温度对红色红曲菌M7液态发酵产monascin和ankaflavin的影响.pdf

2 0 2 3年河北大学学报(自然科学版)2 0 2 3第4 3卷 第4期J o u r n a l o f H e b e i U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 3 N o.4D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0 1 5 6 5.2 0 2 3.0 4.0 0 9温度对红色红曲菌M 7液态发酵产m o n a s c i n和a n k a f l a v i n的影响徐勇1,邱子娅1,陈莎1,2,张佳兰3,高梦祥1,2,李利1,2(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 4 3 4 0 2 5;2.长江大学 食品研究院,湖北 荆州 4 3 4 0 2 5;3.长江大学 动物科学学院,湖北 荆州 4 3 4 0 2 5)摘 要:为了提高红色红曲菌(M o n a s c u s r u b e r)M 7发酵生产红曲素(m o n a s c i n,M S)和红曲黄素(a n k a f l a v i n,A F)的产量,采用液态发酵法,探究不同发酵温度下其产生的醇溶性色素在组成和产量方面的变化规律.结果发现,当温度较低时(2 5、3 0),所产生的色素在4 7 0 n m有最大吸收,色调偏橙,红斑素(r u b r o p u n c t a t i n,R P)和红曲红素(m o n a s c o r u b r i n,MR)为优势组分;当温度较高时(3 5、4 0),所产生的色素在4 0 0 n m 附近有最大吸收,色调偏黄,M S和A F成为优势组分.随着温度的升高,所有色素组分的产量均先升高后降低,其中,2 5、4 0 不利于色素的产生,产量显著低于3 0、3 5;3 0 时,R P和MR的产量达到最大值,分别为1 0 7、1 2 4 m g/L,而M S和A F的产量较低,分别为4 8、2 6 m g/L;3 5 时,M S和A F的产量达到最大值,分别为1 0 0、4 7 m g/L,而R P和MR的产量相对3 0 时显著降低,分别为5 7、5 0 m g/L.q P C R分析发现,温度对M S和A F液态发酵的影响与其对色素合成关键酶基因的转录调控密切相关,其中,对色素合成分支节点关键酶基因M r P i g F和M r P i gH的差异调节,可能对3 5 时M S和A F产量的显著提高起到了较关键的作用.该结果可为提高M S和A F液态发酵产量提供参考.关键词:红色红曲菌;红曲素;红曲黄素;液态发酵;温度中图分类号:T S 2 0 1.3 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 0 1 5 6 5(2 0 2 3)0 4 0 4 0 8 1 2I n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e o n t h e p r o d u c t i o n o f m o n a s c i n a n d a n k a f l a v i n b y M o n a s c u s r u b e r M 7 d u r i n g l i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o nX U Y o n g1,Q I U Z i y a1,C H E N S u o1,2,Z H A N G J i a l a n3,G A O M e n g x i a n g1,2,L I L i1,2(1.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,Y a n g t z e U n i v e r s i t y,J i n g z h o u 4 3 4 0 2 5,C h i n a;2.I n s t i t u t e o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,Y a n g t z e U n i v e r s i t y,J i n g z h o u 4 3 4 0 2 5,C h i n a;3.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e,Y a n g t z e U n i v e r s i t y,J i n g z h o u 4 3 4 0 2 5,C h i n a)A b s t r a c t:T o i m p r o v e t h e p r o d u c t i o n o f m o n a s c i n(M S)a n d a n k a f l a v i n(A F)b y M o n a s c u s r u b e r M 7,t h e c h a n g e s i n c o m p o s i t i o n a n d y i e l d o f a