结核分枝杆菌抗原HBHA在耻垢分枝杆菌中的重组表达和鉴定.pdf

第 4 4卷第 4期第 4 0 6页 2 0 1 5 年8月 华 中科技大学学报(医学版)Ac t a M e d U n i v Sc i Te c h n o l H u a z h o n g V0 I 4 4 No 4 P 4 06 Aug 2 01 5 结核分枝杆菌抗原 HB HA在耻垢分枝杆菌 中的 重组表达和鉴定*余 菲，寻 阳 ，田茂鹏，李华秀，朱可橙，袁 野，滕新栋，范雄林 华中科技大学同济医学院附属协和医院，第一 临床学院，武汉4 3 0 0 2 2 。华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系，武汉4 3 0 0 3 0 摘要：目的构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合 血凝素(HB HA)的重组 耻垢 分枝杆菌。方法 针 对结核分 枝 杆菌 H3 7 Rv 株 HB HA 的编码基 因 R v 0 4 7 5设计特异 引物，利用 P C R技术 从细 菌基 因组 中获 取 目的基 因，并克 隆人 p E T 一 3 0 b(+)载体构建重组原核表达质粒 p E THB HA，经 I P T G诱导 p E THB HA 转化 的重 组 E c o l i B L 2 1(D E 3)细 菌，N i 柱纯化携带 C 一 端 Hi s 标签的 HB HA蛋 白，并制备 鼠源多 克隆抗体。P C R扩 增含 自身启 动子 和调节序 列 的 R v 0 4 7 5 基 因并克隆人大肠埃希菌一 分枝杆菌穿梭载体 p MV2 6 1，构建重组分枝杆菌表达质粒 p MVHB HA，并经酶切鉴定证实后，电转化人耻垢 分枝杆菌，涂布含卡那霉素 的 7 Hl l平板，挑选抗性 克隆并扩 大培养，1 5 S DS P A GE和 We s t e r n b l o t 鉴定 重组耻垢 分枝杆菌的表达。结 果 分别 成功 构建重 组原核 表达 质粒 p E THB HA 和重组 分枝 杆菌 表达 质粒 p MVHB HA；重组蛋 白 HB HA在大肠埃希菌 中成功表达并纯化后，B C A蛋 白浓度测 定试剂 盒测定浓 度为 1 9 1 2 5 b t g g L，用其 制备 鼠源多抗；证实 HB HA利用其 自身 的启动子和调节序列在重组耻垢分枝杆菌 中表达。结论成 功构 建过表达 HB HA的重组耻垢分枝杆菌，为研究该蛋 白参 与结 核病 的致 病机 制和研发新 型疫苗 和诊 断试剂奠定 了基础。关键词：肝素结合血凝素(HB HA)；耻垢分枝杆菌；结核病；表达 中 图 分 类 号：R3 7 8 9 1 DOI：1 0 3 8 7 0 j i s s n 1 6 7 2 0 7 4 1 2 0 1 5 0 4 0 0 7 Re c o m b i na nt Ex p r e s s i o n a n d I d e nt i f i c a t i o n o f An t i g e n He p a r i n b i n d i n g He ma g g l u t i ni n (HBHA)o f M y c o b a c t e r i u m T u b e r c u l o s i s i n M y c o b a c t e r i u m S me g ma t i s Yu Fe i Xu n Ya ng Ti a n M a o p e ng e t al 1 U n i o n Ho s p i t a l，To n g j i Me d i c a l C o l l e g e，Hu a z h o n g U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y，Wu h a n 4 3 0 0 2 2，C h i n a De p a r t me n t o f P a t h o g e n y Mi c r o b i o l o g y，T o n g j i Me d i c a l C o l l e g e，Hu a z h o n g U n i v e r s i t y o f Sc i e nc e an d Te c hn o l o gy，43 00 30，Chi n a Ab s t r a c t Ob j e c t i v e To e s t a b l i s h r e c o mb i n a n t M y c o b a c t e r i u m s me g ma t i s(M s me g rna t i s)s t r a i n h i g h l y e x p r e s s i n g a n t i g e n h e p a r i m b i n d i n g h e ma g g l u t i n i n(HBHA)o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s(M t u b e r c u l o s i s)Me t h o d s Th e g e n e Rv 0 4 7 5，e n c o d i n g H B H A o f t u b e r c u l o s i s H3 7 Rv s t r a i n wa s o b t a i n e d b v P CR a n d c l o n e d i n t o t h e v e c t o r p ET一 3 0 b(+)，t o c o n s t r u c t t h e r e c o m b i n a n t p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d p E THBHA Re c o mb i n a n t p