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第二节 RNA的生物合成
RNA的生物合成包括RNA转录（transcription）与RNA复制。除少数RNA病毒，以RNA复制的方式传递遗传信息外，大部分生物中遗传信息都是从DNA分子中以转录方式合成RNA而输出的，即以DNA为模板，以四种核糖核苷酸为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA。转录是基因表达的第一步，是遗传信息传递的重要环节。转录产物有：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA。
一、转录体系
参与RNA合成的成分有多种，包括DNA模板、四种三磷酸核糖核苷（NTP）、RNA聚合酶、某些蛋白质因子及必要的无机离子等，这些总称为转录体系。
（一）DNA模板
转录以DNA为模板，根据碱基配对原则，按照DNA模板中核苷酸的排列顺序合成互补的RNA分子。DNA分子中的A、G、C、T分别对应于合成RNA分子中的U、C、G、A。模板DNA的序列决定着转录RNA的序列，从而将DNA的遗传信息传给RNA。与DNA复制不同，转录具有不对称性。即在一个包含多个基因的双链DNA分子中（如称为A链及B链），某个基因节段只以A链为模板进行转录，B链不转录，而在另一个基因节段可由B链为模板，A链不转录。在转录中，基因的DNA双链中可以作模板的链称为模板链，不作为模板的另一条DNA链称为编码链。转录的RNA序列与DNA模板链序列是互补的，而与DNA中编码链序列基本相同（U代替了T）。
（二）底物
转录所需的底物（原料）是四种三磷酸核糖核苷（NTP），即ATP、GTP、CTP、UTP。每聚合1分子核糖核苷酸需水解掉NTP的1个磷酸键以提供所需能量。
（三）RNA聚合酶
RNA聚合酶是依赖DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。RNA聚合酶在原核生物、真核生物、病毒及噬菌体中均普遍存在。
1、原核生物RNA聚合酶
以大肠杆菌（E.coli）为例，E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000个左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。
E.coli RNA聚合酶全酶（holoenzyme）分子量460000Da，由五种、六个亚基组成，α2、β、β'、σ、ω，另有两个Zn2+。无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亚基称为起始因子。不同的细菌α、β、β'亚基分子量变化不大，但σ亚基分子量从44000Da～92000Da。σ亚基的功能能使核心酶在DNA上滑动，让核心酶与DNA启动子更容易结合，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性，但不同的σ因子能识别不同的启动子，从而表达不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约12bp。37℃时，原核RNA聚合酶的聚合速度可达50个核苷酸/秒。
表10-3 E.coli RNA聚合酶各亚基性质及功能
亚基
基因
分子量
亚基数
功能
α
rpoA
40000
2
酶的装配及结合启动子上游元件和活化因子
β
rpoB
155000
1
结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成
β'
rpoC
160000
1
与模板DNA结合
σ
rpoD
32000-92000
1
识别启动子，促进转录起始
ω
未知
9000
1
未知
2、真核生物RNA聚合酶
真核细胞中已发现三种RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶I、II、III，RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右，亚基数通常有8-14个。
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNA聚合酶II的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而RNA聚合酶I不受抑制。动物RNA聚合酶 III受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的RNA聚合酶 III不受抑制。α-鹅膏蕈碱是一种毒蕈（鬼笔鹅膏Amanita phalloides）产生的八肽化合物，对真核生物RNA聚合酶有较大毒性，但对原核生物RNA聚合酶只有微弱抑制作用。
除了细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类的RNA，类似于细菌RNA聚合酶。
3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶
仅为一条分子量11000Da的多肽链，这些聚合酶只识别噬菌体DNA的少数启动子，并无选择地与其作用，37℃时的聚合速度200碱基/秒。
二、转录过程
RNA的转录过程可分为起始、RNA链的延长及终止三个阶段，转录起始前需要相关的转录因子共同作用。
（一）原核生物基因转录的起始
