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山东医药2023 年第 63 卷第 8 期用于乙型肝炎病毒相关研究的人源化嵌合肝脏小鼠模型应用进展沈磊1，张思航1，周太成2，韦嘉31 昆明医科大学第四附属医院感染科，昆明650000；2 云南大学附属医院中心实验室；3 云南大学附属医院感染科摘要：人源化嵌合肝脏小鼠模型是一类具有肝损伤及免疫缺陷特点的小鼠模型。该小鼠模型体内携带人肝细胞，成功攻克了由于乙型肝炎病毒（HBV）宿主范围狭窄导致的HBV易感动物模型缺乏问题。近年来，随着各种人源化嵌合肝脏小鼠模型的逐渐完善，使得HBV相关动物研究的顺利开展成为可能。从Alb-uPA嵌合肝脏小鼠模型、Alb-rtTA/TRE-uPA嵌合肝脏小鼠模型、FRG嵌合小鼠模型到TK-NOG嵌合小鼠模型、人源化双嵌合小鼠模型逐渐克服了宿主物种限制和疾病建模方面的障碍。人源化双嵌合小鼠模型同时具备人免疫系统及人肝细胞，在HBV免疫机制研究及疫苗研发中具有极大的应用前景。了解不同人源化嵌合肝脏小鼠模型的制作情况、适用情况及优缺点，可为相关研究中HBV易感动物模型的选择提供参考。关键词：人源化嵌合肝脏小鼠模型；乙型肝炎病毒；动物模型doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.023 中图分类号：R512.62 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0091-04尽管已有多种抗HBV疗法应用于临床，但HBV感染仍是全球主要的公共卫生问题1-2。由于HBV的宿主范围狭窄，导致建立理想的HBV感染动物模型成为难题。近年来，人源化小鼠模型引起了越来越多学者的关注3-4。人源化小鼠模型是一类携带人的功能基因、细胞、组织或器官的小鼠模型；人源化嵌合肝脏小鼠模型是具有肝损伤及免疫缺陷特点的小鼠模型，常通过手术、药物或基因编辑来破坏小鼠肝细胞，再将人肝细胞在小鼠脾内注射，移植的人肝细胞通过小鼠脾静脉和门静脉迁移到肝脏，并开始增殖以取代损伤的小鼠肝细胞，进而形成嵌合肝脏小鼠5。与HBV转基因小鼠模型、高压水动力注射小鼠模型及病毒载体介导小鼠模型相比，人源化嵌合肝脏小鼠模型可被HBV成功感染，且支持完整的HBV生命周期，可产生具有转录活性的共价闭合环状双链DNA（cccDNA）6-7，是当前HBV研究及新药研发的重要工具8。现就HBV研究相关的人源化嵌合肝脏小鼠模型应用进展综述如下，为相关研究中HBV易感动物模型的选择提供参考。1 基于Alb-uPA小鼠的嵌合肝脏模型 Alb-uPA转基因小鼠是HECKEL等于1990年研发，主要用于新生儿出血性疾病的研究9。该模型中，小鼠携带尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），并由白蛋白（Alb）启动子控制。该模型通过上调小鼠体内uPA表达，导致小鼠形成严重的低纤维蛋白原血症和肝细胞损伤。Alb-uPA小鼠模型的肝损伤状态为外源性肝细胞的植入创造了条件。在此背景下，研究人员将uPA转基因小鼠与免疫缺陷鼠如无胸腺（nu/nu）裸 鼠、重 组 体 激 活 基 因 2（Rag2）敲 除（Rag2-/-）小鼠或重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行杂交，得到Alb-uPA/Rag2-/-或Alb-uPA/SCID等免疫缺陷型肝损伤小鼠模型10-11。该模型可被HBV成功感染，且模型的构建无外源性药物干预，可适用于临床抗 HBV 相关药物研究。KLUMPP 等12发现，在 Alb-uPA/SCID 小鼠中，衣壳组装调节剂NVR3-778比恩替卡韦具有更高的抗病毒活性，可同时降低血清HBV DNA、HBV RNA水平。研究人员还利用该小鼠模型证明了HBV感染不能诱导肝细胞干扰素应答13。然而，该模型易导致新生小鼠出血及肾脏疾病，且小鼠繁殖效率低、移植时间窗窄，阻碍了Alb-uPA小鼠模型的应用14。2 Alb-rtTA/TRE-uPA嵌合肝脏小鼠模型 为优化 Alb-uPA 小鼠模型，SONG 等15将 TRE-uPA转基因小鼠与Alb-rtTA转基因小鼠杂交，构建出 Alb-rtTA/TRE-uPA 小鼠。