l c o h o l-s o l u b l e p i g m e n t s p r o d u c e d a t d i f f e r e n t f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e s w e r e i n v e s t i g a t e d u s i n g l i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o n.I t w a s f o u n d t h a t p i g m e n t s p r o d u c e d a t l o w e r t e m p e r a t u r e s(2 5、3 0)w e r e o r a n g e i n h u e,w i t h a m a x i m u m a b s o r p t i o n a r o u n d 4 7 0 n m,a n d 收稿日期:2 0 2 2 0 6 0 7 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 7 3 0 0 6 8)第一作者:徐勇(1 9 9 7),男,四川达州人,长江大学在读硕士研究生,主要从事红曲色素的发酵及其在食品中的应用研究.E-m a i l:1 9 0 3 4 3 7 3 0 8q q.c o m 通信作者:李利(1 9 8 3),女,湖北浠水人,长江大学副教授,博士,主要从事真菌次生代谢产物及其在食品中的应用研究.E-m a i l:l i l y 2 0 1 2y a n g t z e u.e d u.c n第4期徐勇等:温度对红色红曲菌M 7液态发酵产m o n a s c i n和a n k a f l a v i n的影响r u b r o p u n c t a t i n(R P)a n d m o n a s c o r u b r i n(MR)w e r e t h e d o m i n a n t c o m p o n e n t s;w h i l e p i g m e n t s p r o d u c e d a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s(3 5、4 0)w e r e y e l l o w i n h u e,w i t h a m a x i m u m a b s o r p t i o n a r o u n d 4 0 0 n m,a n d M S a n d A F b e c a m e t h e d o m i n a n t o n e s.A s t h e t e m p e r a t u r e i n c r e a s e d,t h e y i e l d s o f e a c h p i g m e n t c o m p o u n d s f i r s t i n c r e a s e d a n d t h e n d e c r e a s e d.T h e y i e l d s o f a l l p i g m e n t c o m p o u n d s w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r a t 2 5、4 0 t h a n a t 3 0、3 5,i n d i c a t i n g t h a t t h e s e t e m p e r a t u r e s w e r e n o t c o n d u c i v e t o t h e p r o d u c t i o n o f p i g m e n t s.A t 3 0,R P a n d MR h a d a m a x i m u m y i e l d o f 1 0 7、1 2 4 m g/L,r e s p e c t i v e l y,w h i l e M S a n d A F h a d a l o w e r y i e l d,b e i n g 4 8、2 6 m g/L,r e s p e c t i v e l y.A t 3 5,M S a n d A F r e a c h e d a m a x i m u m y i e l d o f 1 0 0、4 7 m g/L,w h i l e R P a n d MR d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y w h e n c o m p a r e d t o 3 0,b e i n g 5 7、5 0 m g/L,r e s p e c t i v e l y.q P C R a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e i n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e o n t h e l i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o