首先RNA聚合酶的σ因子辨认DNA的启动子部位，并带动RNA聚合酶的全酶与启动子结合，形成复合物。RNA聚合酶可以“挤”入DNA双螺旋结构之内，起到解旋作用，并使DNA的局部结构松弛，解开约10几个碱基对长的DNA双链形成转录泡，暴露出DNA模板链。与复制不同的是，RNA聚合酶可以开始新RNA链合成，因此转录起始不需要引物。RNA聚合酶进入起始部位后，直接催化NTP，使其与模板链上相应的碱基配对（U-A，A-T，G-C），并结合到DNA模板链上，形成第一个磷酸二酯键。第一个核苷酸以GTP最常见，与第二个核苷酸结合后GTP仍保留5’-端三个磷酸，形成RNA聚合酶全酶-DNA-pppGpN-OH-3’ 复合物，称为转录起始复合物。RNA链开始合成后，σ因子从复合物上脱落，核心酶进一步合成RNA链。σ因子可以反复使用，它可与新的核心酶结合成RNA聚合酶的全酶，起始另一次转录过程。
（二）RNA链的延长
RNA链的延长反应由核心酶催化。核心酶沿模板DNA链向下游方向滑动，每滑动一个核苷酸的距离，则有一个核糖核苷酸按DNA模板链的碱基互补关系进入模板，即U-A、A-T、C-G，形成一个磷酸二酯键，如此不断延长下去。与DNA复制一样， RNA链的合成也是有方向性的，即从5’端→3’端进行。DNA链在核心酶经过后，即恢复双螺旋结构，新生成的RNA单链伸出DNA双链之外。原核细胞与真核细胞的转录延长过程基本相似。图10-13表示转录过程。
（三）转录的终止
图10-13原核生物转录过程
细菌和真核生物转录一旦开始，通常都能继续下去，直至转录完成而终止，DNA中有一段特殊序列，能提供转录停止信号，称为终止子(terminator T)，
而协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子称为终止因子(termination factor)，有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antitermination factor)。终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。
1．原核生物中的两类终止子
（1） 不依赖于ρ因子的终止子
这类终止子在DNA模板上靠近终止处有些特殊的碱基序列，即较密集的A-T配对区或G-C配对区的回文序列，其转录产物3’-端终止区能形成发夹结构，转录终点有4～6个寡聚U。这种发夹样二级结构使RNA聚合酶不再向下游移动，自动脱离模板，转录终止。
（2） 依赖ρ因子的终止子这类终止子必需依赖ρ因子的协助才能终止转录，ρ因子是一种分子量46000Da的蛋白，能识别并结合RNA产物3’-端上游富含C的特异序列，发挥其ATP酶活性水解ATP释出的能量，使核心酶构象改变停止转录。同时，ρ因子还具有解旋酶活性，能使RNA-DNA杂交双链螺旋解开，释放核心酶、ρ因子、RNA产物。释放的核心酶可以与σ因子重新结合，形成RNA聚合酶全酶，参与另一次转录过程。图10-14示原核生物终止子结构。
图10-14原核生物终止子结构
有关真核生物的终止机制知之甚少，其中，RNA聚合酶I转录出rRNA基因后，继续向下游转录出超过1000个碱基，此处有一个18bp的终止序列，在辅助因子协助下终止转录。
图10-14终止子模型
RNA聚合酶II的转录没有明确终止信号，转录通过结构基因的结尾后，还要向下继续转录几千的碱基，没有固定的终止点。RNA聚合酶III转录模板的下游有终止子，该终止子位于富含GC序列中的TTTT上，因此RNA聚合酶III催化的RNA前体3＇端有Ｕ序列。
转录过程是基因表达的中心环节，转录起始与终止的控制在基因表达的调控中起着重要作用，某些抗生素，如利福霉素、利链菌素能抑制细菌RNA聚合酶活性，因而抑制细菌RNA的合成。这正是此类抗生素抑菌作用的机理。
（四）转录的调控
基因表达受到各个方面的调控，其中转录环节的调控是最重要的环节，尤其是原核生物，转录和翻译几乎同时进行，转录水平的调控就显得更为重要。转录是在DNA模板上特殊位点开始的，该位点能被RNA聚合酶识别、结合并开始转录，这段必需的DNA序列称为启动子（promoter），又称启动基因。同时，RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。在DNA模板链上，从起始点逆转录方向的区域称为上游，顺转录方向的区域叫下游，转录起始点的碱基以+1表示，下游就是＋2、＋3、＋4……＋n，上游以－1、－2、－3、－4……－n表示。
1、原核生物的转录调控
（1） 原核生物启动子的结构与功能
分析比较上百种原核生物启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点，其中主要的有－10序列（Pribnow框）和－35序列（Sexfama box，识别区域）。
① 在转录起点上游大约－10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在－4到－13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。频度： T89 A89 T50 A65 A65 T100。Pribnow框中，头两个碱基TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。目前认为，Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。
② 在－35位置有一个6bp 的保守序列T T G A C A，是RNA酶的识别区域，其中TTG十分保守，各碱基出现频率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，。－35序列是原核RNA聚合酶中的σ因子识别位点。因此，－35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。－35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。－35序列提供RNA聚合酶识别信号，－10序列有助于DNA局部双链解开，启动子结构的不对称性决定了转录的方向，如图10-14。
转录起始点
-35区，σ因子识别位点

