响应面法优化油茶籽多糖提取及其体外抗氧化活性研究_王杨.pdf

A液料比（mLg）B提取温度（）C提取时间（min）-110140300151504012016050表 2响应曲面的试验设计水平因素响应面法优化油茶籽多糖提取及其体外抗氧化活性研究王杨1，唐明明2，孙梦莹1，申家朋1*（1 信阳农林学院林学院，河南信阳464000；2 信阳农林学院农学院，河南信阳464000）摘要：通过单因素探讨液料比101、151、201、251、301（mLg）、温度（30、40、50、60、70）、提取时间（20、30、40、50、60min）对油茶籽多糖得率的变化，应用 BoxBehnken 响应面法建立模型，测定油茶籽多糖对 DPPH 和 OH 自由基的清除率。结果表明，经优化后，油茶籽多糖提取工艺的最佳组合为液料比 15mL1g，温度 53，时间为 42min，通过验证，油茶籽多糖提取率为 6.953%，与模型预测值相近。在其自由基清除方面，油茶籽多糖浓度与自由基清除能力直接相关，在 0.54mg/mL 的范围内，浓度越大，清除效果越好，抗氧化活性越高，DPPH 和 OH 清除率的 IC50值分别为 2.084 和 3.948 mg/mL，同时还发现，油茶籽多糖对不同的自由基的清除效果也不相同，具体表现为：DPPH OH。优化后的油茶籽多糖提取工艺相对科学合理、简单可行，且油茶籽多糖具有较强的抗氧化活性。关键词：油茶籽；多糖；响应面；自由基清除1.2试验方法1.2.1 提取油茶籽多糖。参照王君13、朱和权14操作，称取油茶籽粉末 1g，在一定液料比、温度、时间下进行提取，并将提取液以 6000r/min 离心 10min，取上清液并加入等体积 90%的乙醇，沉淀多糖，离心过滤后，弃上清液，干燥处理，即得油茶籽多糖。1.2.2 建立标准曲线与测定多糖含量。多糖含量的测定方法参照赵美峰15，于 490nm处读取吸光值，以 0 管调零，按照吸光度值绘制葡萄糖的标准曲线：Y=8.3866X-0.0238，R2=0.998。将 1.2.1 中提取的油茶籽多糖溶于 30mL 蒸馏水中，取 0.5mL，参照 1.2.2 标准曲线测定方法，计算油茶籽多糖浓度及多糖得率：Y（%）=CV10-3/m100式中：y油茶籽多糖得率，（%）；c油茶籽多糖溶液质量浓度，（g/L）；V油茶籽多糖溶液的体积，（L）；m原料的质量，（g）。1.2.3 单因素试验。提取对象为 1g油茶籽粉末，采用液料比、温度、时间 3 因素进行单因素试验，讨论它们对多糖得率的影响16（见表 1）。油茶（Camellia oieifera）是重要的木本油料，果实可榨油，含多种生物活性物质1，如油茶籽多糖2，是油茶籽中的重要构成成分3，其主要包括阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖等4-5，在医药、食品和保健品中广泛应用。优化新技术，发展油茶产业深加工，促进油茶产业多元化发展，既能带动脱贫致富，又改善了生态环境，可谓一举多得。研究发现，在油茶多糖提取的过程中，不同的处理方法对多糖提取率有影响，其主要原因可能是油茶籽多糖结构发生了变化5-7。利用响应面法，构建模型，判断不同影响因素对提取多糖得率的影响程度，可得出最佳组合8-10。同时，多糖还具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤等功能11-12，因此对油茶多糖的研究也日益受到关注。本研究旨在利用响应面法，探索最优的油茶籽多糖提取工艺，并对其体外抗氧化活性进行研究，为合理开发和利用油茶资源，为油茶产业多元化发展提供技术支撑。1材料与方法1.1试验材料与仪器本试验选 13 年生长林系油茶 4 号的种实为试验材料。2021 年 11 月，在信阳市光山县，采集时选择品质优良，没有明显病虫害的同株油茶籽。试剂：乙醇、苯酚、双氧水：郑州派尼化学试剂厂；水杨酸、VC、葡萄糖、硫酸亚铁：风船化学试剂科技有限公司；DPPH：晶抗生物工程有限公司。仪器：CQ-80 超声波清洗机：深圳市洁拓超声波清洗设备有限公司；HH-601D数显恒温水浴锅：河南卓惠商贸有限公司；紫外分光光度计：河南众慧科技发展有限公司；YLD-2000 鼓风干燥箱：力辰科技；TGL16离心机：英泰仪器有限公司。基金项目：河南省科技攻关项目（编号：212102110186）；信阳农林学院青年教师科研基金项目（编号：2019LG001）。作者简介：王杨（1987-），女，硕士，助教，研究方向：人工林定向培育与加工利用等。