n o f M S a n d A F w a s c l o s e l y r e l a t e d t o i t s t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o n k e y g e n e s r e s p o n d i n g t o p i g m e n t s b i o s y n t h e s i s.T h e d i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o n M r P i g F a n d M r P i gH,t h e k e y e n z y m e g e n e s o f t h e p i g m e n t s b i o s y n t h e s i s b r a n c h n o d e,m i g h t p l a y e a c r i t i c a l r o l e i n i m p r o v i n g t h e y i e l d s o f M S a n d A F a t 3 5.T h e s e r e s u l t s w o u l d b e h e l p f u l f o r t h e p r o m o t i o n o f M S a n d A F d u r i n g l i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o n.K e y w o r d s:M o n a s c u s r u b e r;m o n a s c i n;a n k a f l a v i n;l i q u i d s t a t e f e r m e n t a t i o n;t e m p e r a t u r e红曲色素是红曲菌(M o n a s c u s s p p.)发酵产生的天然食用色素,从颜色上分为红色素(m a x=4 9 05 3 0 n m)、橙色素(m a x=4 6 04 8 0 n m)和黄色素(m a x=3 3 04 5 0 n m)3大类1-2.目前,国内外大规模发酵生产的仅有红曲红色素,可直接或改性后作为食品着色剂,用于腊肉制品、熟肉制品、调制乳、果酱、糖果、糕点等食品中,而红曲橙色素和黄色素这2类天然色素,产量偏低,尚未实现工业化生产3-4.目前已报道的红曲黄色素至少包括4 9种不同结构的化合物,根据溶解性分为醇溶性和水溶性2类,其中红曲素(m o n a s c i n,M S)和红曲黄素(a n k a f l a v i n,A F)是最为常见的2种醇溶性红曲黄色素组分1,5-6.M S和A F色泽鲜亮醒目,具有较好的p H稳定性、光稳定性和热稳定性7,是一种优良的微生物来源的天然黄色素.近年来,M S和A F的生物活性成为红曲色素的研究热点,被报道的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、降血压、调节脂质代谢、调节免疫功能、预防阿尔茨海默症等5-6,8-1 0.由此可见,M S和A F不仅在食品着色方面极具开发价值,而且在保健食品和医药领域也具有很好的应用前景.选育红曲黄色素高产菌株和优化发酵条件是提高红曲黄色素产量的有效手段6,1 1-1 6.但红曲黄色素种类较多,成分复杂,而且缺少商品化的标准品3,所以相关研究很少对发酵产生的红曲黄色素组分分别进行定性和定量分析,大多根据4 1 0 n m(黄色素的特征吸收峰)的吸光值来测定黄色素的色价.因而,对于发酵过程中不同红曲黄色素组分的影响因素和变化规律,目前还缺乏系统性认识.温度是影响微生物生长和代谢的重要环境因素.红曲菌是一种典型的中温型丝状真菌,其培养与发酵多采用2 53 0 1 7.然而,随着发酵菌株和发酵条件的不同,所产生的红曲色素组分存在差异,最佳发酵温度会发生变化.在水溶性红曲黄色素方面,H u a n g等1 8研究发现,温度对红色红曲菌(M.r u b e r)C GMC C 1 0 9 1 0液态发酵产生的4种水溶性红曲黄色素组分有不同的影响,其中只有1种水溶性黄色素组分的最佳发酵温度为3 0,而其他3种的最佳发酵温度均较高,为3 5.在醇溶性红曲黄色素方面,Y o n g s m i t h等1 1发现,4 0 条件下紫色红曲菌(M.p u r p u r e u s)L P B 9 7固态发酵产生的醇溶性红曲黄色素的色价显著高于3 0,而况嘉铀等1 2发现,红曲菌GN液态发酵产生的醇溶性红曲黄色素的色价随着温度的升高先升高后降低,最佳温度与Y o n g s m i t h等1 1的报道差异较大,为2 2.5.可见,降低或提高发酵温度,能促进某些红曲黄色素组分的生物合成.目前,温度对M S和A F液态发酵的影响鲜见报道.