唾液淀粉酶最适pH值测定.doc

唾液淀粉酶最适pH值测定

广西医科大学2012级8班3组 崖晓怡 (201250424)
路海燕 (201250426)

实验原理：淀粉经唾液中淀粉酶的水解，生成糊精和麦芽糖。在底物过量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物唾液淀粉酶最适pH为6.8，但在磷酸缓冲溶液中，其最适pH为6.4—6.6，而在乙酸缓冲溶液中则为5.6。
在底物过量的条件下，相同时间内，在温度、酶浓度相同的条件下，接近最适 pH 的反应体系中消耗淀粉的量最大，剩余淀粉与过量碘液生成的颜色越浅，吸光度越小，利用分光光度计测出各管的吸光度后， 取处于升高与降低趋势之间的较小吸光度范围对应的 pH 值即为唾液淀粉酶的最适 pH。
一、 材料与方法 仪器：吸量管（5mL，1mL） ，试管，试管架，小烧杯， 722 型分光光度计，恒温箱，吸耳球 试剂：0.01mol/L 碘液，0.2mol/L 磷酸氢二钠，0.2mol/L 磷酸二氢钠，淀粉溶液，唾 液，蒸馏水
二、 方法：相同时间内，在温度、酶浓度相同、pH 不同的条件下，酶的活度不同，水解的淀粉量不同，剩余的淀粉与过量碘液生成的颜色不同，通过在660nm测量吸光度，得出酶的最适 pH 范围。
操作步骤：
1、 唾液的获取：蒸馏水漱口后在口中含蒸馏水，适宜时间后将蒸馏水连同唾液一同放置于事先准备好的容器中即可，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生应将此液体置于冰水中冷却。
2、 不同pH缓冲液配制：根据下表配置各个pH值的缓冲溶液各10ml
单位：ml
试管
1
2
3
4
5
6
PH
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
0.2mol/L

0.925
1.325
1.875
2.450
3.050
3.600
0.2mol/L

4.075
3.675
3.125
2.550
1.950
1.400

3、淀粉用量的确定：
单位:ml

1
2
3
4
PH7.0缓冲液
0.9
0.9
0.9
0.9
2.5g/L淀粉
0.1
0.2
0.3
-
释10倍酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
37℃水浴7.5min
碘液
2滴
为了更好观察颜色变化，可以加入适量蒸馏水使总体积相同。混匀，观察现象，并选择颜色变化适中一支，记录其用量。

4、 酶液稀释倍数确定：
单位:ml
试管号
1
2
3
4
5
稀释倍数
10
50
100
200
300
某浓度酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
PH7.0缓冲液

0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
2.5g/L淀粉
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
37℃水浴7.5min
碘液
2滴
为了更好观察颜色变化，可以加入适量蒸馏水使总体积相同，混匀，观察现象，并选择适中一支，记录其稀释倍数。

5、 最适pH确定：
单位：ml
试剂
PH值

6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
pH缓冲液

0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
2.5g/L淀粉

0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
酶液

0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
37℃水浴7.5min
碘液

2滴
加入5ml蒸馏水
吸光度A660nm

0.688
0.624
0.525
0.357
0.543
0.458
蒸馏水调零，测定660nm处吸光度A，最后以A为纵坐标，pH为横坐标作图，取曲线最低点对应的pH值，即为唾液淀粉酶的最适pH值，

实验结果
由图表可知，6.8为曲线最低点对应的pH值，即为唾液淀粉酶的最适pH值，

讨论

１.为什么测定唾液淀粉酶的最适pH值画出的坐标图为波浪状而不是标准Ｕ形图？
答：实验中可能操作不规范，试剂添加不准确以及保存时间不符合等，从而导致曲线不标准。
２.最适ＰＨ是酶的特征性常数吗？
答：最适ＰＨ不是酶的特征性常数。最适ＰＨ受底物浓度、缓冲液种类与浓度以及酶纯度等因素的影响。