在四环素强力霉素作用下，反义四环素转录活化因子（rtTA）与四环素应基金项目：国家自然科学基金项目（82060368）。通信作者：韦嘉（E-mail：）91山东医药2023 年第 63 卷第 8 期答元件（TRE）结合并激活靶基因转录，uPA在小鼠肝细胞中表达并引起广泛肝损伤。在此基础上，将Alb-rtTA/TRE-uPA小鼠连续8代回交到NRG（NOD背景的 Rag2null Il2rgnull小鼠）背景，获得 Alb-rtTA/TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠，简称 URG 小鼠。在此模型中，可以通过调节Ad.TRE-uPA及四环素强力霉素的剂量来控制肝损伤程度，实现肝损伤可控，以利于后续的人肝细胞体内植入和增殖。与原uPA小鼠相比，URG小鼠需要长期使用外源性药物四环素强力霉素诱导肝损伤，但该模型实现了 uPA 仅在肝内可控性表达，成功解决了传统Alb-uPA嵌合小鼠模型的缺陷问题，使其繁殖效率显著提高，潜在出血情况减少，移植时间窗更加灵活，从而使该模型的应用范围更加广泛。LI等16通过URG小鼠模型验证了肝细胞样细胞的功能有效性，使肝功能衰竭的恢复成为可能。YANG等17使用该小鼠模型发现组蛋白乙酰基转移酶1的表达与HBV复制呈正相关，并证实组蛋白乙酰基转移酶1信号通路参与HBVcccDNA小染色体的组装和表观遗传调控。3 FRG嵌合小鼠模型 2007 年，AZUMA 等18通过将延胡索乙酰乙酸水解酶（FAH）基因敲除小鼠（FAH-/-）与 RAG2-/IL2RG-/-双 重 免 疫 缺 陷 小 鼠 杂 交，首 次 构 建 出FAH-/-RAG2-/IL2RG-/-（FRG）小鼠。白细胞介素 2（IL-2）受体链（IL-2R）与淋巴细胞增殖活化及NK细胞的发育密切相关，将其敲除可使小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育和功能严重受损，并完全阻断 NK 细胞的发育。富马酰乙酰乙酸酯水解酶（FAH）是酪氨酸代谢过程中所必需的酶，其缺失会导致富马酰乙酰乙酸酯在肝细胞中积累，后者对肝细胞具有毒性作用，进而导致肝细胞损伤19。为防止FRG小鼠肝细胞中富马酰乙酰乙酸酯过度积累，可通过口服2-（2-硝酸-4-三氟甲基苯甲酰）-1，3-环己基二酮（NTBC）来阻断FAH上游的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性，从而起到减轻肝损伤的作用20。FRG嵌合小鼠模型可以通过给予或停用NTBC来控制小鼠肝损伤程度，可以在任何鼠龄植入人肝细胞，并且可以连续多次植入21，人肝细胞嵌合率高达95%20。然而，Fah小鼠也会因型酪氨酸血症而发展为肝癌，并且需要在人源化后继续或间歇性地进行药物治疗以抑制肝癌的发展22。4 TK-NOG嵌合小鼠模型 为了克服 uPA/SCID 和 FRG 小鼠的缺陷，日本学者将 NOD/scid小鼠和 链 IL-2受体敲除鼠进行杂交，构建出免疫缺陷NOD/Shi-scid（NOG）小鼠23。将单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSVtk）表达片段显微注射到NOD/Shi品系小鼠受精卵中，构建HSVtk转基因小鼠，再将雌性转基因小鼠与雄性NOG小鼠交配，从而产生 TK-NOG 小鼠。HSVtk转基因构建体包含小鼠白蛋白增强子/启动子，HSVtk mRNA在TK-NOG小鼠肝脏中选择性表达，使TK-NOG小鼠发生特异性肝损伤24。在 TK-NOG 小鼠模型中，表达 HSVtk的小鼠肝细胞暴露于更昔洛韦后发生凋亡，使得移植的人肝细胞在小鼠肝脏中稳定维持。该小鼠模型造模成功后，后续无需外源性药物维持，且增加更昔洛韦剂量可提高人肝细胞移植率。该小鼠模型成功感染HBV后，可至少连续20周观察到肝组织中HBs抗原呈阳性25。此外，与 uPA/SCID和 FRG小鼠模型相比，TK-NOG小鼠模型的主要优势是不易出现肾病、肝脏肿瘤等疾病，其主要缺点是雄性小鼠不育26。5 人源化双嵌合小鼠模型 5.1AFC8-hu HSC/Hep双嵌合小鼠模型虽然上述人鼠嵌合肝脏模型成功克服宿主物种限制和疾病建模方面的障碍，但小鼠缺乏免疫系统，使其无法用于研究宿主免疫反应和肝炎病毒诱导的免疫病理。