(Sexfama box)
-10 区
(Pribnow box)
1
-30
-50
10
-10
-40
-20
5 ¢
3 ¢
3 ¢
5 ¢
RNA聚合酶
T T G A C A
A A C T G T
T A T A A T Pu
A T A T T A Py
图10-14 E.coli启动子模型

（2）操纵子模型解释了原核生物基因调控的机制
法国分子生物学家Jacob和Monod对大肠杆菌（E.coli）酶产生的诱导和阻遏现象进行研究后提出了操纵子模型（operon structural model）来解释转录调控，该研究发现，在葡萄糖和乳糖都存在的培养基中，大肠杆菌不能利用乳糖，只有乳糖单独存在时才能利用乳糖。乳糖操纵子是大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子，包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。如图10-15所示
图10-15E.coli乳糖操纵子模型

① 当培养基中没有乳糖时，操纵子上游的调节基因i编码的调控蛋白结合到操纵基因O上，阻止了RNA聚合酶不能往下游移动，导致结构基因lacZ、lacY、lacA不能转录表达代谢乳糖的酶。如图10-16所示
图10-16调控蛋白阻遏结构基因转录

② 当只有乳糖存在时，乳糖可与调节基因i编码的调控蛋白结合，而使调控蛋白失效，不能与操纵基因结合，RNA聚合酶能往下游移动使结构基因结构基因lacZ、lacY、lacA转录，翻译出代谢乳糖的酶以代谢乳糖。如图10-17所示

图10-17乳糖阻遏调控蛋白

③ 当葡萄糖和乳糖同时存在时，不能利用乳糖的原因是在乳糖操纵子的调控中，有降解物基因活化蛋白（CAP）产生，CAP首先与cAMP形成复合物，此复合物才能与启动子相结合而促进结构基因转录，且游离的CAP不能与启动子结合，必须在细胞内有足够的cAMP时才行，但葡萄糖的降解产物能降低cAMP含量，所以影响CAP-cAMP复合物与启动基因结合，抑制结构基因转录，此时即使有乳糖存在，但仍不能利用乳糖。
2．真核生物转录调控
真核生物转录调控过程复杂，不组成操纵子来调控，大多数真核生物启动子以正调控为主，依靠顺式作用元件(cis-acting element，指DNA上对基因表达在调节活性的某些特定的调控序列，其活性仅影响其自身处于同一DNA分子上的基因)和反式作用因子（trans-acting factor，通过直接结合或间接作用于DNA、RNA等核酸分子，对基因表达调节作用的各类蛋白质因子）来协同调控的。
（1） 真核生物有三种RNA聚合酶对应三类启动子，RNA聚合酶I结合的是I类启动子，含I类启动子的基因主要是rRNA，这类基因有上千个拷贝，人的rRNA基因的启动子包括核心元件和上游调控元件，分别位于－45至＋20，后者位于－156至－107，两个原件都富含GC碱基对，两个原件之间的距离很重要，过长或过短都会降低转录起始效率。
② 由RNA聚合酶II结合的启动子叫II类启动子，分别有TATA盒（Hogness盒），中心在－25至－30，长度7bp左右。碱基频率：T82 A97 A85 A63 （T37）A83 A50（T37）。此序列能被RNA聚合酶II识别，使DNA双链解开，并决定转录的起点和方向。还有CAAT盒，中心在－75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT，能被RNA聚合酶识别并结合。还有GC盒，在CAAT盒上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。如图10-12所示
-GCGC---CAAT---TATA
转录起始
TATA 盒
CAAT 盒
G C 盒
增强子
顺式作用元件作用位点
结构基因
图10-12RNA聚合酶II启动子序列

