异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响.pdf

动物营养学报，（）：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响任海伟，黎金莲 南亭植 卢娜娜 郭晓鹏 陆 栋 刘瑞媛 张丙云（兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州；西北低碳城镇支撑技术省部共建协同创新中心，兰州；中国科学院近代物理研究所，兰州）摘 要：本试验旨在探究添加异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的动态影响，并采用隶属函数法对青贮质量进行综合评价，以筛选适宜添加剂。试验设置纤维素酶组（组）、异常毕赤酵母组（组）、异常毕赤酵母纤维素酶组（组）个添加剂组和 个空白对照组（组），分别于青贮第、和 天时对其感官质量、常规营养成分含量、发酵品质以及微生物群落结构进行分析。结果表明：）个添加剂组酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量在青贮第 天时均显著低于 组（），相对饲喂价值显著高于 组（）。组在青贮第 天时可溶性碳水化合物、粗蛋白质和淀粉含量均显著高于其他 个组（），主要营养成分保存良好。）整个青贮过程中，个组、氨态氮 总氮值以及有机酸组成和含量均处于优良青贮范围。基于隶属函数法分析发现，青贮第 天时 组隶属函数值平均值最高，青贮质量综合评价效果最好。）个组在属水平上的微生物群落包含泛菌属（）、明串珠菌属（）和肠杆菌属（）以及少量乳杆菌属（）、沙雷氏菌属（）、片球菌属（）和葡糖杆菌属（）等 个属。组在整个青贮期间乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、魏斯氏菌属（）、双歧杆菌属（）和肠球菌属（）等 种乳酸菌总相对丰度为 ，同时含有较高相对丰度的泛菌属和葡糖杆菌属，通过优化细菌群落结构形成了一种新的稳定的青贮微生态体系。综上所述，添加异常毕赤酵母可以明显改善甜高粱的青贮质量，有望成为一种经济高效且适用于甜高粱的专用青贮添加剂。关键词：甜高粱；异常毕赤酵母；纤维素酶；青贮质量；微生物多样性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；甘肃省自然科学基金重点项目（）；中国博士后科学基金项目（）作者简介：任海伟（），男，山西孝义人，教授，博士，主要从事农产品加工副产物综合利用研究。：通信作者：张丙云，副教授，硕士生导师，：随着我国居民生活品质的提升和消费升级，畜产品市场需求呈现刚性增长，动物饲料需求随之持续增加，进口量大幅上升。年，我国玉米、小麦、大麦和高粱等饲用谷物原料的累计进口量约 万，较上年增长，寻求可替代的非常规饲料原料迫在眉睫。甜高粱（）属禾本科 植物，光合效率高，生长周期短，具有抗逆性强、抗旱涝、耐盐碱和耐贫瘠等优势，生物产量高达 。甜高粱茎秆含糖量高，糖锤度为 ，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等，是 一 种 优 质 的 饲 料 作物。然而，鲜绿甜高粱因其季节性收获、水分糖分含量高等特点而无法长时间保质贮存，而且茎秆粗硬、木质化程度高，不易萎蔫调制干草。青贮动 物 营 养 学 报 卷作为一种饲草保存的常用手段，可有效降低营养物质损失，改善木质纤维降解性能，提高甜高粱适口性和饲喂价值。研究表明，适宜的添加剂对青贮发酵过程具有积极调控作用，能有效提高青贮质量和营养价值。青贮添加剂一般分为发酵促进剂（乳酸菌、酶制剂等）、发酵抑制剂（甲醛、酸等）、有氧腐败抑制剂乙酸（）、丙酸（）、苯甲酸等以及营养添加剂（尿素、糖蜜等）等。已有研究证实，添加植物乳杆菌（）、布氏乳杆菌（）等乳酸菌发酵剂可改善青贮过程中乳酸菌等优势微生物的发酵效率，促进青贮 下 降，改 善 发 酵 品 质，提 高 饲 料 适 口性。添加纤维素酶、木聚糖酶等酶制剂能促进植物细胞壁降解和细胞内容物充分释放，提高发酵质量。添加酿酒酵母（）、奇异酵母（）等酵母菌剂不仅能抑制青贮饲料中的真菌繁殖，降低霉菌毒素污染，还能调控乳酸菌代谢产物，抑制梭状芽孢 杆 菌 和 好 氧 细 菌 繁 殖，减 少 营 养 物 质 损耗。