发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术.pdf

第 36 卷 第 12 期2 0 0 4 年 12月 哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报JOURNAL OF HARBIN INST ITUTE OF TECHNOLOGY Vol136No112Dec.,2004 发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术李永峰,任南琪,陈 瑛,李建政,胡立杰,郑国香(哈尔滨工业大学 市政环境学院,黑龙江 哈尔滨 150090)摘 要:厌氧产氢细菌的分离纯化与培养是发酵法生物制氢技术的基础课题之一,现有厌氧细菌的分离制备技术和培养基分别存在着操作繁琐和成份复杂问题.通过厌氧培养技术比较和细菌生长试验,确定了/煮沸吹氮去氧,固液交替分离0的厌氧产氢细菌分离纯化培养程序,改进了 Hungate 技术和建立了新的宽体窄颈培养瓶平板技术.通过培养基组成成份的增减和细菌增长、种类和数量的研究确立了厌氧发酵产氢细菌的分离和富集培养基.利用这些厌氧培养技术,已成功分离培养了 550 余厌氧菌株系.关键词:生物制氢;产氢发酵细菌;分离纯化;厌氧操作;培养基中图分类号:X703文献标识码:A文章编号:0367-6234(2004)12-1589-04The experimental anaerobic operation of isolation and cultureon hydrogen-producing and fermentative bacteriaLI Yong-feng,REN Nan-qi,CHEN Ying,LI Jian-zheng,HU L-i jie,ZHENG Guo-xiang(School of Municipal and Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)Abstract:Isolation and culture of hydrogen-producing and fermentative bacteria is an important foundationon biohydrogen production process.T here are complicated operation and composition in present anaerobictechniques and culture media.Hungate technique was improved and plate of culture bottle was establishedby comparing anaerobic methods and bacterium growth.Isolation and enrichment culture media were con-firmed by the test of different composition and the species and amount of hydrogen-producing and fermenta-tive bacterium.550 bacterium strains were isolated by the anaerobic operation.Key words:biohydrogen production;hydrogen-producing and fermentative bacteria;isolation and culture;anaerobic operation;culture media收稿日期:2003-12-10.基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(50125823);国家重点基础研究发展规划资助项目(G2000026402);哈尔滨工业大学跨学科交叉性研究基金资助项目(HIT.MD2002125).作者简介:李永峰(1961-),男,博士研究生;任南琪(1959-),男,教授,博士生导师,特聘教授.利用高浓度有机废水厌氧发酵法制氢是国内外生物制氢研究领域的热点,人工分离培养高效产氢发酵细菌不但是解决生物制氢产业化的工程菌基础课题,而且也是产氢菌种遗传改良的前提条件.自从 Hungate1研究了滚管法分离培养厌氧菌技术以来,国内外学者开展了大量厌氧分离培养技术研究 2-4.但是由于缺乏惰性气体供应和所需设备过多的原因,导致了厌氧操作步骤繁琐;与此同时过去要求技术设备试剂要求高,限制了厌氧菌的研究,厌氧菌各学科的研究进展都大大落后于普通好氧菌.