本研究以红色红曲菌M 7为实验菌株,利用紫外-可见吸收光谱法、高效液相色谱法(H P L C)和液相色谱-质谱联用(L C-M S)等方法,研究温度对M S和A F液态发酵的影响,并从红曲色素生物合成途径中关键酶基因表达水平的变化探讨其机制,为提高M S和A F液态发酵产量提供参考.9041 材料与方法1.1 主要材料与试剂红色红曲菌(M.r u b e r)M 7:华中农业大学农业微生物国家重点实验保藏中心(C u l t u r e C o l l e c t i o n o f S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a l M i c r o b i o l o g y)保藏,编号为C C AM 0 7 0 1 2 0.葡萄糖、N a NO3、K2H P O4、KH2P O4、K C l、M g S O47 H2O、F e S O47 H2O、(NH4)2S O4、C a C l2、蔗糖、甲酸、无水乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;酵母膏、蛋白胨、琼脂:生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司;乙腈:色谱纯,美国天地有限公司;总R NA提取试剂盒(T r i z o l法)、反转录试剂盒(H i S c r i p t I I Q R T S u p e r M i x)、实时荧光定量P C R(q P C R)试剂盒(C h a mQ U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x):南京诺唯赞生物科技股份有限公司;红曲素(M S)、红曲黄素(A F)、红曲红素(m o n a s c o r u b r i n,MR):上海源叶生物科技有限公司;红斑素(r u b r o p u n c t a t i n,R P):美国MC E生物科技公司.孢子培养基1 9:N a NO3 3 g、K2H P O4 1 g、K C l 0.5 g、M g S O47 H2O 0.5 g、F e S O47 H2O 0.0 1 g、酵母膏5 g、蔗糖 3 0 g、琼脂 1 5 g,加蒸馏水至1 L.用于红色红曲菌M 7孢子的培养.种子培养基1 8:葡萄糖2 0 g、酵母膏3 g、蛋白胨1 0 g、KH2P O4 4 g、K C l 0.5 g、F e S O47 H2O 0.0 1 g,加蒸馏水至1 L.用于红曲色素液态发酵种子的培养.发酵培养基1 8:葡萄糖5 0 g、(NH4)2S O4 5 g、KH2P O4 5 g、C a C l2 0.1 g、F e S O47 H2O 0.0 1 g,加蒸馏水至1 L.用于红曲色素的液态发酵.培养基灭菌条件为1 2 1,2 0 m i n.1.2 主要仪器与设备P B-1 0 p H计(德国赛多利斯有限公司);S P X-2 5 0 B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);H F s a f e-1 2 0 0生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司);I S-R D S 3恒温摇床(美国精骐有限公司);B e c k m a n A l l e g r a X-3 0 R离心机(德国贝克曼公司);HV E-5 0高压灭菌锅(日本株式会社平山制作所);鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);TU 1 9 0 0紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);L C 1 2 0 0高效液相色谱仪(美国A g i l e n t公司);T r i p l e TO F 5 6 0 0液相色谱-质谱联用仪(美国 A B S c i e x公司);S 1 0 0 0梯度P C R仪、C F X 9 6 T o u c h荧光定量P C R仪(美国B i o-R a d公司).1.3 实验方法1.3.1 红曲菌的液态发酵 红色红曲菌M 7的活化和孢子制备参照L i等1 9的方法,将新鲜制备的1 05/m L的孢子悬液,以1%(体积分数)的接种量接入种子培养基中,3 0,1 8 0 r/m i n振荡培养2 d,再以4%(体积分数)的量接种到发酵培养基中,于不同温度(2 5、3 0、3 5、4 0)下,1 8 0 r/m i n振荡培养7 d.1.3.2 红曲色素的提取 由于在液态发酵过程中,醇溶性红曲色素除了存在于菌丝体细胞内,还能分泌至发酵液中结晶形成色素小颗粒2 0.因此,为了提取胞内、胞外总醇溶性红曲色素,选用快速滤纸对发酵液进行真空抽滤,收集菌丝体和胞外色素晶体的混合物2 0,用3倍发酵液体积的蒸馏水洗涤后,将菌丝体、胞外色素晶体和附着大量色素晶体的滤纸一起放入与发酵液等体积的体积分数为7 0%的乙醇溶液(p H=2.0)中,3 0,2 0 0 r/m i n振荡条件下避光浸提1 h,再次真空抽滤,得到的滤液即为红曲色素提取液,收集的菌丝于8 0 烘箱干燥至质量恒定后用于测定生物量.1.3.3 红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析 红曲色素提取液用体积分数为7 0%的乙醇溶液(p H=2.0)稀释一定倍数,以1 n m的间隔在3 5 05 5 0 n m进行光谱扫描.