目前，学者们对乳酸菌剂、纤维素酶制剂等常规青贮添加剂的研究关注较多，而有关酵母菌剂的研究相对较少，且主要集中在酿酒酵母方面。酿酒酵母被视作一种能调节反刍动物瘤胃、增加纤维消化和减少甲烷产生的益生菌。然而，也 有 研 究 表 明 酿 酒 酵 母 在 高 剂 量（约）下会显著提高青贮玉米 和氨态氮（）含量，降低有机酸含量和有氧稳定性，对青贮质量造成不良影响。酿酒酵母还会在青贮过程中进行酒精发酵，将糖转化为乙醇和二氧化碳，进一步降低可溶性碳水化合物（）和干物质（）含量。因此，酿酒酵母与青贮过程中的营养损失和有氧稳定性密切相关，其作为青贮添加剂的作用效果还存在一定争议，有必要寻找新的酵母菌剂进行青贮质量调控。异常毕赤酵母（）是一种嗜杀酵母，分泌的小分子蛋白质或糖蛋白通过作用于细胞壁，葡聚糖受体，将同族或亲缘关系较近的菌株杀死，具有良好的生物防治作用，常用于果蔬、谷物等粮食贮存。研究表明，异常毕赤酵母不仅对厌氧、高渗透压、低 和低水分活度等极端环境有很好的耐受性，还能产生植酸酶、外切几丁质酶和，葡聚糖酶，有助于降低饲料中抗营养物质的含量，提高动物对营养物质的消化吸收率。同时，异常毕赤酵母抗真菌活性好，生物安全性高，可用作动物饲料添加剂，在青贮玉米和青贮小麦中也有发现。任海伟等研究发现，接种异常毕赤酵母能有效减少干玉米秸秆与白菜混贮料的营养成分损失，显著降低纤维含量，提高乳酸（）含量和 发酵强度，有效改善发酵品质。等认为异常毕赤酵母存在竞争有限营养物质以及产生嗜杀因子、胞外酶和挥发性物质等多种抑菌机制，能显著抑制霉菌和肠杆菌生长，提高乳酸菌群多样性，适合作为谷物青贮发酵剂。所以，笔者推测异常毕赤酵母可凭借其独特的作用机制在制备甜高粱青贮饲料过程中发挥潜力，但这方面的研究还鲜有报道。因此，本文以甜高粱为原料，探讨添加异常毕赤酵母、纤维素酶对甜高粱青贮过程中感官质量、常规营养成分含量、发酵品质及微生物多样性的影响，旨在探明不同添加剂对甜高粱的青贮作用效果，从而筛选成本低廉、作用效果优良的青贮添加剂，为甜高粱青贮饲料的调制和应用提供理论支撑。材料与方法 试验材料 试验用鲜绿全株甜高粱（）取自中国科学院近代物理研究所白银种植基地，是由凯勒甜高粱种子经 碳离子、剂量辐照筛选的生育期提前 的早熟新品系。甜高粱原料中 含量为（），其余主要理化特性如表 所示。纤维素酶购于宁夏某生物技术有限公司，酶活性为 ；异常毕赤酵母购 于 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心（），菌种编号。青贮发酵试验设计 甜高粱植株收获后迅速运回实验室，铡刀切至 长小段，准确称取 份 的甜高粱碎段，分别加入不同添加剂并充分混匀后迅速装入聚乙烯袋，真空抽气后密封，常温（）避光贮藏 ，分别于第（原料）、和 天进行取样分析。试验设置纤维素酶组（组，纤维素酶添加量为 ，每袋原料均匀喷洒 浓度为 的纤维素酶溶液）、异常毕赤酵母组（组，异常毕赤酵母接种量为 期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响 ，每袋原料均匀喷洒 浓度为 活菌数的异常毕赤酵母菌悬液）和异常毕赤酵母纤维素酶复合组（组，二者添加量均同上，每袋原料同时均匀喷洒 浓度为 的纤维素酶溶液和 浓度为 活菌数的异常毕赤酵母菌悬液）个添加剂组和 个空白对照组（组，仅喷洒等体积蒸馏水），每个组 个重复。表 甜高粱主要理化特性 项目可溶性碳水化合物粗蛋白质淀粉酸性洗涤纤维中性洗涤纤维酸性洗涤木质素含量 测定指标及方法 感官质量评定 参照德国农业协会（）评分法从气味（分）、结构（分）和色泽（分）方面对甜高粱青贮感官质量进行评定，分为优良（分）、尚好（分）、中等（分）和腐败（分）个等级。常规营养成分含量测定 甜高粱青贮中 含量采用 烘干恒重法测定；含量采用蒽酮硫酸比色法测定；总氮（）含量采用半自动凯氏定氮仪测定，粗蛋白质（）含量计算公式为；淀粉（）含量采用酸水解法测定；酸性洗涤纤维（）、中性洗涤纤维（）和酸性洗涤木质素（）含量采用 纤维测定仪测定，纤维素（）、半纤维素（）和综纤维素（）含量分别根据公式、和 计算。干 物 质 损 失 率（）、生 物 降 解 潜 力（）和相对饲喂价值（）计算公式如下：（贮存前质量原料 贮存后质量贮存料）（贮存前质量原料）；（）。