荧光探针的光谱性质.docx

绪论
1.1前言
Aβ1-40是阿尔茨海默病的主要标志物之一，且Aβ单体可以自组装成高度有序的结构，包括二聚体、三聚体、四聚体，或者更大的结构，直至形成纤维。研究表明，Aβ寡聚体具有更强的神经毒性，二聚体和三聚体会破坏神经纤维的弹性，而三聚体和四聚体的毒性是Aβ纤维的二倍。总之，研究表明Aβ早期积聚体可能是疾病诊断的依据之一[1-6]。因此能够及时、简便、有效的检测出Aβ的这种异常的现象，则对于预防和治疗AD既有重要的理论意义又有实际意义。
为了检测Aβ的寡聚体，已经发展了抗体和单链抗体技术[7-8]，已报道这些抗体和特征分子形成特异性识别作用[9]。荧光分析法灵敏度高，使用方法简便，而且样品处理简单，具有在溶液中可无损、实时连续检测等优点，因此得到广泛应用[16-21]。本文基于Aβ抗体的研究基础，结合荧光技术，以Aβ的DNA适配体为识别基团，结合荧光分析方法特点，制备荧光探针， 识别Aβ早期积聚体。而探针T-SO508序列(5\'to3\')为GCCTGTGGTGTTGGGGCG GGTGCG。本文针对探针T-SO508对Aβ作用及检测进行实验。
我们的实验证明，所制备的荧光探针对Aβ1-40具有一定的识别作用，但是由于用于检测的Aβ1-40没有以分子量将其区分，所以识别作用不是特别稳定，下一步准备看能否将Aβ1-40分开，特征检测二聚体和三聚体。