r o t e i n HBHA wa s p r e p a r e d a s C t e r mi n a l H i s t a g g e d f u s i o n pr o t e i n f r o m pETHBHA t r a ns f o r me d E c o l BL2 1(DE3)s t r a i n a f t e r i n du c t i on wi t h I PTG a nd wa s us e d t o pr e pa r e mo us e o r i g i na l po l y c l on a l an t i b o di e s Rv 0 47 5 c o nt a i n i n g i t s pr o mot e r a n d r e g ul a t o r y s e qu e nc e wa s a m p l i f i e d by PCR a n d c l o ne d i nt o E c o l i Iy c o b a c t e r i u m s h u t t l e v e c t o r p M V2 6 1 n a me l y p MVHBHA p MVHBHA wa s t r a n s f o r me d i n t o s me grna t i s a f t e r i-de n t i f i c a t i on by r e s t r i c t i o n e n z y me a na l ys i s a n d r e c o mb i n an t M s me gmat i s s t r a i n wa s c ul t i v a t e d on 7 H 1 1 p l a t e The k a na my c i n r e s i s t a n t c l o ne s we r e i de n t i f i e d wi t h 1 5 S DS-PAGE a nd W e s t e r n bl ot t i ng Re s u l t s Re c omb i n a nt pr o ka r y o t i c e xpr e s s i o n p l a s mi d pETH BH A an d r e c omb i n a nt my c o ba c t e r i a e xp r e s s i on pl a s mi d pM VHBH A we r e c o ns t r uc t e d s u c c e s s f ul l y The r e c omb i n a nt p r o t e i n HBHA wa s s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d a n d p u r i f i e d i n r e c o mb i n a n t E c o l i s t r a i n Th e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n wa s 1 9 1 2 5 g “L de t e r mi ne d by a me t ho d c a l l e d BCA Pr o t e i n As s a y Ki t，a n d t he pr ot e i n wa s us e d t o pr e pa r e mou s e o r i gi na l p o l y c l o na l a nt i bo di e s Re c o mbi na nt p r o t e i n HBHA wa s e xp r e s s e d i n r e c ombi n a nt M s rne gma t i s u s i ng i t s own pr o mot e r a nd r e g ul a t or y s e q u e n c e s Co n c l u s i o n Re c o mb i n a n t M s r n e g ma t i s s t r a i n e x p r e s s i n g HBHA wa s e s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y，wh i c h p r o v i d e s f o u n d a t i o n t o s t u d y p a t h o g e n e s i s o f t u b e r c u l o s i s a n d d e v e l o p me n t o f n e w v a c c i n e s a n d d i a g n o s t i c r e a g e n t s f o r TB Ke y wo r d s he pa r i n b i ndi ng he ma g gl ut i n i n；M yc o b ac t e r i urn s me gmat i s；t ube r c u l o s i s；e xpr e s s i o n 结 核 病(t u b e r c u l o s i s，T B)是 由结 核 分 枝 杆 菌 华 中科技大 学 大学 生创 新 创业 计划 项 目(No 教 育 部高 教 司 函 2 0 1 4 3 2 4号)共同第一作者：余菲，女，1 9 9 3年生，本科 生，E-ma i l：y u foi 6 2 3 f o x ma i l c o rn 寻阳，男，1 9 9 3年生，本科生，E-ma i l：8 7 6 4 4 2 3 6 9 q q c o m 通讯 作 者，C o r r e s p o n d i n g a u t h o r，滕 新 栋 E-ma i l：5 4 3 6 2 3 7 7 0 q q c o m；范雄林 E ma i l：x l f a n h u s t e d u c n (My c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s，M t b)感 染所 引起 的、严 重危 害人类 健康 的传染 病之 一。