发酵品质测定 青贮 采用酸度计（）测定；含量采用苯酚次氯酸比色法测定；、和 等有机酸含量采用高效液相色谱法测定，测试条件：色谱柱（），柱温，检测器（），流动相 磷酸氢 二 钾（）和 甲 醇，流 速 ，进样量 。基于隶属函数法的青贮质量综合评价 采用模糊数学隶属函数法对 个组青贮质量进行综合评价，计算公式为：（）（）（）；（）（）（）。式中：（）表示与饲料品质呈正相关指标隶属函数值；（）表示与饲料品质呈负相关指标隶属函数值；表示该指标测定值；和 分别表示该指标最小值和最大值。基于高通量测序技术的微生物多样性分析 无菌操作环境下取 青贮样品置于 离心管中，加入 提取试剂盒裂解液，在 和 条件下振荡 ，然后用 滤膜过滤后将滤膜剪成小块获得样品总。采用 仪对细菌 基因进行扩增，扩增区域为 区，选 择 引 物 为 （）和 （）。每个样本 个重复，产物经 琼脂糖凝胶电泳检测合格后，通过 平台测序。将测序结果与 基因库比对，按 相似性水平划分操作分类单元（），利用 软件计算 多样性指数（指数和 指数），选取相对丰度高于 的细菌类群进行属水平分析。数据统计分析 基础数据采用 软件进行整理，数据结果用“平均值标准差”表示，采用 软件绘图；采用 软件进行双因素方差分析和 氏法多重比较检验，其中 代表差异显著，代表差异不显著。动 物 营 养 学 报 卷 结果与分析 异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮感官质量的影响 感官质量评定可初步判断青贮是否发生腐败变质。一般认为，优质青贮的色泽与原料接近，气味酸香，茎叶结构清晰可见，湿润不黏手。本试验中，个组甜高粱青贮在第 天时感官质量评定等级均为尚好（分），第 和 天时转为优良（分），未发生霉变现象，总体色泽接近甜高粱原色，茎叶结构保持良好，具有浓郁酸香气味；青贮第 天时，个添加剂组感官质量评定得分（分）均高于 组（分），说明加入添加剂有利于提高甜高粱青贮的感官质量。这与董妙音等添加青贮菌剂可以改善甜高粱青贮感官质量的结论相一致。异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮常规营养成分含量的影响 含量和 由表 可知，青贮第 天时，个组 含量均显著低于甜高粱原料（第 天）（）；青贮第 和 天，个组 含量与第 天相比均未发生显著变化（），而 组 含量在青贮第 天时显著低于青贮第 天时（），且 和 组 含量在青贮第 天时显著高于 组（）。此外，青贮第 天时，组和 组 显著高于 组（）；而青贮第 和 天时，个添加剂组 均显著低于 组（）。、和 含量 由表 可知，青贮时间、添加剂及其二者的交互作用对、和 含量均有显著影响（）。其中，个组 和 含量随着青贮时间的延长总体呈现显著下降的趋势（），且 个添加剂组在青贮第 和 天时 含量均显著高于 组（）；且在青贮第 天时，组 含量最高，组次之。此外，整个青贮期间，组 含量均显著高于 组和其他 个添加剂组（）。对 而言，个组 含量随着青贮时间的延长总体呈现先升高后降低趋势，其中 组 含量在整个青贮期间始终处于相对较高水平。木质纤维组分含量 由表 可知，青贮时间、添加剂及其二者的交互作用对木质纤维组分含量具有显著影响（）。其中，青贮第 和 天时，个组 含量均显著低于原料（），但在整个青贮期间 组 含量均显著高于 组（）。和 含量变化趋势相近，青贮第 天时 个添加剂组二者含量均显著高于原料（），且随着青贮时间的延长总体呈现先升高后降低的趋势，而 组二者含量在青贮第 天时均升至最高，且显著高于 个添加剂组（）。和 含量变化趋势相近，青贮第 和 天时，个组二者含量均显著高于原料（），而 个添加剂组二者含量在青贮第 天时均显著低于 组（）。这些木质纤维组分的联动变化使得 个组 在青贮 后均显著高于原料（），且青贮第 天时 个添加剂组 也显著高于 组（），尤其 组和 组 处于较高水平。异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮发酵品质的影响 由表 可知，青贮时间、添加剂及其二者的交互作用对甜高粱青贮 以及 值和有机酸含量均具有显著影响（）。其中，青贮第 和 天时，个组 均显著低于原料（）；青贮第 天时，组 与青贮第 天时相比变化不显著（），组和 组 则继续显著下降（），而 组则显著升高至（）。总体而言，青贮第 和 天时，个组 均低于或趋近最优青贮 。