通信作者：申家朋（1987-），男，博士，讲师，研究方向：森林培育等。A液料比（mL:g）B提取温度（）C提取时间（min）1101203021513040320140504251506053016070表 1单因素试验设计水平因素1.2.4 响应面优化设计。根据 BOX-Behnken Design 设试验研究现代园艺2023 年第 13 期輩輴訛DOI:10.14051/ki.xdyy.2023.13.048计，每个因素选 3 个水平，预测提取油茶籽多糖的最佳条件17，因素和水平表，表 2。1.2.5 多糖抗氧化活性研究。样品溶液的配置。取10g油茶籽粉末，按照最优的提取工艺，提取油茶籽多糖，将提取后的多糖溶解，定容，配制 4mg/mL 油茶籽多糖溶液，并将其稀释成 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL的多糖溶液。DPPH 清除力测定。参照聂少平等18方法，同时设置 VC 阳性对照，计算 DPPH 清除力。公式：清除率（%）=1-（A1-A2）/A3100。式中：A1为多糖溶液与 DPPH 溶液反应后的吸光度，A2为乙醇代替 DPPH 溶液的吸光度，A3为蒸馏水代替多糖溶液的吸光度。OH 清除能力测定。利用水杨酸法测定 OH清除能力6，VC 为阳性对照，计算 OH 清除率。公式：清除率（%）=1-（B1-B2）/B3100。式中，B1为不同浓度的多糖溶液+FeSO4+水杨酸+H2O2的吸光值，B2为蒸馏水代替 H2O2的吸光值，B3为蒸馏水代替多糖溶液的吸光值。1.3数据分析采用 SPSS25、Origin 和 Design-Expert 10.0.7 软件进行试验数据的分析和绘图制作。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1 提取液料比的影响。在提取时间、温度固定的条件下，选取不同的液料比进行单因素分析。由图 1 可知，在液料比 101 时，油茶籽多糖提取率为 6.241%，可能是液料比较低时，蒸馏水与多糖接触不充分，提取不彻底，在液料比 151 时，提取率达到最大值 6.628%，之后多糖的得率逐渐下降，在液料比 301 时最低，可能是液料比大，提取时会增加多糖的损失。2.1.2 提取温度的影响。在提取时间、液料比固定的条件下，选取不同的提取温度进行单因素分析。由图 2 可知，在提 取 温 度 为50时，油茶籽的提取率达到最大值 6.900%，可能是在一定10140405.89620140405.99610160406.32420160406.48910150305.65520150305.70110150506.11420150506.31915140305.70115160305.84515140505.75215160506.16915150406.92715150406.75615150406.88915150406.61415150406.815表 3响应曲面的试验设计液料比（mLg）温度（）时间（min）多糖得率（%）图 1液料比对油茶籽多糖提取率的影响的范围内温度升高加速了分子运动，从而有利于多糖溶解，但随着温度继续升高多糖提取率逐渐降低。2.1.3 提取时间的影响。在液料比、提取温度固定的条件下，选取不同提取时间进行单因素分析。由图 3 可知，在提取时间为40min 时，油茶籽多糖提取率达 到 最 大 值6.727%，但提取时间过长，可能会造成部分小分子多糖降解，导致多糖提取率下降。2.2响应面法试验结果与分析2.2.1 响应面法试验结果。综合油茶籽多糖得率的单因素进行响应面试验设计，确定 17 组试验处理，并根据处理完成多糖提取，计算多糖得率，结果见表 3。图 2提取温度对油茶籽多糖提取率的影响图 3提取时间对多糖提取率的影响2.2.2 方差分析。用 Design expert 10 软件，拟合方程并构建模型，回归得到二次多元方程：Y=6.8+0.064A+0.19 B+0.18 C+0.016 AB+0.040 AC+0.068 BC-0.27A2-0.35B2-0.58C2。对所构建的模型进行检验，方差分析结果见表 4。F 值为 17.27，P=0.00050.01，差异极显著；失拟项P=0.30240.05，差异不显著，说明拟合程度较好。R2=0.9569，R2adj=0.9015，说明拟合效果较好，可用于油茶籽多糖最优提取组合的分析和预测。由表 4 可知，FA=1.68，FB=13.83，FC=13.30，说明F 值越大，该因素对油茶籽多糖得率的影响就越大，按2023 年第 13 期现代园艺试验研究輩輵訛照从大到小依次的顺序为：B-提取温度C-提取时间A-液料比。