红色素、橙色素和黄色素的色价分别用5 1 0、4 7 0、4 1 0 n m处的吸光度A计算2 1,三者之和为总色价,代表红曲色素总产量2 2.色价/(Um L-1)=A稀释倍数.1.3.4 红曲色素的H P L C分析 红曲色素提取液用体积分数为7 0%的乙醇溶液(p H=2.0)稀释一定倍数,进样1 0 L进行H P L C分014河北大学学报(自然科学版)第4 3卷第4期徐勇等:温度对红色红曲菌M 7液态发酵产m o n a s c i n和a n k a f l a v i n的影响析.色谱柱:I n e r t s i l O D S-3(2 5 0 mm 4.6 mm,5 m);柱温:3 0;二极管阵列检测器(D A D)检测波长:2 1 06 0 0 n m,其中黄色素、橙色素和红色素组分的监测波长分别为3 9 0、4 7 0、5 2 0 n m.流动相A相为乙腈,B相为酸水(p H 3,甲酸调节),C相为去离子水,流速为 0.8 m L/m i n.梯度洗脱条件见表1.根据峰面积和标准曲线对各红曲色素组分的含量进行定量.表1 H P L C梯度洗脱条件T a b.1 G r a d i e n t e l u t i o n c o n d i t i o n s o f H P L Ct/m i n(流动相)/%ABC05 54 0536 53 052 59 0553 09 0553 15 54 054 05 54 051.3.5 红曲色素的L C-M S分析 样品处理同1.3.4.色谱柱:K i n e t e x 2.6 m F 5(1 0 0 mm 2.1 mm);柱温:3 0;流动相:A相为酸水(含体积分数0.1%甲酸),B相为乙腈;梯度洗脱条件:01 m i n,9 5%(体积分数,下同)A;18 m i n,9 5%A1 5%A;89 m i n,1 5%A;99.1 m i n,1 5%A9 5%A;9.11 1 m i n,9 5%A;流速:0.2 m L/m i n;进样量:1 0 L;D A D检测波长:2 1 06 0 0 n m;离子源:电喷雾电离(E S I),正离子模式;扫描范围:质荷比(m/z)1 0 01 0 0 0;电喷雾电压:5 5 0 0 V;离子源温度:5 5 0;雾化气压力3 7 9 k P a;辅助气压力3 7 9 k P a;气帘气压力1 7 2 k P a.1.3.6 q P C R分析 在红色红曲菌M 7液态发酵过程中,分别于第3、5、7天收集菌丝体,液氮速冻后-8 0 保存.采用T r i-o z o l法提取菌丝体总R NA,利用试剂盒H i S c r i p t I I Q R T S u p e r M i x合成c D NA,利用试剂盒C h a mQ U n i-v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x进行q P C R,检测各基因的表达量.q P C R反应体系:2q P C R M a s t e r M i x 1 0 L、上下游引物各0.4 L、c D NA 1 L、d d H2O 8.2 L;反应程序:9 5 预变性3 0 s,9 5 变性5 s,5 5 退火1 5 s,7 2 延伸 1 0 s,共4 0个循环.采用a c t i n作为内参基因,红曲色素合成相关基因的q P C R引物见表2.每个实验样本进行3个生物学重复和3个技术重复.采用2-C t 法计算各基因在不同样本中的表达量.表2 红曲色素合成相关基因的q P C R引物T a b.2 P r i m e r s o f q P C R f o r g e n e s r e l a t e d t o M o n a s c u s p i g m e n t s b i o s y t h e s i s基因名称N C B I登录号引物序列(5 -3)M r P i g AA L N 4 4 2 0 0G T C A T T G G C A T G T C G T G TAAG GG C A T C G T G G T C T C G GA T AAAGM r P i g FK X 2 7 8 3 0 6G G C AA C C A T A C T C C G A C T C A TA C C A C G T A T T C C G G TAA C C C TM r P i gHK X 2 7 8 3 0 8C C A G G G C C G C AAG T T T A T CC C G A T G C C G T T G T G A T T GA114续表2C o n t i n u e d T a b.2基因名称N C B I登录号引物序列(5-3)M r P i g JJ X 6 7 5 0 4 2C G C C C G T AAA G T T C G T C A G T AG C G T G G T G AA T C G G T AG A C AM r P i g KJ X 6 7 5 0 4 3G A G G AAA T G T C TA C C A C C G AG GG AA T C C A C C G A C C AA C C A G Ta c t i nHQ 1 2 3 0 4 5C A G G G AG AAG A T G A C C C A GAG T C A C C A GA G T C AAG C A C G A1.4 数据处理与分析采用I BM S P S S S t a t i s t i c s 2 5软件进行数据统计分析,O r i g i n 7.5软件进行绘图.