肺靶向红霉素明胶微球的安全性评价.pdf

广东省药学会学术年会论文集大会论文肺靶向红霉素明胶微球的安全性评价佃少娜1 r，伍善广2，李桃1，杨帆2，郑春铭1，傅英梅，余丽娴2(广东省人民医院，广东广州5 1 0 0 8 0；2 广东药学院药科学院，广东广州5 1 0 0 0 6)摘要：目的评价肺靶向红霉素明胶微球(E M-G M S)的安全性，进行急性毒性、血管刺激性、体外溶血作用及过敏性反应试验。方法采用小鼠急性毒性L D 5 0、兔耳缘静脉血管刺激性、豚鼠全身过敏性及体外溶血试验对制剂进行安全性考察。结果E M-G M S 小鼠尾静脉注射L D 5 0=1 7 3 0 7m g k g l，9 5 的可信限为1 5 7 6 3-1 9 0 0 5m g k g 一1；空白明胶微球(G M S)小鼠尾静脉注射L D 5 0=1 9 1 0 1m g k g-I，9 5 的可信限为1 7 2 3 2 2 1 1 7 9m g k g 一1；注射用乳糖酸红霉素(E M)小鼠尾静脉注射L D 5 0=3 3 7 7 0m g k g l，9 5 的可信限为3 0 4 3 2 3 7 5 4 0m g k g I。未观察到血管刺激性、溶血作用。豚鼠致敏试验未引起豚鼠的过敏反应。结论红霉素明胶微球在该实验条件下是安全的。关键词：红霉素明胶微球；急性毒性；溶血试验：血管刺激性；过敏性反应红霉素(E r y t h r o m y c i n)是临床上治疗支原体肺炎、军团菌肺炎的首选药物，但在体内分布广泛、有效治疗浓度维持时间短，容易诱发耐药性。笔者采用明胶为载体材料，采用乳化缩聚法成功制备出平均粒径满足肺靶向微球粒径(5-2 5 1,I)要求的红霉素明胶微球。3。为评价该制剂的安全性，本研究进行Y 4,鼠急性毒性试验、兔耳缘静脉血管刺激性试验及体外溶血试验。1 材料1 1 动物昆明种小鼠，体重1 8 2 2g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2 0 0 7 A 0 0 6。新西兰兔，雄雌各半，体重2 O 一2 5 k g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2 0 0 7 A 0 0 1。H a r t l e y 豚鼠，体重2 5 0-3 5 0 9。雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2 0 0 6 A 0 2 0。1 2 试药红霉素明胶微球(简称E R-G M S，由广东药学院药科学院自制，批号：0 6 0 6 1 8，规格O 5 9 瓶)；空白明胶微球(简称E M-G M S，由广东药学院药科学院自制，批号：0 6 0 5 1 6，规格O 5 9 瓶)；注射用乳糖酸红霉素(简称E M，大连美罗制药厂，批号：2 0 0 5 0 4 0 6，0 2 5 9 瓶)；0 9 氯化钠注射液(湖南康源制药有限公司，批号：0 7 0 5 0 9 0 2，1 0 0 L 袋)；灭菌注射用水。E M-G M S 混悬液及G M S 混悬液的配制方法：无菌条件下操作，将E M-G M S 或G M S 分散于生理盐水中。酬注射液配制方法：无菌条件下操作，将E M 加入生理盐水中振摇溶解。1：5 稀释蛋清：无菌条件下操作。取新鲜蛋清，用I：5 生理盐水稀释。1 3 仪器L S-1 0 0 石蜡包埋机(沈阳市龙首电子仪器有限公司)；L S-2 0 5 5 石蜡切片机(沈阳市龙首电子仪器有限公司)；光学显微镜及显微摄影系统(日本O l y m p u s 公司)；电热恒温水浴锅(上杭仪器有限公司)：8 0 0 型离心机(江苏省江苏金坛市华欧实验仪器厂)。基金项目：广东省科技计划资助项目(2 0 0 5 8 3 0 1 0 1 0 1 5)；广州市科技计划资助项目(2 0)5 2 3 E 0 5 4 1)。作者简介：佃少娜，女，大专，副主任药师，研究方向：医院药学2 4 6 广东省药学会学术年会论文集大会论文2 实验方法2 1 小鼠静脉注射给药的急性毒性实验以生理盐水为分散介质，按药品；生理盐水=l：O 7 5 比例配制供试样品。根据预试验结果，将E M-(；M S 组、G M s、E M 组按表I 进行剂量设置，剂量间距为0 8 3。取禁食1 2h 昆明种小鼠1 5 0 只，随机分为1 5 组，每组1 0 只。各取5 组分别小鼠尾静脉注射E M-G M S 混悬液、G M S 混悬液、E M 注射液。给药后观察小鼠的反应及症状，记录死亡小鼠数，存活小鼠观察至第1 4 d。记录小鼠试验前后体重变化。并对死亡小鼠进行尸检，观察主要脏器有无明显病变”。2 2 血管刺激性试验取新西兰大白兔6 只，随机分成2 组，每组3 只，依文献。