卡介 苗(M b o r i s B C G)是 预 防 TB的 唯一疫 苗，但 对成 人 结 核缺 乏 预 防能力。肝素结合血凝素(HB HA)是 M t b的重要 毒力 因子口 ，其 甲基化 部分具 有 重要 的免疫 学特 性，而 大肠埃 希菌 表达 的 HB HA 缺 少 甲基化 修 饰。耻 余菲等 结核分枝杆菌抗原 HBHA在耻垢分枝杆菌中的重组表达和鉴定 4 07 垢分 枝 杆 菌(M s me g ma t i s)无 致 病 性、生 长 快 并 且 可以表达甲基化修饰的 HB HA。鉴于 HB HA的 重要性，本文采用耻垢分支杆菌 的基 因工程体系表 达 HB HA，以便于对 HB HA 进行 深入 研究。1材料 与方 法 1 1买验 材 料 M t b H3 7 R v，M s me g m a t i s，大肠埃希 菌(E c o l i)DH5。c 和 B L 2 1(DE 3)菌株，大肠埃希菌一 分枝杆菌穿 梭 表 达 载 体 p MV2 6 1，大 肠 埃 希 菌 表 达 载 体 p E T 一 3 0 b(+)，由同济 医学院病原生物学 系保存。M t b H3 7 Rv HBHA 的 编 码 基 因 R v 0 4 7 5的 特 异 引 物 P1：5 一 TTCCATATGGCTGA AA ACTCGAACA T TGA TGAC AT C AA一 3 (含 N P工酶 切 位 点)，P 2：5 一 CCCAAGCTTCTTCTGGGTGACCTTCTTG GC C G C 一 3 (含Hi n d H I 酶 切 位 点)，P 3：5 L CCCAAGCTTCCGTTGGCCGGCTGTTTTG(、-3 (含 Hi n d 酶 切 位 点)，P 4：5，_ GG AATTC C C AA C AC G TC GAC TC C G AG一 3 (含 E c o R工切 位 点)，均 由上海 英骏 生 物技 术 有 限公 司合 成。Ni S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w(F F)Hi s Ta g柱购 自美 国 GE公 司。Ta q DNA 多 聚 酶，T 4 DNA l i g a s e购 自 F e r me n t a s e 公 司。限制 性 内切 酶 购 自 I n v i t r o g e n公 司。D NA Ma r k e r、蛋白质 Ma r k e r 购 自华美公司。DN A胶 回 收试剂盒、质粒小量制备试剂盒和细菌基因组 DNA 提 取试剂 盒 购 自 Ax y g e n公 司。Mi d d l e b r o o k 7 H9、7 H1 1和 ADC 增 菌 培 养 液 购 自 D i f c o 公 司。C 5 7 B L 6小 鼠购 自武汉 大 学 动 物 实 验 中 心。弗 氏 不完 全佐 剂 购 自 S i g ma 公 司。HR P标 记 的羊 抗 鼠 I g G 为二 抗 购 自 P r o t e i n t e c h公 司。E C L化 学 发 光 试剂 盒购 自碧 云 天公 司。1 2 HB HA在重组 E c o l i 中的表达 和纯化 1 2 1 P C R 扩 增 Rv 0 4 7 5基 因 利 用 细菌 基 因组 DNA 提取 试剂 盒，提取 M t b H3 7 R v基 因组 D NA，作为 P C R反应 的模板。P C R反应体系包括：1 0 P C R缓冲液 5 L，Mg C 1 2 2 L，4 Xd NT P s 2 L，弓 l 物 P 1和 P 2各 2 L，基 因组 D NA 5 L，T a q DNA 多聚酶 2 L，加无 菌 去 离子 水 至终 体积 5 0 L。P C R扩 增 条 件 为：9 4 预 变 性 5 mi n；9 4 变 性 5 O s，6 O 退 火 4 0 s，7 2 延伸 5 O s，共 3 0个 循环；最 后 7 2 延伸 1 0 mi n。1 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 P C R 扩 增 产物，并用 胶 回收试 剂盒 回收和纯 化。1 2 2 重组表 达质 粒 p ETHBHA 的构建 和鉴 定 分别 将 回收 的 P C R产 物和 质粒 p E T 一 3 0 b(+)用 Nd e 工 Hi n d 双 酶 切，酶 切 产 物 经 凝 胶 回收 试 剂 盒 回收后，利 用 T DNA l i g a s e 连接 酶切 产物。将 连 接产物用热休克法转 化人 E c o l i DH5 a感受 态细 菌，转化 产 物 涂 布 L B 固体 培 养 基(含 卡 那 霉 素 5 O#g mL)。3 7 C培养 过 夜，挑 取 5个单 克 隆菌 落，分 别接种 L B培养液(含卡那霉素 5 0 g mL)，3 7 振 荡培养 1 2 1 6 h。保存菌种后，质粒小量制备试剂 盒提取质粒并酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒 进一步送上海英骏 生物技术有限公 司基 因测序证 实，并 命 名为 p E THB HA。1 2 3 重组 HB HA 蛋 白的原核表 达及 纯化 将 重 组 质粒 p E T HB HA转 化人 E c o l i B L 2 1(D E 3)感 受态细菌。挑取单个菌落，接种于 L B培养液 中(含 卡那霉素 5 0 x g mL)，3 7 培养 1 6 h。