实验数据均重复3次.2 结果与分析2.1 红曲色素的紫外-可见吸收光谱特征分析在红曲色素的发酵产物中,通常同时存在红色素(m a x=4 9 05 3 0 n m)、橙色素(m a x=4 6 04 8 0 n m)和黄色素(m a x=3 3 04 5 0 n m).作为食用色素使用时,红曲色素一般不需要分离纯化,直接以混合物形式使用2 3.因此,在红曲色素的常规发酵生产及研究中,紫外-可见吸收光谱法是最常用的色素分析方法,可用于表征红曲色素的色调和色价.红色红曲菌M 7在不同发酵温度下所产生红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析结果见图1.a.紫外-可见吸收光谱;b.色价和生物量图1 红色红曲菌M 7在不同发酵温度下所产红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析F i g.1 U V-V i s s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s o f M o n a s c u s p i g m e n t s p r o d u c e d a t d i f f e r e n t f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e s b y M.r u b e r M 7由图1 a可知,在不同温度条件下,红色红曲菌M 7所产生的红曲色素在3 5 05 5 0 n m均只有1个吸收峰,其中,在2 5 和3 0 时,最大吸收波长为4 7 0 n m,色调偏橙,说明在该条件下合成的橙色素较多;在3 5 和4 0 时,最大吸收波长分别为4 1 5 n m和3 8 8 n m,色调偏黄,说明提高发酵温度后,黄色素的比例增大.由图1 b可知,随着温度的升高,5 1 0 n m(红色)、4 7 0 n m(橙色)和4 1 0 n m(黄色)处的色价均先升高后降低,在3 0 时达到最大值,分别为2 7、4 6、2 6 U/m L;同时,生物量也在3 0 时达到了最大值.因此,从菌丝生长和色素色价来看,红色红曲菌M 7的最适液态发酵温度为3 0,与报道的最佳红曲色素发酵温度一致2 4-2 6.214河北大学学报(自然科学版)第4 3卷第4期徐勇等:温度对红色红曲菌M 7液态发酵产m o n a s c i n和a n k a f l a v i n的影响2.2 红曲色素的H P L C指纹图谱特征分析利用H P L C分析了红色红曲菌M 7在不同发酵温度下所产生的红曲色素的组成成分,其H P L C指纹图谱见图2,各色素组分的紫外-可见吸收光谱和质谱分别见图3和图4.圆饼图为不同色素组分的峰面积百分比图2 红色红曲菌M 7在不同发酵温度下所产红曲色素的H P L C图谱F i g.2 H P L C p r o f i l e s o f M o n a s c u s p i g m e n t s p r o d u c e d a t d i f f e r e n t f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e s b y M.r u b e r M 7图3 不同色素组分的紫外-可见吸收光谱F i g.3 U V-V i s s p e c t r a o f d i f f e r e n t p i g m e n t c o m p o n e n t s314图4 不同色素组分的质谱F i g.4 M a s s s p e c t r a o f d i f f e r e n t p i g m e n t c o m p o n e n t s在2 54 0,红色红曲菌M 7共产生8种色素组分,分别为Y 1Y 4、O 1O 4(图2),其中,Y 1Y 4最大吸收波长为3 7 03 9 0 n m(图3),符合典型的红曲黄色素的吸收光谱特征,准分子离子M+H+峰分别为m/z 3 5 7.1 7、3 5 9.1 9、3 8 5.2 0和 3 8 7.2 2(图4),结合文献报道1-2,推断Y 1Y 4分别为红曲黄色素中的m o n a s f l u o r e A(MF A,C2 1H2 4O5)、M S(C2 1H2 6O5)、m o n a s f l u o r e B(MF B,C2 3H2 8O5)和A F(C2 3H3 0O5);O 1O 4的最大吸收波长约为4 7 0 n m(图3),符合典型的红曲橙色素的吸收光谱特征,准分子离子M+H+峰分别为m/z 3 5 5.1 5、3 8 7.1 8、3 8 3.1 8和 4 1 5.2 1(图4),结合文献报道1-2,推断O 1O 4分别为红曲橙色素 中 的 红 斑 素(R P,C2 1H2 2O5)、m o n a s p h i l o l-m e t h o x y A(MMA,C2 2H2 6O6)、红 曲 红 素(MR,C2 3H2 6O5)和m o n a s p h i l o l-m e t h o x y B(MMB,C2 4H3 0O6).