1 方法，以生理盐水为阴性对照，注射用乳糖酸红霉素为阳性对照，进行低(2 m g 舶L I，以红霉素计)、中(3 5m g m L I)和高(5m g m L 一1)剂量耳缘静脉多次给药刺激性观察。第一组左耳静脉推注E M-G M S 混悬液，注射液5 m l 只；右耳静脉注射等量生理盐水作阴性对照，推注速度为I m l m i n I，每天一次，连续给药3 天。第二组作为阳性对照组，进行相同剂量试验。肉眼观察注射部位的血管及其周围组织的变化。3。末次给药后2 4h 处死兔子，于注射处和远离注射处约5 c m 处各取一段血管，立即放入1 0 的福尔马林溶液中固定，常规组织切片，光镜检查，观察其病理组织学改变晤1。2 3 体外溶血试验依文献“1 方法处理血样、进行溶血作用试验。取试管7 支，管卜5 各加0 I，0 2，0 3，0 4，0 5 m L E M G M S 混悬液(5 m g m L 一1)，6 管加生理盐水2。5 m L 作为阴性对照，7 管加蒸馏水2 5 m L 作为阳性对照。摇匀后，密封，3 7 水浴恒温3h。分别于1 5、3 0、4 5 m i n 及I 0、2 0、3 0 h 各观察1 次。末次观察后，将各试管充分振摇，观察有无沉淀和凝集现象。做常规方法红细胞镜检。2 4 致敏性实验参照文献”1 进行全身过敏性试验。取健康豚鼠1 8 只，随机分成3 组(每组6 只)，分别为红霉素明胶微球组、稀释蛋清阳性对照组及生理盐水注射液阴性对照组。隔日分别腹腔注射红霉素明胶微球生理盐水混悬液、I：5 稀释蛋清和生理盐水注射液0 5 m L，共3 次。致敏后将各组动物分为2 批，每批3 只，一批于首次注射受试药后1 4 天静脉注射受试品2 m l 只攻击；另一批于首次给药后第2 l 天静脉注射2 m l 只攻击。观察注射后是否有抓鼻、竖毛、颤抖、咳嗽、痉挛、呼吸困难、抽搐、休克死亡等过敏现象。3 试验结果3 1 急性毒性试验结果小鼠尾静脉注射红霉素明胶微球及空白明胶微球后，高剂量组立即出现躁动不安、竖毛，呼吸加快，部分小鼠抽搐死亡，部分小鼠数分钟后症状缓解。死亡多发生1 2 小时之内。死亡动物解剖观察，肉眼观察发现肺部淤血，心、肝、脾、肾等器官无明显病变。未死动物1 4 天后仍活动正常。尾静脉注射乳糖酸红霉素后，部分小鼠出现呼吸急速，抽搐，惊厥等中毒症状，部分小鼠抽搐死亡现象，死亡多发生2 4 小时之间。E M-G M S、G M S 及E M 各剂量小鼠平均体重试验前后相比变化不大(5 )，死亡小鼠体重无异常变化(5 )。采用B l i s s 法计算受试动物的半数致死量(L D 5 0)及9 5 置信区间，结果如表I、表2 及表3。2 4 7 表i 小鬣一次静脉注射药物的L 0 8 0 结*T a b1D e t e m ir m t i o No fL D S Oa f t e rl vd r u gi n 口i c e药物栅量D对披剂量动物教死亡戤L D S O9 碍的日信限2 5 0023 0 81 01 0删G M S2 0 8023 1 8l O81 7 3022 0 81 051 7 30 71 5 76 p 1 9 00 51 4 402 1 5 81 021 2 0020 7 91 002 8 0024 4 71 01 0G d S2 3 1023 6 41 071 9 n622 8 01 061 9 1O l1 7 23 2-2 1 17 91 5 722l 1 0Z1 3 002 1 1 41 0126 0 81 01 026 0 51 0725 2 01 053 3 77 03 0 43 2-3 7 54 024 3 51 0223 5 01 003 2 血管捌量性试冀螭幂上述几缉试验中，新日兰兔耳#射部位均未见损伤性病变痛理组织学检直(切片见下图)结果表明n 罩蠢明腔微球连续碧药3 天，兔耳缘静脉管壁完整，自皮细胞结构清楚。对照生4 盐水组、蛀射用乳糖酸“霉素参m 兔耳缘静脉的组织变化与受试药物组相似。表明乳糖酸n 霉素理盐水液厦n 霉素明胶徽辟4 盐水混悬漉在试验剂量下均无m 管刺激性。霹雕露圈阂直D8圈l 暑组新目!兔耳缘静脉病理m 织圈(1 0 2 0)一2 4 8 广东省药学会学术年会论文集大会论文A 乳糖酸红霉素低剂量组；B 乳糖酸红霉素中剂量组；C 乳糖酸红霉素高剂量组：D 红霉素明胶微球低剂量组；E 红霉素明胶微球中剂量组；F 红霉素明胶微球高剂量组F i g1T h ep h o t o g r a p ho fe a rv e i np a t h o l o g i ct i s s u eo fr a b b i ti ne a c hg r o u p sA 1 0 wd o s eg r o u po fE M；B m i d d l ed o s eg r o u po fE M；C。