动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证.pdf

69动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证一、背景在现代化农业生产过程中，牛肉，猪肉，鸡肉和火鸡等在饲养环节往往在饲料中使用大量抗生素来辅助预防和治疗疾病。-内酰胺类，大环内酯类，磺胺类，四环素等抗生素，是畜牧饲养生产中不可缺少的一部分。然而，食品中抗生素的残留可能会对人类造成潜在的危害，长期摄入可能会产生抗药性。许多国家已经建立了一系列有关这些抗生素在动物生产中使用、用量和停药的法规。目前已有多种方法来进行抗生素残留的测定，包括生物测定，免疫法，薄层层析法等，而LC-MS/MS因为其较高的选择性和灵敏度能帮助进行更好的检测和确证，所以得到更广泛的应用。本文包含多类抗生素的筛选方法，包括-内酰胺类，四环素，磺胺类，大环内酯类，氯霉素类，氟喹诺酮类，抗寄生虫等。具体的化合物信息详见化合物列表。采用scheduled-MRM-IDA-EPI（增强子离子扫描）的技术路线来进行检测，同时得到MRM离子对的定量数据以及高灵敏度的二级质谱谱图。采用正离子和负离子两种采集方法，以达到最高的灵敏度。其中正离子可同时进行76种抗生素的定量和筛查，负离子可同时进行18种抗生素的定量和筛查。二、目标化合物列表动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证中文名称 英文通用名 分子式2-巯基苯并咪唑 2-mercaptobenzimidazole C7H6N2S阿苯达唑 Albendazole C12H15N3O2S阿苯达唑胺砜 Albendazole Amino Sulfone C10H13N3O2S阿苯达唑砜 Albendazole Sulfone C12H15N3O4S阿苯达唑亚砜 Albendazole Sulfoxide C12H15N3O3S阿莫西林 Amoxicillin C16H19N3O5S杆菌肽 Bacitracin C66H103N17O16S卡巴氧 Carbadox C11H10N4O4头孢噻夫 Ceftiofur C19H17N5O7S3 金霉素 Chlortetracycline C22H23ClN2O8环丙沙星 Ciprofloxacin C17H18FN3O3克林霉素 Clindamycin C18H33ClN2O5S 达氟沙星 Danofloxacin C19H20FN3O3癸氧喹酯 Decoquinate C24H35NO5去乙烯环丙沙星 Desethylene Ciprofloxacin C15H16FN3O3二氟沙星 Difloxacin C21H19F2N3O3二甲硝咪唑 Dimetridazole C5H7N3O2多西环素 Doxycycline C22H24N2O8依诺沙星 Enoxacin C15H17FN4O3恩诺沙星 Enrofloxacin C19H22FN3O370红霉素 Erythromycin C37H67NO13芬苯达唑 Fenbendazole C15H13N3O2S芬苯达唑砜 Fenbendazole Sulfone C15H13N3O4S芬苯达唑亚砜 Fenbendazole Sulfoxide C15H13N3O3S氟苯尼考 Florfenicol C12H14Cl2FNO4S 氟苯尼考胺 Florfenicol Amine C10H14FNO3S氟甲喹 Flumequine C14H12FNO3布洛芬 Ibuprofen C13H18O2交沙霉素 Josamycin C42H69NO15酮洛芬 Ketoprofen C16H14O3拉沙里菌素 Lasalocid C34H53NaO林可霉素 Lincomycin C18H34N2O6S洛美沙星 Lomefloxacin C17H19F2N3O3甲苯达唑 Mebendazole C16H13N3O3甲硝唑 Metronidazole C6H9N3O3米诺环素 Minocycline C23H27N3O7莫能菌素 Monensin C36H62O11那拉霉素 Narasin C43H72O11诺氟沙星 Norfloxacin C16H18FN3O3新生霉素 Novobiocin C31H36N2O11氧氟沙星 Ofloxacin C18H20FN3O4奥比沙星 Orbifloxacin C19H20F3N3O3惡喹酸 Oxolinic Acid C13H11NO5羟基保泰松 Oxyphenbutazone C19H20N2O3土霉素 Oxytetracycline C22H24N2O9保泰松 Phenylbutazone C19H20N2O2雷托巴胺 Ractopamine C18H23NO3罗硝唑 Ronidazole C6H8N4O4沙拉沙星 Sarafloxacin C20H17F2N3O3螺旋霉素 Spiramycin