按 照 1：2 O 的比例放 大培养，3 7 培养 2 h(振 荡速度 2 0 0 r mi n)后，加入 I P T G 至 终 浓 度 为 1 mmo l L，3 7 继 续振荡培养 4 h，以诱导 目的蛋 白表达。分别将 诱 导前、诱导后、诱导菌超声裂解，获取 菌体上清和沉 淀 进行 S D S-P AGE电泳 分析，证实 表达 目的蛋 白及 其 可 溶 性。采 用 Ni S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w(F F)Hi s Ta g柱 纯 化 目的 蛋 白。产 品 的 最 终 浓 度 采 用 B C A 蛋 白浓 度测 定试 剂盒 测定。1 3制备小鼠抗 H B H A的多克隆抗体 将 纯化 的 HB HA 重 组蛋 白 1 0 0 g 1 0 0“L，与 等体积的弗氏不完全佐剂混匀、乳化，背部皮下多点 注 射免疫 C 5 7 B L 6小 鼠。首 次免 疫剂 量 为 2 0 0#g 只，间隔 2周，加强免疫 2次，免疫剂量为 1 0 0 g 只，末 次免 疫后 2周，处 死小 鼠，收集血 清，分装，一2 o 保存待用，并用 E L I S A法测定血清 中抗体滴 度。1 4 HB HA在重组耻垢分枝杆菌 中的表达和鉴 定 1 4 1 重组分枝杆 菌表达质粒 p MVHB HA 的构 建 和鉴 定 利 用 引物 P 3和 P 4，参 照 1 2 1的方 法 和条件进行 P C R扩增含 自身启动子和调节序列 的 Rv 0 4 7 5。将 回收纯 化 的 P C R产 物 和 p MV2 6 1 分 别 用 Hi n d 和 Ec o R I酶 切、回 收 后，利 用 T D NA l i g a s e连接 酶 切 产 物，并 将 连接 产 物 转 化 入 E c o l i DH5 a。涂布 于 含 卡 那 霉 素(终 浓 度 2 5 g mL)的 L B琼 脂平 板。3 7 培 养 过夜。挑 取 卡那 霉 素 抗 性 菌落，分离纯化后进一 步扩大培养，提取重组质粒。用 Hi n d B I 和 Ec o R工酶切 鉴定 证 实。阳性重 组质 粒 命 名 为 p MVHB HA。1 4 2制 备 M s me g ma t i s的感 受 态和 电转化参 考课题组发表的文献 3 ，制备 M s me g ma t i s 感 受 态，即：将 M s me g ma t i s接 种 于 1 0 mL 7 H9培 养 液，添加 1 O 的 ADC，3 7 培养 3 d，5 0 0 0 r mi n离 41 0 华 中科技大学学报(医学版)2 0 1 5 年 8月第 4 4卷第 4 期 化 效 率 高 的 非 致 病 菌，并 且 转 录、翻 译 过 程 也 与 M t b十分 类似。研究 显示，耻垢 分枝 杆菌 和结 核 分 枝杆菌的细胞裂解液均能使大肠埃希菌表达的无 甲 基 化 的 HB HA 实 现 甲基 化，由此 可 见 耻 垢 分 枝 杆 菌 含有 能使 HB HA 甲基 化 的 氨基 转 移 酶，其 表 达 的 HB HA 同 样 可 以 形 成 甲 基 化 结 构 。此 外，M s me g ma t i s 还是 比较 强 的 细胞 免 疫佐 剂，可 代替 B C G 作为 疫苗 载体L 1。因此，通 过 耻垢 分 枝 杆 菌 体系的基因工程技术 获得 的大量具有天然结构 的 HB HA，具有 重要 的应用 价值。本研究显示，我们从 结核分枝杆 菌 H3 7 R v基 因组 中获 得 的特 异 的 HB HA D NA 片 段 的 大 小 与 文献E 1 9 一 z o 报道相符；得到 的含 p MVHB HA 的重 组 M s me g ma t i s 菌株 表 达 出 的条 带 的大 小 与 文 献 2 报 道 相 符。同时 本 研 究 中 的 S DS P A GE 和 We s t e r n b l o t 检测结 果，也 证 实 了 M s me g ma t i s自 身表达 的 与 HB HA 的氨基 酸水 平 同源 性达 6 8 的 类 似物 也在 重组 M s r n e g r n a t i s中低水 平表 达，但 该 类似物不具有 HB HA可 粘附到上皮细胞 的能力，且和 HB HA对肝 素 的亲 和 吸 附能 力 也 不 同，因此，不 会 影 响 HB HA 的 纯 化 l_ 2。此 外，M s me g ma t i s 还 表达 了 一 种 可识 别 HB HA 抗 血 清 的 粘 附素，即 层 粘连 蛋 白(L B P)，其大 小 约为 3 1 k D，有 与 HB HA 相似的甲基化 修饰_ 2 ，但 该蛋 白对 肝素无 吸 附能 力。由此，本 研 究 建 立 的重 组 M s me g ma t i s，成 功 为 天然 HB HA 的 大 量 纯 化 和 制 备 提 供 了 条 件，这 将 为深入 研 究 HB HA 的 致 病 机 制、发 展 高 效 准 确 诊 断方法 和研 制新 型抗 TB疫 苗 和药 物 等奠 定 良好 基础。1 2 3 3 4 E s 参考 文 献 Gu e r r e r o G G，De b r i e A S，Lo c ht CB o o s t i n g wi t h m y c o b a c t e r i a l he p a r i n b i n d i n g h a e ma g g l u t i n i n e nh a n c e s pr o t e c t i o n o f M yc o b a c t e r i u m b o vis BCG v a c c i n a t e d ne wb o r n mi c e a g a i n s t M t u b e r c u l o s i s I J 1 Va c c i n e，2 0 1 0，2 8(2 7)：4 3 4 0 4 3 4 7 De l o g u G，Bu a A，P us c e d d u C，e