h i g hd o s eg r o u po fE M；D 1 0 wd o s eg r o u po fE M-G M S；E m i d d l ed o s eg r o u po fE M-G M S；F h i g hd o s eg r o u po fE M-G M S3 3 溶血试验结果结果显示，管1-5 加入不同剂量的E M-G M S 混悬液发现无溶血作用体外溶血作用及红细胞凝集现象，与阴性对照组生理盐水比较无明显差别，阳性对照组蒸馏水组则完全溶血，形成红色透明溶液。对无溶血作用的试样作常规方法红细胞镜检，发现无红细胞破裂及形态异常现象。3 4 过敏性试验结果E M-G M S 组和生理盐水阴性对照组两次攻击试验后豚鼠活动正常，未观察到过敏症状及其他不良反应，试验结果均为阴性：而阳性对照组可使受试动物出现竖毛、呼吸困难、痉挛、休克死亡等致敏反应，试验结果为阳性。4 讨论小鼠尾静注E M-G M S、G M S 及E M 后L D 5 0 分别为1 7 3 0 7、1 9 1 0 1、3 3 7 7m g k g-1。E M 的L D 5 0 与文献”1 报道3 8 9 1 m g k g I 相比略有差别：有文献。3 报道肺靶向空白明胶微球小鼠尾静注L D 5 0 为1 0 8 2m g k g I，本文与之相比有所差别。E M-G M S 与G M S 的L D 5 0 值比较接近，与E M 相比则相差较大，说明静脉注射明胶微球主要毒性是微球本身的毒性。肺部毛细血管极为丰富，内皮表面区域相当大，作为肺靶向药物，关键是控制微球的大小，使其静脉注射后机械截留于肺部，提高肺部药物浓度。但微球在肺部浓集的同时，由于微球的降解需要一定的时间，微球在降解过程中，微球的溶胀及粘连程度都在变化，其与体细胞间的作用也在变化，由此可导致局部栓塞“”。这可能是静脉注射肺靶向微粒毒性形成的重要原因。这提示我们在制备肺靶向微球的过程中，控制好粒径的同时努力提高载药量以减少微球用量。红霉素的临床静注剂量约为1 0 1 5m g k g 一1。“。当红霉素明胶微球按1 5m g k g-I(以红霉计)左右的剂量给药时，则出现兔子立即死亡现象。所以本文血管刺激性试验中没有按临床剂量剂量给药，而是根据E M-G M S 小鼠尾静注L D 5 0 的1 5 1 1 0 作为血管刺激性注射剂量设计的参考，以L D 5 0 的I 1 0 开始逐渐增加试验剂量“”。通过预试验，发现试验剂量未见新西兔有中毒症状，并以此作为实验的依据。试验结果表明E M-G M S 在试验剂量下，兔耳缘静脉未见血管刺激性，体外溶血试验未见溶血和血球凝集反应：豚鼠致敏试验结果表明无明显过敏反应。说明E M-G M S 在本实验条件下是安全的。参考文献：陈新谦，金有豫主编新编药物学【M 1 第1 4 版北京：人民卫生出版社，2 0 0 2：7 8【2】李桃，杨帆，佃少娜，等红霉素明胶微球制备工艺研究叽南方医科大学学报2 0 0 6，2 6(1 2)：1 7 8 0 1 7 8 1【3】钱之玉主编药理学实验与指导【M】第1 版北京：中国医药科技出版社，2 0 0 3：1 5 3 1 7 9【4】孙世明，何林，吴正中，等注射用阿克拉霉素A 固体脂质纳米粒小鼠体内抗肝癌活性及急性毒性研究U】中国药房。2 0 0 5，1 6(1 8)：1 3 7 2 1 3 7 4 2 4 9 广东省药学会学术年会论文集大会论文【5】方金玲，王艳娇，何仲贵，等注射用罗红霉素的制备及安全性评价】中国药剂学杂志，2 0 0 6，4(6)：2 5 4-2 5 7【6】6 陈奇主编中药药理研究方法学【M】第1 版北京：人民卫生出版社，1 9 9 6：1 6 8 1 6 9【7】徐叔云，卞如濂，陈修药理实验方法学【M】第2 版北京：人民卫生出版社，1 9 9 1：2 2 4 2 2 6【8】唐秋瑾，凌大奎，中玉珍，等乳糖酸红霉素中主要降解物的分离、鉴别及其生物活性的研究【J】药物分析杂志1 9 8 9 9(2)：8 5-8 9【9】BL u，J QZ h a n g，HY a n g L u n g t a r g e t i n gm i c r o s p h e r e so fc a r b o p h t i n I J l I n t e r n a t i o n a lJ o u m a lo fP h a r m a c e u t i c。2 0 0 3，2 6 5：11 1【1o】李风前，陆彬，陈文彬肺靶向汉防己甲素缓释微囊的安全性评价1 中国现代应用药学杂志，2 0 0 2，1 9(6)：4 7 8-4 8 0【1 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