2 实验部分
2.1 试剂和药品
T-SO508（生物工程上海股份有限公司，1 mg，AR）修饰5\'JOE,3\'TAMRA ，JOE：2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）。常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。TAMRA是用于标记蛋白的，全名为羧基四甲基罗丹明，是一种罗丹明类荧光素衍生物，其中6-TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，常用于荧光标记试剂盒中，且Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0）。探针浓度的配置：加入500 μL（TE缓冲溶液，PH=8.0）浓度为9 μM，作为工作液1；TE缓冲溶液的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶解，滴加浓Hcl约2.1 ml，调制PH=8.0，定容50 ml成1 M Tris-Hcl；称取9.306 g EDTA-Na2•2H2O，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调至PH=8.0定容至50 ml成0.5 MEDTA；1M Tris-Hcl 1ml,0.2 ml的0.5 M EDTA混合并加超纯水定容至100 ml。三种不同纯度的Aβ1-40（上海强耀生物科技有限公司， 1.0 mg，AR），分别为Aβ1-40纯度90%，Aβ1-40纯度95.65%，Aβ1-40蛋白纯度98%，,用类似的方法将其配制浓度并作为工作液2：若加入溶剂二甲基亚砜0.5 mL则得到462 μM 的Aβ1-40；若加入溶剂二甲基亚砜1 mL则得到231 μM的 Aβ1-40。
2.2 仪器设备
Agilent Technologies Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer（安捷伦科技有限公司），用于荧光光谱、荧光强度的测定；荧光比色皿，移液枪，5 μL的移液针，1 μL的移液针，用于液体的移取，恒温水浴锅，试管加热器等。
2.3 实验操作方法
（1）实验分类
①将不同含量的Aβ分为三组，第1组为Aβ纯度为90%，向其加入1 mL二甲基亚砜配置成浓度为231 μM作为工作液2，T-SO 508探针中加入500 μL TE(pH=8)配置成浓度为9 μM作为工作液1。荧光测定仪在使用前预热15 min，比色皿要用TE缓冲溶液润洗，操作期间要保持所用仪器的清洁。每次加入试剂之前要用擦镜纸擦拭移液枪、微量进样器等，并多次更换移液头。
②第2组为Aβ纯度为95.65%加入0.5mL二甲基亚砜配置成浓度为462 μM的Aβ作为工作液2，T-SO 508探针仍使用第1组中配置好的浓度。仪器及实际操作同上，但唯一不同的是本次实验要控制温度为37，打开白色暗箱使其停留在stand by 状态，同时打开恒温水浴锅，此时要注意检查循环水是否正常流通，待温度达到37℃时才可以开始扫描。（水浴锅上显示的温度不准，以界面上温度控制系统显示的温度为准），每次加入试剂后待温度稳定后再扫描。
③第3组为Aβ纯度为98%，加入0.5 mL二甲基亚砜配置成浓度为462 μM的Aβ作为工作液2；T-SO 508仍用第1组配置好的浓度；仪器与试剂操作同第一组。此次实验同样控制温度，但不用恒温水浴锅，采用试管加热器。首先将试管加热器设置为37℃，之后在每次加入工作液后将比色皿放入试管加热器中大约加热5 min即可达到37℃，取出并快速放入荧光检测仪中进行扫描。
（2）荧光探针的测定
荧光光谱的测定，取2.0 ml TE缓冲溶液置于已洗涤干净并用其溶液润洗过的比色皿中，作为参比，设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为10 nm，发射狭缝宽度为5 nm。再向比色皿中加入5 μL工作液1，设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。标准加入法不断的向比色皿中加入工作液1直到它的强度不在随浓度的变化而变化。此时的探针达到最大强度，记下此时的荧光强度作为F0，并且每次扫描都记录相应的荧光强度。
（3）检测Aβ1-40
当探针T-SO508的荧光强度最强时，向其比色皿中逐次加入Aβ1-40即工作液2，充分搅拌均匀后，设定激发波长526 nm，响应时间为自动，中速扫描，测定范围为527-650 nm，以扫描出发射线；再设定发射波长为553nm，响应时间自动，中速扫描，测量范围为450-550 nm，以扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为10 nm，发射的狭缝宽度为5 nm。此外，再以激发波长为553 nm，测量范围为554-650 nm扫描出发射线。记录每次扫描时的波长与其对应的荧光强度，并以F1、F2、F3等等标注。
3 结果与讨论
3.1 T-SO508的荧光光谱性质
在2 mLTE缓冲溶液中加入浓度为9 μM探针T-SO508，设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。随着探针的不断加入荧光强度不断增强直到加到23 μL，此时荧光信号为71，探针浓度为0.207 μM。每次扫描记录荧光强度，不同浓度下的荧光强度如下图所示：

图 1 不同浓度荧光探针的荧光强度随探针的浓度的变化曲线，其中探针T-SO508的浓度分别为(0,22.5,27 ,45,54,58.5,63,67.5,72,76.5,81)×10-9 mol/L

由图可见，随着荧光探针的加入，荧光强度不断增加，其浓度和荧光强度的线性方程为y=3.11x+6.51，相关系数为0.998，样本容量11。
3.2 T-SO508对Aβ1-40的检测作用
用Aβ1-40纯度≥90%配置浓度为231 μM工作液2，如图2所示；在浓度为0.207 μM的探针中开始加入Aβ，共加入23 μL。设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。图中右下侧为设定激发波长553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为553-650 nm，扫描出发射线，也就是F1F2F3等等这些荧光强度。

图2 Aβ1-40（上海强耀生物科技有限公司，1.0mg,纯度≥90%）加入的Aβ浓度分别为（0,5.78,11.55,17.33,18.48,19.64,20.71,21.95,23.1,24.26,25.41,26.57）×10-7 mol/L

由图可见，随着Aβ1-40的加入，荧光强度不断降低，以未加入Aβ1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入Aβ1-40后的荧光强度为F，以F/F0对Aβ1-40的浓度作图，由插图可见，随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0对Aβ1-40的浓度的线性方程为y=-0.0061x+1.2226，相关系数为0.9097，样本容量9。
3.3 温度对荧光强度的影响
（1）用Aβ1-40纯度95.65%配置浓度为462 μM作工作液2，如图3所示；采用温控系统控制温度在37 ℃（实验室温控系统出错，可能比实际温度高）。设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。探针T-SO508直到加到26 μL开始加入蛋白共加入104 μL，每次扫面记录荧光强度。