t a 1 Ex p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f r e c o mb i na n t me t hy l a t e d HBH A i n M y c o b ac t e r i u m s me g ma t i s 刀 F E MS Mi c r o b i o l L e t t，2 0 0 4，2 3 9(1)：3 3 3 9 袁茵，汤荟，王若，等 表达绿色荧光蛋 白的重组耻垢分枝杆菌 的构建 J 医学分子生物学杂志，2 0 1 1，8(1)：6 1-6 4 Bi k e t o v S，P o t a p o v V，Ga n i n a E，e t a 1 Th e r o l e o f r e s us c i t a t i o n p r o m o t i n g f a c t o r s i n p a t h o ge n e s i s a n d r e a c t i v a t i o n o f M y c o b ac t e r i u m t u b e r c u l o s i s d u r i n g i n t r a pe r i t o n e a l i n f e c t i o n i n mi c e l J 1 B MC I n f e c t Di s，2 0 0 7，7(1)：1 4 6 1 4 9 江鹰，赵善 民，师长宏 HB HA在结核病研究 中的应 用 J 现 代生物医学进展，2 0 1 2，1 2(1 7)：3 3 4 7 3 3 4 9 6 3 7 8 3 9 1 O 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 O 2 1 2 2 M u e l l e r Or t i z S L，Wa n g e r A R，No r r i s S J My c o b a c t e r i a l p r o t e i n HBHA b i n d s h u ma n c o mp l e me n t c o mp o n e n t C 3 J I nf e c t I mm u n，2 0 0 1，6 9(1 2)：7 5 0 1 7 5 1 1 Kr i s h n a n N，Ro be r t s o n B D，Th wa i t e s G Th e m e c h a n i s m s a n d c o n s e q ue n c e s o f t h e e x t r a p ul mo n a r y d i s s e mi na t i o n o f My c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s J Tu b e r c u l o s i s，2 0 1 0，9 0(6)：3 6 1 3 6 6 Le b r u n P，Ra z e D，Fr i t z i n g e r B，e t a 1 Di f f e r e n t i a l c o n t r i b u t i o n o f t h e r e p e a t s t o h e p a r i n b i n d i n g o f HB HA a ma j o r a d h e s i n o f My c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s 1 3 P L o S O n e，2 0 1 2，7(3)：e 3 2 4 2 1 Me n o z z i F D，Ro u s e J H，Al a y i M，e t a 1 I d e n t I f i c a t i 0 n o f a h e p a r i n-b i n d i n g h e ma g g l u t i n i n p r e s e n t i n my c o b a c t e r i a J J Ex p M e d，1 9 9 6，1 8 4(3)：9 93 1 O 0 1 Es p o s i t o C，M a r a s c o D，De l o g u G，e t a 1 He p a r i n-b i nd i n g h e ma g g l u t i n i n H BHA f r o m M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a f f e c t s a e t i n p o l y me r i s a t i o n J B i o c h e m B i o p h y s Re s C o mmu n，2 Ol 1，4 1 0(2)：3 3 9-3 4 4 M e n o z z i F D B i s c h o f f R，Fo r t E，e t a 1 M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e my c o b a c t e r i a l h e p a r i n-b i n d i n g h e ma g g l ut i n i n，a my c o b a c t e r i a l a d h e s i n J P NAS，1 9 9 8。9 5(2 1)：1 2 6 2 5 1 2630 Gl o b a l t u be r c u l o s i s c o n t r o l：s u r v e i l l a nc e，p l a n ni n g，f i n a n c i n g：W HO r e p o r t 2 0 0 3 r R Co mmu n i c a b l e Di s e a s e s，W o r l d He a l t h Or g a n i z a t i o n，2 0 0 3 P e t h e K，B i f a n i P，Dr o b e c q H，e t a 1 M y c o ba c t e r i a l h e p a r i n b i n d i n g he ma gg l u t i n i n a n d l a mi n i n 。