用厌氧分离培养技术,国内外 学者 也开 展了分 离高 效产氢 菌种 的研究 5-14,但是,大多数学者未能分离到具有高效产氢能力的细菌,即使分离到产氢菌种也仅仅局限在 2 3 个菌属6 11.为了能够获得目标细菌,一些学者配制了复杂成分的培养基,但是有些成分并不是该微生物所需,例如分离到高产氢能力菌种的 Kumar11和任南琪等5的培养基成份就十分复杂,也存在进一步简化的必要.在研究厌氧分离技术的基础上,研究出新的厌氧发酵细菌培养基对分离和富集产氢发酵细菌和工业化制氢具有十分重要的意义.1 材料和方法111 供试菌种与活性污泥供试纯菌种来自本实验室分离得到的高效产氢细菌 B495,供试污泥来自本实验室生物制氢反应器.112 细菌分离从生物制氢反应器中取 10 ml 产氢发酵活性污泥,放入事先充满氮气无氧灭菌的培养瓶中,加入10 粒玻璃珠,在振荡器中振荡 1 h 或手工摇瓶30 min,将污泥中菌胶团打碎,用脱氧无菌水或脱氧无菌生理盐水进行 10倍为基准的倍比稀释,再接种于固体培养基之中或平板培养或制成滚管培养.培养时间为 20 d,通过 MPN 法估计菌体数量15.1.3 纯化富集取 1 ml 细菌培养物(活性污泥或经过倍比稀释的活性污泥)和 9 ml 无菌无氧水或无菌无氧生理盐水混合,制成 10-1 10-25倍比稀释菌液,经过实验对比,选取 10-13 10-18接种固体培养基可以获得有单细胞菌体生长而来的菌落.用本实验室制作的弯头毛细管转移入液体培养基中,进行富集扩增.上述操作重复进行,直至固体培养基(Hungate 厌氧滚管或平面培养瓶)上的菌落和普通光学显微镜下菌体细胞形态一致为止.一般进行/固体-液体0培养基反复操作 2 5 次.1.4 氢气量和产氢能力测定产氢发酵细菌的产氢能力和产氢气量的测定方法和装置见文献 5.1.411 改良 Hungate 滚管技术1无菌水和培养基的制备及分离培养涉及菌种操作环节采用简化的 Hungate 厌氧技术.以高纯氮气吹脱厌氧管内的空气(氧气),用厌氧螺旋管装液体和固体培养基,35 e 常规培养,手工冷水中滚管.11412 平面厌氧操作技术 16 181141211 厌氧管斜面法利用厌氧螺旋管装入培养基 3 ml,将其摆成尽可能的斜面,垂直培养.1141212 平皿夹层厌氧法培养基经灭菌后无菌条件下倒入一层营养琼脂,厚度与培养皿高度相近为宜,用稀释菌液涂布冷却后的培养皿(同好氧操作).涂布后让菌液渗透5 分钟,然后揭开培养皿一边将营养琼脂再度倒入,直到营养琼脂将溢未溢/凸起0状态(这一点靠粘稠的营养琼脂表面张力),随后迅速盖上皿盖并下压,使皿内不留气泡.并用琼脂密封皿盖与皿底边缝间隙.11413 平板培养瓶厌氧技术利用宽体窄颈瓶形成培养瓶底部的平面,进行菌液涂布或滴加菌滴并轻摇涂布法,操作按氮气吹脱培养瓶内空气(氧气).配制培养基过程中,利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式,保证严格厌氧.多加琼脂012 015%,吸收多余水分.同样的操作技术,配制成液体培养基,进行菌体富集增量.全部实验操作采用吹氮气脱氧和加热驱氧.115 培养基11511 基本培养基采用林明9LM-1 培养基作为本项研究的起始培养基.11512 改进培养基HPB-1 培养基(g/l):葡萄糖,20;胰蛋白胨+蛋白胨(110+310);牛肉膏,210;酵母汁,110;NaCl,310;K2HPO4,110;MgCl2,0105;FeS-O417H2O,0105;L-半胱氨酸,015;另加 LM-19维生素液和微量元素液;刃天青(012%);110 210 ml;琼脂,2010g 或不加琼脂成液体培养基.HPB-2培养基(g/l):碳源、氮源与大量元素同LM-1 培养基 9;维生素液中只加具有还原性的抗坏血酸 01025g/l 和叶酸0101 g/l,10 ml.另加微量元素液同 LM-19.加琼脂 2010 或不加琼脂,其它同HPB-1.HPB-3 培养基(g/l):碳源、氮源与大量元素同HPB-19,维生素液同 HPB-19,微量元素液调整如下:微量元素液(NiCL216H2O,01001;CaCl2.H2O,0101,ZnCl2,0102),其他同 HPB-19.HPB-LR 培养基:根据 HPB-1、HPB-2、HPB-3 和 LM-1 四种培养基的实验结果,综合而成的培养基 HPB-LR,成份如下(g/l):葡萄糖,2010;胰蛋白胨,110;蛋白胨,310;牛肉膏,210;酵母汁,110;NaCl2,310;K2HPO4,110;L-半胱氨酸,015;维生素液与微量元素(抗坏血酸,01025;叶 酸0101,NICl216H2O,01001;Ca-Cl212H2O,0101,ZnCl2,0102)10 ml;刃 天 青(012%)1 ml;琼脂 20 2510 g 或不加琼脂或液体培养基;pH 调整为 410 415.116 培养条件高压灭菌 115 e 30 min,恒温培养或震荡培养,转速 120 r/min.