图3 探针强度随Aβ1-40浓度的变化（Aβ1-40，上海强耀生物科技有限公司,1 mg，纯度95.65%）Aβ1-40的浓度1-10分别（1.16,2.31,3.47,4.62,5.78,6.01,6.24,6.7,7.86,10.16,12.48,14.79,19.40,21.71,24.02)μmol/L
由图可见，随着Aβ1-40的加入，荧光强度不断增强，以未加入Aβ1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入Aβ1-40后的荧光强度为F，以F/F0对Aβ1-40的浓度作图，由插图可见，随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0对Aβ1-40的浓度的线性方程为y=6.319x+0.9898，相关系数为0.9868，样本容量11。
（2）．Aβ1-40纯度98 %配置浓度为462 μM作工作液2，如图4所示；控制温度37 ℃（在试管加热器中设置37 ℃，每次加入溶液后加热5 min）；设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。探针加入45 μL时加入Aβ，共加入105 μL，右侧图为设定激发波长553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为553-650 nm，扫描出发射线。

图4 左图为探针荧光强度，浓度分别（22.5,45,67.5,90,112.5,135,139.5,148.5,157.5,180,202.5）×10-9 mol/L；右上方为探针荧光强度随体积变化曲线，成上升趋势。右图为加入Aβ以553nm为激发波的荧光强度，而加入的Aβ浓度分别为（2.31, 4.62, 6.93, 8.09, 10.40, 12.71, 15.02, 17.33, 21.95, 24.26）μmol/L；右上方为A荧光强度随体积的变化曲线，成上升趋势。
由图4-1可见，荧光强度随着荧光探针的增加而增加，由图4-2可见，随着Aβ1-40的浓度的增加，发射强度呈上升趋势。随着Aβ1-40的加入，荧光强度不断增强，以未加入Aβ1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入Aβ1-40后的荧光强度为F，F/F0对Aβ1-40的浓度的线性方程为y=（3.27×10-4）x+1.01，相关系数为0.9119，样本容量11。
3.4 结论
对比以上三组实验，可以发现荧光强度相差甚大。3组实验的关键不同点是温度，第1组中没有控制温度，是在室温下操作的，室温大约20℃，而其荧光强度最大不到80，第2组与第3组就截然不同，第3组的荧光强度达到500以上，而第2组的荧光强度达到800以上。这种巨大的差距来源于温度，第3组采用的试管加热器控制温度，相对温度控制较好；第2组采用恒温水浴锅控制温度，本实验所用恒温水浴锅控温不太准确，系统界面温控显示在37℃时，水浴锅已经达到49.6℃以上，可能使试剂的温度较高。因此可以得出探针T-SO 508的荧光强度与温度有很大关系，之后随着Aβ的加入后，荧光强度并不明显变化。从而可以得出探针T-SO508的荧光强度与温度有很大关系，但是与Aβ蛋白的作用并不太明显。由三种不同的拟合曲线F与V的关系可以发现Aβ与温度有关，第1组中的Aβ荧光强度随浓度的增大而降低，后两组的荧光强度随浓度的增大而增大。
此次实验Aβ与探针T-SO508 有一定的作用，特别是荧光增强的信号，一般不是假信号。但作用现象不是特别的规律和明显，可能与Aβ1-40的存在状态有关。配制好的Aβ1-40的存在状态没有分离和准确测定，而Aβ1-40的本身又特别的不稳定，在贮存过程中不停地集聚，而此处所选择的适配体只能检测Aβ1-40的低聚体，导致本实验所得信号不稳定及现象不明显。Aβ1-40本身存在状态不明确，且Aβ1-40本身不稳定，这是检测所必须面对的难题，也是我们以后要解决的问题。