b i nd i n g p r o t e i n s h a r e a n t i。g e n i c me t h y l l y s i n e s t h a t c o n f e r r e s i s t a n c e t o p r o t e o l y s i s J PNAS，2 0 02，9 9(1 6)：1 0 7 5 9-1 07 6 4 Te mme r ma n S，Pe t h e K，P a r r a M，e t a 1 M e t h y l a t i o n d e p e n d e n t T c e l l im mu n i t y t o M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s h e p a r i n b i n d i n g h e ma g g l u t i n in J Na t Me d，2 0 0 4。1 0(9)：9 3 5 9 4 1 Lo c h t C，Ho u g a r d y J M，Ro u a n e t C，e t a 1 He p a r i n b i n d i n g h e m a g g l u t i n i n，f r o m a n e x t r a p u l mo n a r y d i s s e m i n a t i o n f a c t o r t o a p o we r f u 1 d i a gn o s t i c a n d p r o t e c t i v e a nt i g e n a g a ins t t u b e r c u l o s i s J T u b e r c u l o s i s，2 0 0 6，8 6(3)：3 0 3 3 0 9 De l o g u G，Ch i a c c h i o T，Va n i n i V，e t a 1 M e t h y l a t e d HBHA p r o d uc e d i n M s me gma t i s di s c r i mi n a t e s be t we e n a c t i v e a n d n o n a c t i v e t u b e r c u l o s i s d i s e a s e a mo n g RD 1 一 r e s p o n d e r s J PLo S On e，2 O 11，6(3)：2 1 8 3 1 5 Pi e r r e Au d i g i e r C，J o u a n g u y E，La mh a me d i S，e t a 1 Fa t a l d i s s e mi n a t e d M y c o b a c t e r i u m s me gmat i s i n f e c t i o n i n a c h i l d wi t h i n h e r i t e d i n t e r f e r o n r e e e p t o r d e f i c i e n c y J C l i n I n f e c t D i s，1 9 9 7，2 4(5)：9 8 2 9 8 4 Ha r a r i A，R o z o t V，E n d e r s F B，e t a 1 Do mi n a n t TNF-a l p h a +M y c o b a c t e r i u m t u b e r c ul o s i s s p e c i f i c CD4 T e e l l r e s p o n s e s d i s c r i mi n a t e b e t we e n 1 a t e n t i n f e c t i o n a n d a c t iv e d i s e a s e J 1 Na t M e d，2 0 1 1，1 7(3)：3 7 2 3 7 6 De l o g u G，S a n g u i ne t t i M，Po s t e r a r o B，e t a 1 Th e H BHA g e n e o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i s s p e c i f i c a l l y u pr e g u l a t e d i n t h e 1 un gs bu t n o t i n t h e s p l e e n s o f a e r o g e n i c a l l y i n f e c t e d mi c e l J I n f e c t I mmu n，2 0 0 6，7 4(5)：3 0 0 6 3 0 1 1 江莉莎，邬亭亭，刘平，等 分 枝杆菌噬 菌体 L e o的生物学 和 基因组 学特征 刀 华中科 技大学学 报：医学版，2 0 1 4，4 3(5)5 0 6 5 1 1 B i e t F，d e M e l o M a r q u e s M A，Gr a y o n M，e t a 1 M y c o b a c t e r i u m s me g mat i s p r o du c e s a n HBH A h o mo l o g u e wh i c h i s n o t i n v o l v e d i n e p i t h e l i a l a d h e