#1590#哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第 36卷 2 结果与讨论211 Hungate滚管技术的改良与应用21111 培养基的配制操作将配制好的培养基倒入一平底三角烧瓶中,放在电热炉上加热.加热之前通入高纯氮气(99,99%)驱除三角瓶内气相空气.当气体通过煮沸的培养基表面时,培养基轻轻煮沸.当培养基完全无氧时(通过刃天青指示剂的颜色变化来指示,无氧时刃天青无色),既可移入厌氧螺旋管.移入培养基用 10 ml 注射器,并采用平头兽用针头(长约 10 15 cm),将注射器和针头放入煮沸培养基内部时同时进行氮气吹培养基容器和瓶.21112 滚管技术固体培养基的滚管技术是指将装有热熔的厌氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制成.当琼脂围绕管壁完全凝固后,琼脂滚管即可垂直放置贮存,并可使少量未凝结的水分集中在底部.当管内培养基在 45 e 左右未凝结时,用注射器将稀释比配为 10-10 10-15菌液注射入培养管中,然后滚管.灭菌管接种时,橡皮塞在火焰上灼烧,稍冷后通过橡皮塞注入菌液.21113 厌氧细菌分离打开内部生长良好(菌落明显,相互分开)的试管,开口对着酒精灯火焰以避免空气进入和杂菌污染,用自制玻璃细管接种针挑去生长状态良好的目标菌落,快速打开液相厌氧管接种于液体培养基增量富集.也可以采用连着氮气的长针头进行挑取和接种液体培养基的方法达到避氧的目的.进行/固体滚管培养单一菌落)液体富集培养增值细菌0的重复操作,直到细菌被纯化为止,一般进行 2 5 次重复即可.观察厌氧状态以忍天青的颜色变化为准.建议采用 SIGMA 公司生产的忍天青,对氧化还原电位的变化敏感.用此法分离细菌菌株 400余株.212 平面厌氧操作技术21211 厌氧管斜面法 20将培养基中的琼脂固定化剂加量 5 g/l,即琼脂 25 g/l,以减少水的析出;每个厌氧管加 3 ml培养基并摆成尽可能的长斜面,使斜面顶端距试管的上端尚留有 2 cm 为宜;用注射器汲取欲分离、纯化并事先适当稀释的细菌悬浮液,并向斜面上端注入 013 015 ml 菌液,小心地使菌液在斜面表面上自上向下流并轻轻摇动菌液;将厌氧接种物水平放入恒温箱中 35 e 培养,长出菌落后用自制接种针挑取菌落并接种于新鲜液体培养基中,重复数次并检查培养物的纯度.其缺点是每一厌氧管的斜面面积有限,优点是菌落生长和观察角度比Hungatl 技术要好.目前用此法已分离到菌株 20 株.212.2 平面夹层平板法7的应用将培养基按 11512 操作配制,挑取合适的稀释度的培养皿(菌落的生长数为 1 20 个为宜),在酒精灯上将边缘融化,揭开上盖,由于琼脂两层凝固的方向不同,而用镊子很容易将上层琼脂分成2 3 块,露出下层琼脂的菌落并挑取之,接种于液体培养基.已分离到菌株 10 余株.由于其操作过程亦暴露空气中,所以对严格厌氧菌而言,这并不是一种很好的方法.仅对兼性厌氧菌而言,如硫酸盐还原菌和脱氮硫杆菌则容易获得纯种,已经作了这样的试验.将另行文报道.213 平板培养瓶厌氧技术用厌氧操作技术已分离到菌株 120 余株.宽体窄颈培养瓶培养基配制程序如图 1.图 1 培养瓶平板厌氧技术与培养瓶 注入培养基使之形成 1 3 cm 厚的培养基.冷却时放平使培养基形成平板.将制成的培养瓶平板滴入已经稀释好的菌液 013 015 ml,轻轻摇动,自然涂布.待菌落长出并取分散平板(115 个菌落)挑取并在超净工作台中酒精灯下接种于液体培养基,已分离到菌株 120 株.其中已测到 12 株产生氢气.表 1 是四种方法和产氢菌株,有关这些菌株正在进一步形态学和生理生化特性鉴定.214 培养基成分LM-1 培养基是根据发酵产氢细菌的生长特性而设计的 9.为了能够使各种类型的细菌生长分离培养出来,配置了繁多的营养元素,维生素和丰富的 C、N 源营养物质.为了简化培养基和获得较好的培养效果我们做了改进试验.碳源:以葡萄糖为碳源,葡萄糖对发酵产氢细菌的菌体的自身生长和产氢能力而言都是适宜的底物 21.氮源:厌氧发酵细菌不能利用无机氮源或者利用效果不好21,因此采用胰蛋白胨、牛肉膏、酵母汁,改胰蛋白胨 1g/l 和蛋白胨 3g/l 或蛋#1591#第 12 期李永峰,等:发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术白胨 4g/l.