2.2.3 响应面交互因素分析。从 3D 图的陡峭程度来看，BC最为陡峭，表明温度和时间的交互影响最明显；从等高线图来看，AB的等高线更接近圆形，而 AC 和BC的等高线呈椭圆形，表明液料比和温度的交互影响不明显。因此，综合以上试验数据的分析，交互作用影响从大到小排序为：BCACAB。2.3油茶籽多糖抗氧化性研究2.3.1 多糖对 DPPH 自由基的清除作用。由图 5 可知，多糖浓度对 DPPH 自由基的清除效果呈正相关，在浓度为 4mg/mL时清除率最大，达到了 81.480%，IC50值为 2.084mg/mL，总体看来，相同浓度油茶籽多糖的清除率低于 VC溶液。2.3.2 多糖对 OH 的清除作用。由图 6 可知，多糖浓度与清除效果呈现 的 规 律 同DPPH 一致，在浓度为 4mg/mL时，OH 清除率也达到最大值51.511%，IC50值为 3.948mg/mL，但也低于相同浓度 VC的清除率。3结论本研究采用油茶籽为试验材料，基于响应面法优化油茶籽多糖提取的最佳工艺如下：提取料液比为 151，温度为 53，时间为 42min，利用最优组合提取油茶籽多糖得率为 6.953%。按照优化后的工艺提取油茶籽多糖，通过其对DPPH 清除率及 OH 清除率，判断体外抗氧化活性，试验结果表明，油茶籽多糖的浓度与自由基清除能力存在明显的相关关系，均表现为在一定范围内的浓度越大，清除效果越好，抗氧化活性越高，DPPH 和 OH 清除率的 IC50值分别为 2.084 和 3.948mg/mL，同时还发现，油茶籽多糖对不同的自由基的清除效果也不相Model3.0890.3417.270.0005*A-液料比0.03310.0331.680.2366B-提取温度0.2710.2713.830.0075*C-提取时间0.2610.2613.300.0082*AB1.06010-311.06010-30.0530.8238AC6.24610-316.24610-30.320.5921BC0.01910.0190.940.3648A20.3110.3115.670.0055*B20.5210.5226.360.0013*C21.4211.4271.740.0001*残差0.1470.020失拟项0.07830.0261.710.3024纯误差0.06140.015综合3.2216表 4响应面方差分析方差来源平方和自由度 df均方 MSF 值P 值显著性2.2.4 最佳条件预测及验证。根据结果分析，优化后，油茶籽多糖的提取工艺为：在液料比 15.701，温度 52.83，时间 41.77min 条件下，预测油茶籽多糖得率为 6.847%。在实际操作中，将料液比调整为 151，温度 53，时间 42min，并重复 3 次，油茶籽多糖平均得率为 6.953%，接近预测值，说明该模型优化效果良好，结果稳定可靠。图 4交互作用的响应面图和等高线图图 5多糖对 DPPH 的清除作用图 6多糖对 OH 的清除作用试验研究现代园艺2023 年第 13 期輩輶訛同，具体表现为：DPP OH，综上所述，油茶籽多糖在一定浓度范围内能够抑制自由基生成，体现出较好的体外抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂在食品和保健品方面加以利用。（收稿：2022-09-29）参考文献：1王承瑞,刘思思,易有金,等.油茶籽饼粕中活性成分对果蔬保鲜作用的研究进展J.中国油脂,2021,46(10):121-126.2庄瑞林.中国油茶M.北京:中国林业出版社,2007:1-5.3邓全恩,丁向阳,李建安.河南省主栽油茶品种抗寒性研究J.经济林研究,2018,36(3):12-16+56.4Tingting Li,Cai-e Wu,Xiangyong,et al.Structural characterization andantioxidant activity of a glycoprotein isolated from Camellia oleifera Abelseeds against D-galactose-induced oxidative stress in mice J.Journal ofFunctional Foods,2020(64):103594-103603.5段丽萍,苗丽坤,孙炜炜,等.油茶多糖的提取及生物活性研究进展J.粮食与油脂,2020,33(11):26-28.6王瑾,周建平.油茶籽多糖微波辅助提取及纯化J.