③ 由RNA聚合酶III结合的启动子叫III类启动子，含有III类启动子的基因包括5SrRNA、tRNA等基因。其中tRNA基因的启动子包括A盒和B盒两部分，分别位于＋10至＋20，＋50至＋60的区域。
（2） 增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。在SV40的转录单元上发现，位于转录起始点上游约200 bp处的两段72 bp正向重复序列。增强子效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍，并且增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5’→3’或3’→5’），甚至和靶基因相距3kb，或在靶基因下游，均表现出增强效应；大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应时所必需的；没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；
（3） 沉默子是某些基因含有的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
（4）反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上，参与调控靶基因转录的蛋白质，也称为转录因子（transcriptional factor，TF）。如转录因子TFⅡD能识别结合TATA box；转录因子SP1识别结合GC box；转录因子CTF1识别结合CAAT box。
反式作用因子的类型分为基本转录因子（通用转录因子）和细胞特异性转录因子，前者又称TATA盒结合蛋白，如TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ等。细胞特异性转录因子包括 EF1因子，作用于红细胞、Isl-I因子作用于胰岛β细胞、Myo DI因子作用骨骼肌细胞、NF-κB因子作用于B淋巴细胞、DF3因子作用于乳腺癌细胞。 此外还有可诱导的转录因子如高温诱导的热休克转录因子（HSTF）；抗原诱导的CD28反应元件结合蛋白；感染与炎症诱导的激活蛋白2(AP-2)等。
反式作用因子有两个必需的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域，前者包括螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）；锌指结构（zinc finger）；亮氨酸拉链（leucine zipper，ZIP）；螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）。
三、转录后的加工与修饰
转录生成的RNA初级产物是RNA的前体，它们没有生物学活性。通常还需要经过一系列加工修饰过程，才能最终成为具有功能的成熟RNA分子。细菌中RNA转录后加工相对较为简单，由于不存在核膜，通常RNA转录尚未结束翻译
即已开始。真核细胞中几乎所有转录的前体都要经过一系列酶的作用，进行加工修饰，才能成为具有生物功能的RNA。
（一）mRNA的加工
mRNA通过转录作用获得DNA分子中储存的遗传信息，可以再通过翻译作用将其信息传到蛋白质分子中，它是遗传信息传递的中介物，具有重要的生物学意义。真核细胞的mRNA前体是核内分子量较大而不均一的hnRNA，mRNA由hnRNA加工而成。加工过程包括5’-端和3’-端的首尾修饰及剪接。
1．5’-端加帽 mRNA的5’-端帽子结构是在hnRNA转录后加工过程中形成的。转录产物第一个核苷酸常是5’-三磷酸鸟苷（5’-pppG），在细胞核内的磷酸酶作用下水解释放出无机焦磷酸，然后，5’-端与另一GTP反应生成三磷酸双鸟苷，在甲基化酶作用下，第一或第二个鸟嘌呤碱基发生甲基化反应，形成帽子结构（5’-m7GpppGp，或5’-GpppmG）。该结构的功能可能是翻译过程中起识别作用，并能稳定mRNA，延长半衰期。
2．3’-端加多聚腺苷酸尾 mRNA分子的3’-末端的多聚腺苷酸尾（poly A tail）也是在加工过程中加进的。在细胞核内，首先由特异核酸外切酶切去3’-端多余的核苷酸，再由多聚腺苷酸聚合酶催化，以ATP为底物，进行聚合反应形成多聚腺苷酸尾。poly A长度为20～200个核苷酸，其长短与mRNA的寿命有关，随寿命延长而缩短。poly A尾与维持mRNA稳定性、保持翻译模板活性有关。
3．剪接 hnRNA在加工成为成熟mRNA的过程中，约有50％～70％的核苷酸链片段被剪切。真核细胞的基因通常是一种断裂基因（interrupted gene），即由几个编码区被非编码区序列相间隔并连续镶嵌组成。在结构基因中，具有表达活性的编码序列称为外显子（exon）；无表达活性、不能编码相应氨基酸的序列称为内含子（intron）。在转录过程中，外显子和内含子均被转录到hnRNA中。在细胞核中，hnRNA进行剪接，即切掉内含子部分，然后将各个外显子部分再拼接起来（图10-18）。