就 含量而言，个组在青贮第 天时 值均显著低于原料（），青贮 后均随着青贮时间的延长呈现先升高后降低的趋势。青贮第 和 天时，组和 组 值均显著高于 组和 组（），其中 组始终处于最低值。总体而言，个组 值均远低于腐败阈值。期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响表 甜高粱青贮常规营养成分含量的动态变化 项目时间组别 平均值均值标准误 值 时间添加剂时间添加剂干物质（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 干物质损失率 第 天 第 天 第 天 平均值 可溶性碳水化合物（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 粗蛋白质（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 淀粉（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 同列数据肩标不同小写字母表示同一组在不同时间点之间差异显著（），同行数据肩标不同大写字母表示同一时间在不同组之间差异显著（），同行或同列数据肩标相同字母表示差异不显著（）。下表同。（），（），（）动 物 营 养 学 报 卷表 甜高粱青贮木质纤维组分含量的动态变化 项目时间组别 平均值均值标准误 值 时间添加剂时间添加剂酸性洗涤纤维（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 中性洗涤纤维（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 酸性洗涤木质素（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 纤维素（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 半纤维素（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响续表 项目时间组别 平均值均值标准误 值 时间添加剂时间添加剂综纤维素（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 生物降解潜力第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 相对饲喂价值第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 表 甜高粱青贮发酵品质的动态变化 项目时间组别 平均值均值标准误 值 时间添加剂时间添加剂第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 动 物 营 养 学 报 卷续表 项目时间组别 平均值均值标准误 值 时间添加剂时间添加剂氨态氮 总氮 第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 乳酸（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 乙酸（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 丙酸（）第 天 第 天 第 天 第 天 平均值 乳酸 总有机酸 第 天 第 天 第 天 平均值 乳酸 乙酸 第 天 第 天 第 天 平均值 期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响 从有机酸组成来看，青贮第 天时，个组 含量均显著高于原料（），尤其 组 含量随着青贮时间的延长而显著提高（），而 组、组和 组 含量则呈现先升高后降低的趋势；青贮第 天时，组 含量显著高于另外 个组（），达到 。此外，整个青贮期间，个组 含量均呈现先升高后降低的趋势，青贮第 天时 和 组 含量均显著高于 组（）。整个青贮期间，个组 含量均显著高于原料（），但含量极低，最高值仅为 。上述有机酸的联动变化使得 个组乳酸 总有机酸（）值和乳酸 乙酸（）值均随着青贮时间的延长而显著升高（），且青贮第 天时 组 个比值均为最高，显著高于其他组（），说明此时乳酸发酵强度最为旺盛。