如图2所示,当发酵温度为2 5 和3 0 时,共检测到2种黄色素和4种橙色素组分,分别为M S(Y 2)、A F(Y 4)、R P(O 1)、MMA(O 2)、MR(O 3)和MMB(O 4),其中R P(O 1)和MR(O 3)的峰面积百分比较大,共约为7 1%(2 5)和7 9%(3 0),其次为M S(Y 2)和A F(Y 4),共约占2 3%(2 5)和1 4%(3 0);当发酵温度升到3 5 时,检测到全部的8种色素组分,峰面积百分比较大的组分除了R P(O 1)和MR(O 3),共约占4 9%,还包括M S(Y 2)和A F(Y 4),共约占3 8%;当发酵温度升到4 0 时,检测到4种黄色素和2种橙色素组分,分别为MF A(Y 1)、M S(Y 2)、MF B(Y 3)、A F(Y 4)、R P(O 1)和MR(O 3),峰面积百分比较大的为M S(Y 2)和A F(Y 4),共约占5 5%,其次为MF A(Y 1)和MF B(Y 3),共约占3 3%.由此可见,提高发酵温度至3 5 以上,有利于提高红曲色素产物中黄色素组分M S(Y 2)、A F(Y 4)、MF A(Y 1)、MF B(Y 3)的比例.该结414河北大学学报(自然科学版)第4 3卷第4期徐勇等:温度对红色红曲菌M 7液态发酵产m o n a s c i n和a n k a f l a v i n的影响果与图1所示的不同发酵温度下红曲色素发酵产物的紫外-可见吸收光谱特征相符合.2.3 红曲色素组分的产量分析至今已报道的红曲色素组分有1 0 0多种1,但目前的研究主要集中于6种主要的色素组分,包括2种黄色素组 分M S(Y 2)和A F(Y 4)、2种 橙 色 素 组 分R P(O 1)和MR(O 3)、2种 红 色 素 组 分 红 斑胺(r u b r o p u n c t a m i n e,R P A)和红曲红胺(m o n a s c o r u b r a m i n e,MR A).利用H P L C对所检测到的8种色素组分分别进行了定量分析,其中MF A(Y 1)、MF B(Y 3)、MMA(O 2)和MMB(O 4)4种色素为非主要色素组分,目前研究较少,还未见商业化的标准品,参照H u a n g等1 8利用H P L C峰面积对其进行了相对定量,每产生1 0 0 0 mA us峰面积的色素量记为1 AU,结果见图5.a.橙色素;b黄色素图5 红色红曲菌M 7在不同发酵温度下的红曲色素组分产量F i g.5 Y i e l d s o f d i f f e r e n t M o n a s c u s p i g m e n t c o m p o n e n t s p r o d u c e d b y M.r u b e r M 7 a t d i f f e r e n t f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e s由图5可知,随着温度的升高,各色素组分的产量均先升高后降低.在2 5 和4 0 时,各色素组分的产量均显著低于3 0 和3 5(P0.0 5);在3 0 时,4种橙色素的产量均达到最大值,其中2种主要橙色素组分R P(O 1)和MR(O 3)的产量分别为1 0 7 m g/L和1 2 4 m g/L,而2种主要黄色素组分M S(Y 2)和A F(Y 4)的产量较低,分别为4 8 m g/L和2 6 m g/L;在3 5 时,4种黄色素的产量均达到最大值,其中2种主要黄色素组分M S(Y 2)和A F(Y 4)的产量分别为1 0 0 m g/L和4 7 m g/L,而2种主要橙色素组分R P(O 1)和MR(O 3)的产量相对3 0 显著下降(P0.0 5),分别为5 7 m g/L和5 0 m g/L.由此可见,将培养温度从3 0 提高到3 5,虽然色素总量显著下降(P0.0 5),4种主要色素组分R P(O 1)、MR(O 3)、M S(Y 2)和A F(Y 4)的总产量由3 0 5 m g/L降到了2 5 4 m g/L,但能显著促进黄色素的产生,可使M S(Y 2)和A F(Y 4)的总产量提高9 8%.2.4 红曲色素生物合成相关基因表达量的分析目前,红曲色素生物合成途径已经得到初步阐释1-2,其中6种主要色素成分的合成过程如下:聚酮合酶M r P i g A以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸为底物,合成得到聚酮化合物,再经过还原、氧化步骤,生成红曲色素的嗜氮酮母环结构;脂肪酸合成酶M r P i g J和M r P i g K以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物,合成得到的-酮酸被酰基转移酶转移到嗜氮酮母环的羟基上,再经过一系列反应生成一对色素中间体1和2;F A D氧化还原酶M r P i g F和烯酰还原酶M r P i g H催化色素中间体1和2分