表 1 不同厌氧操作技术形式厌氧技术分离菌株产氢菌株培养管改良 Hungate 技术40043培养管斜面法2010培养皿平板夹层法10培养瓶平板培养瓶法12012 在无机大量元素中,NaCl 与维持细胞内外渗透压平衡,K2HPO4在培养基中起缓冲剂调节 PH值的作用 9,近年的试验表明低 PH 值(PH 值在410 415 之间)有利于产氢细菌的生长和产氢代谢21.Mg2+参与多酶体系,是能量代谢(ATP+NADP)和糖代谢中必不可少的.金属镍离子是构成氢化酶的活性组成元素,对产氢细菌的生长和产氢都有十分的重要性,但是其含量较低,一般用MgCl2取代 MgSO4#7H2O,以避免 SO42-离子激活硫酸盐还原菌消耗氢的作用.Fe2+离子不但参与氢化酶的活性组成,而且参与铁氧还原蛋白的组成.L-半光胺酸作为还原剂用于消耗培养基中的溶解氧,降低溶解氧化还原电位,刃天青作为氧化还原电位的指示剂,具有灵敏的指示作用 5.215 培养基的筛选从表 2 可以看出培养基培养细菌的结果和生长状态.可以发现,菌落生长状况良好,培养基的细菌生长状况和菌落形态丰富度都有一定差别.把HPB-LR 培养基作菌种繁殖和富集的培养基.在第一次分离诱导自然培养物(活性污泥)时,为尽可能多的诱导不同细菌,采用 LM-1 为诱导培养基,但一般用蛋白胨 4g/l 或者胰蛋白胨1g/l 和蛋白胨 3g/l 的改胰蛋白胨,不加发酵液.PH 值调整为 PH415.表 2 培养基培养细菌的结果培养基菌落生长菌数(个#ml-1)菌浊(A600 nm)评价LM-1优115 10122180成份复杂HPB-1优111 10113145HPB-2优110 10132110HPB-3良210 10114120HPB-LR优116 10114120成份简化3 结 论1)在不同厌氧分离产氢发酵细菌技术中,一般采用改良Hungate 技术和平板培养瓶技术.平板培养瓶技术结合了 Hungate 滚管技术和好氧平板技术的优点,是厌氧细菌培养技术的改进,另行文报道.2)分离纯化发酵产氢细菌的具体步骤为/固相-液相-固相0培养基的循环培养,一般进行 2 5 次重复即可获得纯菌菌落,作进一步的形态特征、生理生化鉴定之用.3)LM-1 培养基成分过于复杂,作为发酵产氢细菌从起始培养物(活性污泥)分离培养的起始培养基是适宜的,在富集增量中,采用简化了的HPB-LR 培养基为宜.4)HPB-LR 培养基可以作为发酵产氢细菌分离培养纯化的培养基.该培养基成分简化,分离细菌效果相差无几.不同菌落形态特征明显,表明具有较好的诱导培养特性.参考文献:1HUNGATE R E.Methods in microbiology M.NewYork:Academic press,1969.117-132.2 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册 M.北京:科学出版社,2001.3 王修恒,谢树华.用斜面法分离厌氧微生物J.微生物学通报,1994,21(2):119-120.4 穆 军,张肇铭.一种分离纯化厌氧细菌的新方法-平皿夹层厌氧法 J.山西大学学报(自然科学版),1998,21(4):363-367.5 任南琪,林 明,马汐萍,等.厌氧高效产氢细菌的筛选及其耐酸性研究J.太阳能学报,2003,24(1):80-84.6 林 明,任南琪 王爱杰,等.产氢发酵细菌培养基的选择和改进 J.哈尔滨工业大学学报,2003,35(4):398-402.7 TANISHO S,SHIATA L Y.Continuous hydrogen pro-duction from molasses by the bacterium EnterobacteraerogenesJ.Int J Hydrogen Energy,1994,19(10):807-812.8 TAGUCHI F,M IZUKAMI N,HASEGAWA K.Micro-bial conversion of arabinos and xylose to hydrogen by anewly isolated Clostridium sp J.Can J Microbiol,1994,40:228-233.9 TAGUCHI F,CHANG J D,MIZUKAM I N,et al.Iso-lation of a hydrogen-producing bacterium,Clostridiumbeijerinckii strain AM21B,from termites J.Can J