异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量影响的综合评价 采用模糊数学隶属函数法对青贮第 天时甜高粱青贮质量进行综合评价，选取 个指标隶属函数值的平均值进行排名，平均值（）越大代表综合质量越高，其中、和 含量为正向指标，、含量和 为负向指标。由表 可知，个组排名顺序依次为 组 组 组 组，其中 组隶属函数值平均值最高（），明显优于其他 个组，说明单独添加异常毕赤酵母比单独添加纤维素酶或二者联用对甜高粱青贮质量的提升效果更明显。表 基于隶属函数法的甜高粱青贮质量综合评价 项目组别 平均值 排名 异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮过程中微生物多样性的影响 多样性 多样性是分析微生物群落物种丰富度和均匀度的综合指标。由图 可知，与原料相比，组、组和 组 指数在整个青贮期间均无显著变化（），而 组在青贮第 和 天时显著升高（），说明添加纤维素酶能显著提升甜高粱青贮的微生物群落丰富度。此外，个组 指数在青贮第 天时均显著高于原料（），且随着青贮时间的延长基本无显著变化（），说明甜高粱经青贮发酵后微生物物种多样性增加，青贮微生态系统趋于复杂，这与 等的研究结果一致。数据箱体标注相同字母表示差异不显著（），不同小写字母表示同一组在不同时间点之间差异显著（），不同大写字母表示同一时间在不同组之间差异显著（）。（），（），（）图 异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮微生物群落 多样性的影响 动 物 营 养 学 报 卷 属水平微生物多样性分析 由图 可知，甜高粱原料表面附着的属水平细菌主要包括肠杆菌属（，），其次为泛菌属（，）、沙雷氏菌属（，）和 拉 恩 氏 菌 属（，）。青贮发酵后，个组肠杆菌属相对丰度均显著下降（），而泛菌属、明串珠菌属（）、乳杆菌属（）、片球菌属（）和魏斯氏菌属（）相对丰度则显 著 升 高（），总 体 呈 现 以 泛 菌 属（）、明 串 珠 菌 属（）和肠杆菌属（）为主，含少量乳 杆 菌 属（）、沙 雷 氏 菌 属（）、片球菌属（）和葡糖杆菌属（，）等 个细菌属组成的群落结构，其中乳酸菌群共包含明串珠菌属、乳杆菌属、片球菌属、魏斯氏菌属、双歧杆菌属（）和肠球菌属（）个属。从图 和图 还可看出，随着青贮时间的延长，组和 组微生物群落动态演绎过程较为相近，组优势细菌始终为明串珠菌属，青贮第 天时相对丰度分别为 和，显著高于 组和 组（）；其次为泛菌属和肠杆菌属，而其他乳酸菌群落相对丰度均相对较低，青贮第 天时 和 组总乳酸菌相对丰度均达到峰值，分别为 和。组青贮第 和 天时优势菌为泛菌属（相对丰度分别为和），青贮第 天时演变为肠杆菌属（相对丰度为）。另外，组总乳酸菌相对丰度虽处于较低水平（），但在青贮第 天时葡糖杆菌属相对丰度升至，在青贮第 和 天时片球菌属相对丰度分别升至和，且二者均显著高于其他 个组（）。组优势菌始终为泛菌属，尤其在青贮第 天时相对丰度高达，而此时肠杆菌属相对丰度降至最低（），显著低于其他 个组（），乳 杆 菌 属 相 对 丰 度 升 至 最 高（），显著高于其他 个组（）。总之，青贮发酵后甜高粱总乳酸菌相对丰度均显著升高（），但随着时间的变化趋势不尽相同，相对丰度介于。样品 表示甜高粱原料，样品 分别表示 组青贮第、和 天，样品 分别表示 组青贮第、和 天，样品 分别表示 组青贮第、和 天，样品 分别表示 组青贮第、和 天。，：泛菌属；：肠杆菌属；：明串珠菌属；：沙雷氏菌属；：乳杆菌属；：片球菌属；：拉恩氏菌属；：葡糖杆菌属；：魏斯氏菌属；：拟杆菌属；：不动杆菌属；：粪杆菌属；：食酸菌属；：阿克曼菌属；：苍白杆菌属；：伯克氏菌属；：黄杆菌属；：其他。图 同 。图 异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮微生物群落在属水平上组成的影响 期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响 表示，表示。