C43H74N2O14磺胺醋酰 Sulfacetamide C8H10N2O3S磺胺氯达嗪 Sulfachloropyridazine C10H9ClN4O2S磺胺嘧啶 Sulfadiazine C10H10N4O2S磺胺二甲嘧啶 Sulfadimethoxine C12H14N4O4S磺胺多辛 Sulfadoxine C12H14N4O4S磺胺脒 Sulfaguanidine C7H10N4O2S磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine C11H12N4O2S71磺胺二甲嘧啶 Sulfamethazine C12H14N4O2S磺胺甲二唑 Sulfamethiazole C9H10N4O2S2磺胺甲惡唑 Sulfamethoxazole C10H11N3O3S磺胺甲氧嗪 Sulfamethoxypyridazine C11H12N4O3S磺胺 Sulfanilamide C6H8N2O2S磺胺吡啶 Sulfapyridine C11H11N3O2S磺胺喹惡啉 Sulfaquinoxaline C14H12N4O2S柳氮磺胺吡啶 Sulfasalazine C18H14N4O5S磺胺噻唑 Sulfathiazole C9H9N3O2S2磺胺异惡唑 Sulfisoxazole C11H13N3O3S四环素 Tetracycline C22H24N2O8四咪唑 Tetramisole C11H12N2S噻菌灵 Thiabendazole C10H7N3S甲砜氯霉素 Thiamphenicol C12H15Cl2NO5S替米考星 Tilmicosin C46H80N2O13 托灭酸 Tolfenamic acid C14H12ClNO2三氯苯哒唑 Triclabendazole C14H9Cl3N2OS泰乐菌素 Tylosin C46H77NO172-喹喔啉羧酸 2-quinoxalinecarboxylic acid C9H6N2O26-苯基-2-硫脲嘧啶 6-phenyl-2-thiouracil C10H8N2OS氨苄西林 Ampicillin C16H19N3O4S氯霉素 Chloramphenicol C11H12Cl2N2O5氯唑西林 Cloxacillin C19H20ClN3O6S双氯酚酸 Diclofenac C14H11Cl2NO2安乃近 Dipyrone C13H17N3O4S乙哚乙酸 Etodolac C17H21NO3氟苯尼考 Florfenicol C12H14Cl2FNO4S氟尼克辛 Flunixin C14H11F3N2O2拉沙里菌素 Lasalocid C34H54O8萘普生 Naproxen C14H14O3尼卡巴嗪 Nicarbazin C19H18N6O6氯硝柳胺 Niclosamide C13H8Cl2N2O4青霉素G Penicillin G C16H18N2O4S雷复尼特 Rafoxanide C19H11Cl2I2NO3磺胺硝苯 Sulfanitran C14H13N3O5S甲砜氯霉素 Thiamphenicol C12H15Cl2NO5S动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证72三、样品制备方法牛肾/肾积液或血清样品11.称取1 g牛肾匀浆样品，肾汁，或血清放入50 mL FEP（氟化乙烯丙烯）管。2.添加5 L内标溶液。3.加入2 mL水和8 mL乙腈。4.使用旋涡混合器进行混合，然后摇动5 min。5.离心5 min。6.将上清液倒出至一50毫升试管，加入500 mg C18吸附剂。7.使用旋涡混合器混合30秒。8.离心1 min。9.取5 mL上清液，浓缩至1 mL后，用水定容至1 mL。10.过滤（PVDF，0.45 m）至进样小瓶，待用。牛奶21.称10 g牛奶至一个干净的50毫升试管。2.加入10 mL乙腈和10 L内标溶液（100 g/mL），剧烈震摇1分钟。3.添加QuEChERS 预处理填料Q110 Packets3(P/N 26213,Restek)，剧烈震摇1分钟。4.5000转离心5 min。5.1mL上清液转移到2 mL试管，加入150 mg硫酸镁和50 mg C18（特殊定制，Restek），剧烈震摇1分钟。6.5000转，离心5 min。7.将500 L上清转移到一个干净的1.5 mL离心管，40下进行氮吹至微干，50 L甲醇复溶，涡旋，离心；8.再用450 L蒸馏水进行稀释复溶；9.过滤（PVDF，0.45 m）至进样小瓶，待用蜂蜜21.称取蜂蜜5克和水5克到一个干净的50毫升试管里，拌匀。2.可选步骤：添加200 L 5N氢氧化钠（NaOH）用来调节pH，后拌匀。注：这一步将减少基体效应，并改善一些化合物的回收率（例如，氯唑西林，青霉素G，沙拉沙星等碱性抗生素），然而，一些其他化合物的回收率显著降低（头孢噻呋，单诺沙星，二氟沙星，恩诺沙星，奥比沙星等酸性抗生素，并依此类推）。