M-icrobiol,1993,39:726-730.10 KUMAR N,DAS D.Enhancement of hydrogen pro-duction by Enterobacter cloacae IIT-BTO8 J.ProcBiochem,2000,35:589-593.11OOSHIMA H,TAKAKUWA S,KATSUDA T,et al.Production of hydrogen by a hydrogenase-deficient mu-tant of Rhodobacter capsulatusJ.J Fermernt Bioeng,1998,85(5):470-475.(下转第 1694 页)#1592#哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第 36卷 Cu(q12)=1+K#k2(q12Ru),(均匀球形).(3)式中:k(x)=3j1(x)/x,j1(x)为一阶球贝塞尔函数,Rg,Rs和Ru分别为高斯形,球面形和均匀球形的P源空间参数.2 夸克胶子等离子体的2P干涉学检测当在超相对论重离子碰撞中生成了夸克胶子等离子体时,随着时间的增大,夸克胶子等离子体会通过表面发射强子和其它次级粒子逐渐消失.由于 P介子是从表面发射的,那么这时的关联函数就是式(2).从式(1)、(2)可以看出,式(1)不具有振荡行为,而式(2)具有振荡行为.同时还可以看出,式(2)在 q12Rs=mp(m=1,2,且为正整数)处达到最小值1,而且这些点是均匀分布的,点与点之间的间隔为$qs=P/Rs.式(3)也具有具有振荡行为,但与式(2)的振荡行为不同:它的最小值为 1,而对应这最小指点是不均匀分布的,点与点之间的间隔随着 q12的增大而减小,当 q12很大时点与点之间的间隔为$qu=P/Ru,由文献 12,Rs=3/5Ru,因而$qu=0177P/Rs,因而当 q12很大时,$qu比$qs大,它们的差为$qus=$qu-$qs=0172/Rs.由式(2),它的第一个最小值点距原点为qu1=P/Rs,而式(3)的第一个最小值点距原点为qs1=4149/Rs=3145/Ru,因而 qu1 qs1.从上面的计算和分析可知,有两种方法来区分式式(2)和式(3):1)观测当 q12很大时关联函数最小值点的间隔;2)观测关联函数的第一最小值点到原点的距离.这两种方法均可以用来探明夸克胶子等离子体的存在性,同时也是超相对论重离子碰撞中出现夸克胶子等离子体的信号.用这两种方法探明夸克胶子等离子体需要实验得到的 2P关联函数具有较小的误差.参考文献:1 SATZ H.Critical behavior in finite temperature QCDJ.Phys Rep,1982,88(5):349-364.2 BJORKEN J D.Highly relativistic 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COLLABORATION,BAMBERGER A,BANGERTD,BARTKE J,et al.Probing the space-time geometry ofultrarelativistic heavy ion collisionsJ.Phys Lett B,1988,203(3):320-326.(编辑 王小唯)(上接第 1592页)12陈晓蕾.产氢发酵细菌顶级群落研究 D.哈尔滨:哈尔滨建筑大学,1998.13YUKOI H,OHKAWARA T.Characteristics of hydro-gen production by aciduric E.aerogewes strain HO-39 J.J Ferment Bioeng,1995,80(6):571-574.14李白昆.有机废水发酵法生物制氢原理)产氢细菌产氢机理和能力 D.哈尔滨:哈尔滨建筑大学,1999.15 INGRAHAM J L,INGRAHAM C A.Introduction tomicrobiology M.s.l.:Brook/Cole Dub Co,2000.209-233.16王修垣,谢树华.有斜面法分离厌氧细菌微生物 J.微生物学通报,1994,21(2):119-120.17王相晶.发酵产氢细菌 B49 的生理特性及固定化的研究 D.哈尔滨:哈尔滨工业大学,2003.18布坎南 R E,吉本斯 N E.伯杰氏细菌鉴定手册 M.第八版.北京:科学出版社,1984.(编辑 姚向红)#1694#哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第 36卷