中国油脂,2009,34(04):50-53.7Yang K M,Hsu F L,Chen C W,et al.Quality characterization and ox-idative stability of camellia seed oils roduced with different roasting tem-peraturesJ.Journal of Oleo Science,2018,67(4):389-396.8巩芳芳,廖碧芳,董佳佳,等.黑枸杞花青素提取工艺优化和含量测定J.郑州大学学报(医学版),2019,54(04):531-534.9赵滢,刘利娥,韩萍,等.响应面法优化超声辅助提取蔓菁多糖工艺及其体外抗氧化性研究J.食品工业科技,2020,41(07):139-145.10李会端,江岸,余建中.生姜总黄酮甲醇浸提工艺的响应面优化及提取液对羟自由基清除活性J.北方园艺,2017(23):155-164.11谢文,陈华国,赵超,等.枸杞多糖的生物活性及作用机制研究进展J.食品科学,2021,42(5):349-359.12罗凡,陈志吉,蓝丽丽,等.加热对油茶籽油及饼粕总酚及其抗氧化能力的影响J.林业科学,2020,56(02):61-68.13王君,陈新,高文彬,等.响应面法优化超声辅助提取金丝皇菊多糖工艺及生理活性研究J.中国食品添加剂,2022(2):100-109.14朱和权,冯进,李春阳,等.响应面法优化白首乌多糖超声辅助提取工艺及其结构表征J.食品工业科技,2021,42(10):153-159.15赵美峰,魏超妮,剡建华.硫酸苯酚法测定黑果枸杞中多糖的含量J.中医药信息,2015(2):58-59.16叶润,蔡静,李尽哲,等.油茶叶多糖的闪式提取工艺优化及其抗氧化活性J.生物质化学工程,2021,55(5):42-46.17吴也,刘中正,宋见喜,等.响应面法优化微波萃取血红铆钉菇多糖及抗氧化活性研究J.吉林化工学院学报,2021,38(1):4-12.18聂少平,谢明勇,罗珍.用清除有机自由基 DPPH 法评价茶叶多糖的抗氧化活性J.食品科学,2006,27(3):34-36.!2023 年第 13 期现代园艺试验研究食用菌菌渣资源化利用研究进展王伟霞1,2，张之麒1,2，李淑格1,2，吴少杰1,2，李福后1,2（1 江苏海洋大学海洋资源与环境重点实验室/海洋生物技术重点实验室，江苏连云港222005；2 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港222000）摘要：栽培食用菌产生大量的菌渣，资源化利用菌渣，实现低碳农业发展是目前所关注的重要课题。从二次种菇、生物炭、肥料和栽培基质等 7 个层面综述了食用菌菌渣资源化利用方向，分析了目前菌渣利用存在的问题，并展望了未来菌渣利用途径。关键词：食用菌；菌渣；资源化利用；低碳农业很难采用单一的模式去处理，而是要因地制宜，采用多种模式相结合的方式来处理菌渣，最终实现菌渣的综合利用。2菌渣资源化利用途径2.1二次种菇食用菌菌渣含有丰富的营养物质，如粗蛋白、粗脂肪、多糖、氨基酸等，经过粉碎、发酵或灭菌处理后可用于二次种菇。在食用菌工厂化生产中，金针菇、杏鲍菇等木腐菌类只采收第一潮菇，菌渣适合于生产双孢蘑菇、草菇等9-12。柯斌榕等9以金针菇菌渣为材料，基于隧道发酵技我国是食用菌第一生产大国，产量约占全球总产量的 70%以上1。伴随着食用菌产业的发展，菌渣产量也急剧上升。作为食用菌生产的副产物，多数菇农采用焚烧、丢弃或直接还田等方式，不仅造成资源浪费，还会引起严重的环境污染或人畜共患病隐患等2-4。如何资源化利用菌渣，减少碳排放并实现绿色可持续发展是人们所关注的重要课题。现从二次种菇、生物炭、肥料和栽培基质、饲料和垫料化、生态环境修复、活性物质提取、能源化等方面进行综述，以期促进菌渣的资源化利用，实现食用菌产业可持续发展。1食用菌和菌渣“小蘑菇，大产业”，食用菌（蘑菇）产业是乡村振兴的重要抓手，在促进农民增收和贫困人口脱贫方面起着重要作用。据中国食用菌协会统计，20152020 年，我国食用菌产量由 3476.27 万 t 增至 4061.43 万 t5-7。以生产 1 kg食用菌鲜品产生 0.966 kg 菌渣（湿重）计算8，20152020 年，菌渣产量分别约为 3462.36 万、3585.26 万、3706.12 万、3826.67 万、3946.06 万、4045.18 万 t（图 1）。针对如此规模巨大的食用菌菌渣，图 120152020 年间全国食用菌和菌渣的总产量輩輷訛