3.加入10 mL的乙腈和10 L内标溶液（100 g/mL），剧烈震摇1 min。4.添加QuEChERS预前处理填料Q110 Packets(P/N 26213,Restek)，剧烈震摇1分钟。5.5000转，离心5 min。6.1 mL上清液转移到2 mL试管，加入150 mg硫酸镁和50 mg C18（特殊定制，Restek)，剧烈震摇1分钟。7.5000转，离心5 min。8.将500 L上清转移到一个干净的1.5 mL离心管，40下进行氮吹至微干，50 L甲醇复溶，涡旋，简单离心；739.再用450 L蒸馏水进行稀释复溶；10.过滤（PVDF，0.45 m）至进样小瓶，待用；四、色谱分离条件流动相：A：含0.1%甲酸的水（V/V）溶液；B：含0.1%甲酸的乙腈（V/V）溶液色谱柱：Phenomenex分析柱，3 m 110,Gemini C18 Column,502 mm（P/N 00B-4439-B0）Phenomenex保护柱，C18 42 mm（P/N AJ0-4286）含保护柱柱套（P/N KJ0-4282）Shimadzu Prominence系统：CBM-20A 系统控制器 LC-20AD X 泵（带有100 L半微量混合器）DGU-20A3 在线脱气机 SIL-20AC 自动进样器 CTO-20AC柱温箱流动相梯度条件:步骤分析时间（min）ModuleEvent%B10PumpsPump B Conc.220.30PumpsPump B Conc.237.27PumpsPump B Conc.8047.37PumpsPump B Conc.99510.9PumpsPump B Conc.99611PumpsPump B Conc.2715.00PumpsPump B Conc.2815.01ControllerStop流速:0.5 mL/min 柱温:40 进样体积:10 L 洗针模式:Before and after aspiration（甲醇作为洗针液）Rinse dip time（洗针时间）:3 s 注：洗针可有效减少样品残留；五、质谱检测质谱系统为AB SCIEX 4000 QTRAP系统，TurboIon Spray 离子源 正离子分析模式源/气体参数动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证74CUR:25 psi IS:5500 V TEM:600 GS1:60 psi GS2:60 psi Ihe:On CAD:highScheduled MRM设置方法：MRM检测窗口时间：120 s 目标扫描时间：0.5 s Q1 单位分辨 Q3 单位分辨 化合物MRM参数和保留时间 分析物 Q1(m/z)Q3(m/z)保留时间（min）2-mercaptobenzimidazole 151.2 93 3.12Albendazole 266.1 234.1 5.30Albendazole Amino Sulfone 240.1 133.1 1.83Albendazole Sulfone 298.1 266.2 4.54Albendazole Sulfoxide 282.1 208.1 4.17Amoxicillin 366.1 349.1 1.00Bacitracin 712 669.6 4.64Carbadox 263.1 231.1 3.93Ceftiofur 524 241.2 5.54Chlorotetracycline 479.3 444 3.45Ciprofloxacin 332.2 314.2 2.79Clindamycin 425.4 126.1 3.85Danofloxacin 358.2 340.2 2.93Decoquinate 418.3 344.4 8.47Desethylene Ciprofloxacin 306.2 288.1 2.61Difloxacin 400.2 356.3 3.01Dimetridazole 142.1 96.1 1.89Doxycycline 445.2 428.3 3.99Enoxacin 321.2 303.2 2.66Enrofloxacin 360.3 342.2 2.92Erythomycin 734.6 158.2 4.80Fenbendazole 300.1 268.1 6.32Fenbendazole Sulfone 332.1 300.2 5.28Fenbendazole Sulfoxide 316.1 159.2 4.9775Florfenicol Amine 248.1 230.2 0.33Flumequine 262.1 202.1 5.51Ibuprofen 207.1 161.2 7.47Indomethacin 358.1 139.1 7.47Ipronidazole-OH 186.1 168.1 3.30Josamycin 828.7 109.1 