图10-18mRNA前体的剪接

（二）tRNA的加工
1．剪切
在真核细胞中，tRNA前体分子的5’-端、3’-端及反密码环的部位由核糖核酸酶切去部分核苷酸链而形成tRNA。有些前体分子中还包含几个成熟的tRNA分子，在加工过程中，通过核酸水解酶的作用而将它们分开。
2．加CCA-OH的3’ -端
tRNA分子在转录后由核苷转移酶催化，以CTP和ATP为供体，氨基酸臂上的3’末端添加-CCA-OH结构，从而具有携带氨基酸的功能。
3．碱基修饰
在tRNA的加工过程中，由修饰酶实现碱基的修饰。例如，碱基的甲基化反应产生甲基鸟嘌呤（mG）、甲基腺嘌呤（mA），还原反应使尿嘧啶转变成二氢尿嘧啶（DHU），脱氨基反应使腺嘌呤转变为次黄嘌呤（I），碱基转位反应产生假尿苷（Ψ）等。故成熟的tRNA分子中拥有多种稀有碱基。
（三）rRNA的加工
rRNA的转录和加工与核糖体的形成同时进行。真核细胞在转录过程中首先生成的是45S大分子rRNA前体，然后通过核酸酶作用，断裂成28S、5.8S及18S等不同rRNA。这些rRNA与多种蛋白质结合形成核糖体。rRNA成熟过程中也包括碱基的修饰，碱基的修饰以甲基化为主。
三类RNA通过链的剪切、拼接、末端添加核苷酸、碱基修饰等加工过程转变为成熟的RNA，后者再参与蛋白质的生物合成等功能。
本章小结
DNA复制是指以亲代DNA为模板合成子代DNA将遗传信息准确的从亲代DNA传递给子代DNA的过程。基因通过转录和翻译，合成了各种功能性蛋白质，合成过程即基因表达的过程。复制→转录→翻译，为中心法则的经典内容。DNA复制的方式为半保留复制，复制体系包括模板、底物、酶和蛋白质因子、RNA引物等多种物质。酶和蛋白质因子包括解旋酶、拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌DNA复制最主要的酶。复制的过程可大体分为起始、延长和终止三个阶段。针对已发生了的DNA缺陷进行修复称为DNA修复，修复方式有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复等多种。切除修复是人体细胞修复DNA损伤的主要方式。某些病毒遗传信息储存在RNA分子中，能以RNA为模板合成DNA，称为逆转录。
转录是指以某段DNA分子的单链为模板，合成与其互补的RNA分子，将DNA的遗传信息传递给RNA的过程。参与RNA合成的成分有多种，包括DNA模板、四种三磷酸核糖核苷（NTP）原料、RNA聚合酶、某些蛋白质因子、无机离子等。大肠杆菌RNA聚合酶由σ因子与核心酶构成，σ因子辨认DNA模板上的启动子，协助转录的起始，启动子是一段特殊的核酸序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点，其中主要的有－10序列（Pribnow框）和－35序列（Sexfama box，识别区域）；真核生物的转录启动较为复杂，三种RNA聚合酶分别识别三类启动子。E.coli转录的终止分为依赖于ρ因子的终止和不依赖于ρ因子的终止，真核生物的终止则研究较少，比较复杂。转录是基因表达调控最主要的方式，原核生物的乳糖操纵子模型能说明基因表达调控的基本方式。真核生物的调控依靠顺式作用元件和反式作用因子来调控，前者如启动子、增强子、沉默子，后者包括一些转录结合蛋白类。核心酶使已经开始合成的RNA链延长。真核细胞RNA聚合酶Ⅱ催化mRNA的前体——hnRNA的合成，是真核生物中最重要的RNA聚合酶。
本章主要考点
基本概念：复制、转录、翻译、逆转录、基因表达、半保留复制。遗传信息传递的中心法则。复制与转录的体系与特点。参与复制的酶和蛋白质因子的作用。DNA修复的方式。RNA聚合酶的特点。转录调控相关的作用机制。mRNA的加工过程。
（王雨辰）