，图 甜高粱青贮微生物群落在属水平上的比较分析 讨 论 异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮常规营养成分含量的影响 、和 是评价青贮饲料发酵品质优劣的重要指标，可直观反映甜高粱青贮前后营养水平的变化情况。本试验中，甜高粱青贮中 和 含量在青贮发酵初期（第 天）大幅下降，这可能是因为新鲜甜高粱自身存在细胞呼吸消耗，加之附生微生物活动未被有效抑制，进而代谢 生成二氧化碳，导致 损失。另据报道，青贮初期各种厌氧和兼性厌氧微生物快速繁殖，其引起的厌氧发酵损失可高达 。同时，不同测定方法也会引起 损失的差异性，如 烘箱干燥损失比 高了，因为干燥温度越高，青贮发酵产物（包括乳酸、挥发性脂肪酸、氨和醇等）的挥发损失程度越高。本试验中，含量测定采用 干燥，这也可能是引起高 的原因之一。此外，作为青贮微生物群落优先摄取的碳源，同样是乳酸菌发酵代谢产酸的直接底物，尤其是异型乳酸发酵通常伴随着二氧化碳的产生。因此，乳酸菌代谢 产酸也是导致 损失的一个重要原因，试验中 含量显著下降也说明了这一点。与此同时，、和纤维组分等也会在酸、酶和微生物的作用下发生降解，进一步加剧 损失。但在 青 贮 第 和 天 时，个 添 加 剂 组 均显著低于 组，说明纤维素酶和异常毕赤酵母有助于降低甜高粱青贮的物质损失。一般认为 可保证青贮发酵成功。本试验中，甜高粱原料 含量远高于成功青贮所需条件，这为青贮 快速下降和成功青贮提供了良好保障。青贮第 和 天时，个添加剂组 含量均显著高于 组，尤其动 物 营 养 学 报 卷在青贮第 天时 组最高，组次之，说明添加纤维素酶和异常毕赤酵母均能有效提高甜高粱青贮 含量。这是因为一方面，纤维素酶属于，葡聚糖 葡聚糖水解酶，通过作用于，葡萄糖苷键能将植物细胞壁的纤维素降解为单糖或双糖，增加 含量，。另一方面，异常毕赤酵母分泌的嗜杀因子能与靶细胞壁的，葡聚糖受体结合，通过水解细胞壁成分诱发毒性作用。同时，异常毕赤酵母还具有广谱抗菌性，能对酵母和霉菌等不良微生物产生嗜杀作用，进而降低腐败微生物对 的消耗。再者，异常毕赤酵母的中心碳代谢途径与酿酒酵母不同，对葡萄糖表现出不敏感（即 阴性），不具有高发酵糖能力，故而有利于减少 损耗，。这与任海伟等报道添加异常毕赤酵母能够显著提高干玉米秸秆与废弃白菜混贮料 含量的研究结果一致。是青贮饲料的主要营养成分之一，青贮过程中易被植物蛋白酶和微生物酶作用水解为多肽、游离氨基酸和氨等非蛋白氮。本试验中，组 含量在整个青贮期间均显著高于其他组，可能是因为一方面异常毕赤酵母的嗜杀作用抑制了蛋白质分解菌活性，同时降低了其他不良微生物与乳酸菌等有益微生物的营养竞争，促进了乳酸菌繁殖产酸，致使蛋白酶失活，从而减少了蛋白质水解，；另一方面，异常毕赤酵母还能产生植酸酶以及单细胞蛋白，可在一定程度上提高甜高粱青贮的 含量，。作为青贮饲料的重要非结构性碳水化合物，也是反刍动物消化的重要营养物质，其在青贮过程中会被淀粉分解菌降解为葡萄糖、果糖等单糖而损耗。本试验中，组 含量始终保持较高水平，再次说明异常毕赤酵母的嗜杀活性对发酵体系中不良微生物起到了良好生物控制作用，有助于甜高粱青贮营养成分的保存。木质纤维组分主要包括、和 等，对反刍动物的干物质采食量和消化率具有重要影响，其中 和 较难被消化，降低二者含量有利于提高饲料消化率。本试验中，青贮 后 个添加剂组 和 含量均显著高于甜高粱原料，这与 等联合使用异常毕赤酵母、戊糖片球菌（）和几丁质酶进行苜蓿青贮后，和 含量显著增加的结果相一致。等也发现，在高粱青贮饲料制作过程中添加纤维素酶和乳酸菌并未使 和 含量显著下降。这可能是因为甜高粱中非结构碳水化合物更容易被微生物代谢利用，而且较高含量的 也可能对木质纤维组分的酶解产生一定程度的抑制作用，因此导致纤维组分有所增加。当青贮周期延长至 时，个添加剂组 和 含量出现下降趋势，且显著低于 组，说明较长时间的青贮过程有利于纤维素酶和异常毕赤酵母发挥作用，促进 和 组分降解。是衡量青贮饲料可降解特性的重要指标，其值越高代表降解潜力越大；是预测饲料能量价值的指标，其值越高代表营养价值越高，二者也是 和 含量的综合反映。本试验中，个组 在青贮 后均显著高于原料，且在青贮第 天时 个添加剂组 均显著高于 组，尤其 组和 组 处于较高水平。这说明加入添加剂强化的青贮发酵过程有助于提高甜高粱的生物可降解性，且添加异常毕赤酵母效果更好，这可能源于异常毕赤酵母对细胞壁的降解作用。