5.38Ketoprofen 255.1 209.2 6.41Lasalocid 613.4 377.5 8.79Lincomycin 407.4 126.1 1.84Lomefloxacin 352.2 265.2 2.91Mebendazole 296.1 264.1 5.70Metronidazole 172.1 128.1 1.75Minocycline 458.2 441.3 2.10Monensin 693.4 675.7 8.51Narasin 787.5 531.6 8.61Norfloxacin 320.2 276.2 2.69Novobiocin 613.2 189.2 8.30Ofloxacin 362.2 318.2 2.62Orbifloxacin 396.2 352.3 2.99Oxolinic acid 262.1 244 4.75Oxyphenbutazone 325.2 204.2 6.24Oxytetracycline 461.2 426.1 2.85Phenylbutazone 309.2 160.2 7.08Ractopamine 302.2 107 2.59Ronidazole 201.1 140.1 2.01Sarafloxacin 386.3 368.1 3.08Spiramycin 422.5 174.1 3.39Sulfacetamide 215.1 156.1 1.69Sulfachloropyridazine 285 156.1 3.45Sulfadiazine 251.1 156 2.20Sulfadimethoxine 311.1 156.2 4.51Sulfadoxine 311.2 156.2 3.76Sulfaguanidine 215 156.1 0.59Sulfamerazine 265.1 92.2 2.71Sulfamethazine 279.2 92.1 3.14Sulfamethizole 271.2 156.1 3.16动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证76Sulfamethoxazole 254.1 156.1 3.54Sulfamethoxypyridazine 281.1 155.9 3.29Sulfanilamide 173.1 92.1 0.66Sulfapyridine 250.1 156.1 2.51Sulfaquinoloxaline 301.1 156.1 4.71Sulfasalazine 399.3 381.3 7.68Sulfathiazole 256.1 156.1 2.45Sulfisoxazole 268.1 156.1 3.79Tetracycline 445.2 410.1 2.72Tetramisole 205.2 178.2 1.01Thiabendazole 202.1 175.1 2.40Tilmicosin 435.6 695.7 3.95Tolfenamic acid 262.1 209.1 8.13Triclabendazole 359 344.1 7.92Tylosin 916.7 174.3 4.91Sulfamethazine-d4 283.1 186.1 3.13负离子分析模式CUR:25 psi IS:4500 TEM:600GS1:60 psi GS2:60 psi Ihe:On CAD:High Analyte Q1(m/z)Q3(m/z)保留时间（min）2-quinoxalinecarboxylic acid 172.9 102 4.36 6-phenyl-2-thiouracil 203.1 58 4.09 Ampicillin 348 207 2.77 Chloramphenicol 321.1 152 4.25 Cloxacillin 434.1 292.9 7.04 Diclofenac 293.9 250 7.43 Dipyrone 310 191.1 6.00 Etodolac 286.1 242.1 7.28 Florfenicol 356.1 185 3.59 77Flunixin 295.1 191 6.90 Lasalocid 589.3 191.2 8.79 Naproxen 229 170 6.56 Nicarbazin 301 107.1 7.17 Niclosamide 325 289 8.26 Penicillin G 333 192.4 6.00 Rafoxanide 623.9 345 9.07 Sulfanitran 334 136 5.55 Thiamphenicol 354 289.9 2.91 EPI(Enhanced Product Ion)Scan 参数设置：QTRAP部分参数设置：IDA 设置：动物源性食品中近百种常见抗生素的筛查和谱库检索确证78六、实例数据展示：94种混合抗生素标样（含内标）谱图实际牛肾样品的结果谱图