2020，36（11）：158-164+216.14 黄振峰，尹导群，陈丽，等.蛹虫草菌丝体胞内多糖提取方法的研究 J.华南师范大学学报（自然科学版），2018，50（6）：69-74.15 高峰，于亚莉，刘静波，等.水法提取北冬虫夏草多糖的工艺研究 J.食品科技，2010，35（8）：213-216.16 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research aims to provide some theoretical basis for the comprehensive development and utilization of Cordyceps sinensis cultivated chaff.Taking the spent mushroom substrate of Cordyceps sinensis as materials，polysaccharides were prepared from water extraction and alcohol precipitation method.The effects of extraction time，temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate and amount of Cordyceps sinensis bran were studied by responsesurface method，and the composition and proportion of polysaccharides were measured by PMP derivations.The results showed that the optimum extraction conditions were 55，1 30 liquid-solid ratio and 1 h extraction time.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharide was 13.95%，and the concentrationof polysaccharide was 279 mg/kg.Twelve polysaccharides were obtained.The optimized extraction method can be used for subsequent studies on immunologically active substances.Key words：Cordyceps militaris fungus chaff；Cordyceps polysaccharide；response surface method34