王祥红认为异常毕赤酵母的嗜杀活性与细胞壁裂解作用有关，其嗜杀因子具有外切，葡聚糖酶活性，能破坏植物细胞壁，将多糖降解为小分子糖，进而促进木质纤维组分降解。这与试验中、及 等组分的变化趋势相吻合。因此，添加异常毕赤酵母有助于甜高粱青贮的木质纤维组分降解和饲喂价值提高。异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮发酵品质的影响 是评判青贮发酵品质的重要指标，反映了青贮饲料的总有机酸水平。一般认为优良青贮的 处于。本试验中，个组 均在青贮第 天时迅速降低，后低于或趋近最优青贮 （），这与 等在全株甜高粱中添加纤维素酶和乳酸菌进行青贮后 低于 的结果相类似，也与 等报道添加异常毕赤酵母和纤维素酶和乳酸菌进行大麦青贮后 降至 的结果相近。研究表明，青贮 的下降主要源于乳酸酸度系数（）和乙酸（）等有机酸的累积。从青贮启动开始起（），甜高粱表面附着的乳酸菌便开始利用 进行快速增殖并代谢产生大量乳酸和乙酸，迅速形成低 青贮环境。当青贮 期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响 时，体系中梭菌等不良微生物的生命活动几乎停止，部分乳酸菌群也会出现自我抑制现象。与之相比，异常毕赤酵母能在 为 的环境中正常存活，在青贮环境中具有很强的耐受性和竞争优势，进而发挥其独特的生物控制作用，并 与 乳 酸 菌 群 协 同 调 控 保 持 低 环境，。青贮饲料中的 主要由植物蛋白酶和微生物降解蛋白质而产生，其含量高低反映了青贮饲料 蛋 白 质 的 降 解 程 度。一 般 优 质 青 贮 的 值应低于。本试验中，个组青贮后 最高值仅为，均达到优质青贮标准，说明青贮 的快速下降抑制了植物蛋白酶和需氧微生物的脱氨作用，进而减少了蛋白质分解，有效降低了 含量，这与 等的结论一致。此外，梭菌和肠杆菌被认为是引起 产生的主要微生物，而本试验中均未检测出丁酸，说明体系中不存在梭菌或其活性受到严重抑制，推测肠杆菌是导致 生成的主要原因之一。研究表明，肠杆菌会与乳酸菌竞争营养底物并分解蛋白质和乳酸，导致 值和 升高，损害青贮质量。本试验中，甜高粱青贮微生物群落在属水平上的多样性结果也印证了这一点。有机酸的构成及其含量是影响青贮发酵品质的重要因素。优质青贮一般含有较多乳酸（，占总有机酸 以上）和少量乙酸（），几乎不含丙酸（）和丁酸（），。本试验中，个组 值 均 高 于，含 量 介 于 ，含量 ，未检测到丁酸，均达到优质青贮要求。乙酸和丙酸具有抗真菌活性，对提高青贮有氧稳定性和保存性能具有积极作用。此外，值反映了青贮过程的乳酸发酵程度，良好青贮的 值应大于。本试验中，个组 值均高于，且随着青贮时间的延长而显著升高，说明甜高粱青贮发酵以同型乳酸发酵为主导，尤其 组 含量和 值在青贮第 天时均达到最高值。结合属水平上微生物群落分析结果，组片球菌属、乳杆菌属相对丰度随着青贮时间的延长而显著升高，尤其是片球菌属相对丰度显著高于其他 个组，而明串珠菌属相对丰度较低。片球菌属和乳杆菌属属于同型发酵乳酸菌，耐酸性强，只发酵产生，进而对提高 含量作用显著；明串珠菌属属于异型发酵乳酸菌，是 的主要代谢者，其相对丰度降低可减缓 积累速率，可见 值升高是多种微生物群落协同调控的结果。因此，异常毕赤酵母能促进片球菌属和乳杆菌属繁殖代谢，加强同型乳酸发酵进程，进而提高青贮发酵品质，这与 变化趋势一致。异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮微生物多样性的影响 青贮发酵是一个微生物群落动态演变的过程，微生物群落的变化及其代谢产物的生成直接影响青贮品质。研究表明，与青贮发酵相关的乳酸菌群主要有乳杆菌 属、片 球 菌 属、乳 球 菌 属（）、肠球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属和链球菌属（），其中同型发酵乳酸菌在青贮初期迅速繁殖启动乳酸发酵，快速产酸并降低体系，而后是更耐酸的乳杆菌属和片球菌属大量繁殖并主导发酵过程，进一步促进 降低并抑制不良微生物生长增殖，。本试验中，甜高粱青贮的乳酸菌群主要包含明串珠菌属、乳杆菌属、片球菌属以及少量魏斯氏菌属，其中 组和 组优势乳酸菌始终为明串珠菌属，而 组和 组明串珠菌属相对丰度相对较低，但片球菌属和乳杆菌属相对丰度显著升高，这与 等添加异常毕赤酵母贮存大麦过程中优势乳酸菌转为戊糖片球菌和副干酪乳杆菌（）的结果相同。结合相关学者报道的青贮发酵乳酸菌演替过程，推测添加异常毕赤酵母比纤维素酶更有助于推动甜高粱向青贮成功的方向发展。此外，组中还发现有一定丰度的葡糖杆菌属和泛菌属，前者作为常见的产乙酸菌，能在青贮中产生乙酸；后者则可发酵产生乙酸、琥珀酸、己二酸和丙酸，种微生物均有助于提高青贮有氧稳定性。这说明添加异常毕赤酵母有助于改善甜高粱青贮的微生物群落结构，促进乳酸菌与其他微生物群落共同形成稳定良好的青贮微生态体系。研究证实，青贮发酵过程中不同微生物的代谢物之间以及新微生物群落之间均存在相互作用，可通过信号分子、生化环境调节、协同代谢、蛋白质分泌甚至基因转移等多种途径影响微生物群落的生长、代谢、分化以及活性物质和营养物质的动 物 营 养 学 报 卷生成。异常毕赤酵母能分泌小分子蛋白质或糖蛋白等嗜杀因子以及代谢产生 葡聚糖酶、外切几丁质酶、植酸酶、淀粉酶和肽酶等多种胞外酶和乙酸乙酯、乙醇等挥发性代谢物，并与乳酸菌群存在一定互利共生机制，。其中，异常毕赤酵母能提供营养因子促进乳酸菌群发酵产酸，乳酸菌群发酵则可为异常毕赤酵母提供能量来源。青贮过程中乳酸菌迅速产生有机酸降低，异常毕赤酵母则更好地控制霉菌、肠杆菌等不良微生物生长；特别在青贮初始阶段，异常毕赤酵母还可能加快氧气消耗，为乳酸菌创造厌氧环境。因此，尽管 组乳酸菌总相对丰度较低，但结合常规营养成分和发酵品质分析，该组、以及 值均优于其他 个组，隶属函数法综合分析青贮质量表现最佳。由此可见，单独添加异常毕赤酵母更有助于改善甜高粱的青贮发酵环境，提高青贮质量，这是异常毕赤酵母作用调控、甜高粱自身理化性质变化、体系中微生物群落演替以及代谢产物消长等多方因素相互影响、共同作用的结果。结 论 单独添加异常毕赤酵母对甜高粱青贮过程中营养成分保存、木质纤维组分降解、饲喂价值提高以及发酵品质改善均具有积极作用，青贮质量评价综合表现最优。异常毕赤酵母不仅自身具备优良的生物控制作用，还能优化甜高粱青贮过程中的微生物群落结构，增加片球菌属和乳杆菌属等有益乳酸菌群的相对丰度，改善青贮发酵质量，可以作为适用于甜高粱的一种专用青贮添加剂。参考文献：陶莎，张峭，张晶 年饲料市场形势、展望和对策建议中国畜牧杂志，（）：，（）：（）张丹，王楠，李超，等甜高粱 一种优质的饲料作物生物技术通报，（）：，（）：（），：，（）：韩宇杰，房义，钟荣珍，等苜蓿青贮乳酸菌的筛选及应用研究进展 动物营养学报，（）：，（）：（），（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响，（）：孙怀永异常毕赤酵母（）菌株产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究硕士学位论文青岛：中国海洋大学，：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：任海伟，唐多利，康宝，等接种异常毕赤酵母对干玉米秸秆与废弃白菜混贮品质的动态影响及微生物群落结构分析应用与环境生物学报，（）：，（）：（）：，：，（）：唐文浩，张养东，郑楠，等苜蓿青贮品质评价研究进展动物营养学报，（）：，（）：（）张志恒，王玉琴，任国艳，等基于主成分分析和隶属函数分析评价不同添加剂处理的玉米秸秆青贮的发酵品质动物营养学报，（）：，（）：（），（）：董妙音，王曙阳，姜伯玲，等添加不同的青贮菌剂对甜高粱青贮品质的影响 饲料工业，（）：，（）：（），：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王祥红海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆博士学位论文青岛：中国海洋大学，（），：，（），（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：崔艺燕，王超普，邓盾，等不同菌种有氧发酵对柑橘渣营养价值的影响 动物营养学报，（）：，（）：（），：，（）：，（）：期任海伟等：异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响，：（责任编辑 田艳明），（，；，；，）：，（），（）（），（），：），（），（），（），），），（）：；