2011年，WASHBURN等及ROBINET等27-28研发出一种具有人免疫系统和人肝细胞的人源化双嵌合小鼠模型，即AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型。研究人员将FK506结合蛋白（FKBP）-Caspase-8结合蛋白（AFC8）基因转入Balb/C Rag2-C-null小鼠受精卵中，构建出AFC8转基因小鼠。FKBP与白蛋白启动子激活的Caspase-8结合，在AP20187的诱导下，可使小鼠肝细胞发生特异性凋亡。在此基础上，将人原代肝细胞（Hep）和CD34+造血干细胞（HSC）移植到AFC8转基因小鼠体内，即构成AFC8-hu HSC/Hep双嵌合小鼠模型29-30。此模型可同时具备人免疫系统及人肝细胞，在HBV免疫机制研究及疫苗研发中具有极大的应用前景。然而该模型不仅造模困难、费用昂贵，而且人肝细胞嵌合率较低，远不及 Alb-uPA/SCID、FRG等人源化小鼠模型的人源化肝脏重建率，使得该模型无法广泛应用于HBV相关研究31。5.2A2/NSG-hu HSC/Hep双嵌合小鼠模型BILITY等 32 将人原代肝细胞和CD34+造血干细胞直接注入HLA-A2转基因的NOD/SCID/IL2rnull（NSG）新生小鼠（A2/NSG）肝脏，实现人肝细胞及免疫系统双嵌合。A2/NSG小鼠携带人类HLA-A2基因，可促进主要组织相容性复合体限制T细胞的发育 33。在该模型中使用92山东医药2023 年第 63 卷第 8 期小鼠特异性抗Fas激动剂抗体可使小鼠肝细胞发生特异性凋亡，从而使移植的人肝细胞具有再生优势 34。与其他人源化嵌合肝脏小鼠相比，A2/NSG-hu HSC/Hep双嵌合小鼠模型不仅具有人肝细胞和免疫系统，还支持HBV持续性感染、抗HBV免疫反应，且可在HBV感染的嵌合肝组织中观察到活化的人M2样巨噬细胞积累。该模型最显著的缺点为人肝细胞来自胎儿肝祖细胞，且移植水平相对较低（20%），导致该小鼠模型血液HBV滴度较低，同时也存在动物伦理的限制35。总之，发展有前景的HBV易感动物模型是研究HBV感染机制、开发HBV感染新疗法的关键。由于HBV及动物模型的自身生理特性，高压水动力注射模型、转基因小鼠模型及病毒载体介导小鼠模型等均无法在小鼠体内形成HBVcccDNA，使其难以为后续研究提供强有力的科学支撑。相比之下，人肝嵌合小鼠不仅对HBV感染敏感，而且能够在小鼠体内形成HBVcccDNA，是当前模拟临床HBV感染患者的最佳模型，被广泛应用于肝损伤、基因调节、药物毒性和嗜肝病毒感染等相关研究中，并为抗HBV药物的研发与评估提供了实验基础。目前为止，已有多种人源化嵌合小鼠模型被研发出来，具有各种优点和局限性。人源化嵌合肝脏小鼠模型主要面临着价格昂贵、制备过程复杂、技术要求苛刻、无法遗传等共性问题。随着实验技术的发展，相信以上种种限制会被逐一攻克，且在已有技术条件基础上，最终服务于临床，为HBV患者提供更加精准的个性化治疗。参考文献：1LI M，WANG Z Q，ZHANG L，et al.Burden of cirrhosis and other chronic liver diseases caused by specific etiologies in China，1990-2016：findings from the global burden of disease study 2016J.Biomed Environ Sci，2020，33（1）：1-10.2REVILL P A，CHISARI F V，BLOCK J M，et al.A global scientific strategy to cure hepatitis B J.Lancet Gastroenterol Hepatol，2019，4（7）：545-558.3STRIPECKE R，MNZ C，SCHURINGA J J，et al.Innovations，challenges，and minimal information for 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B）。两类分子影像探针均有很好的靶向颗粒酶B的能力，可预测免疫治疗的效果。但这些分子探针也存在靶部位摄取低、体内不稳定、易受体内其他环境干扰等不足，未来仍需深入研究并进行更多的临床试验，才能将此类探针应用于多种肿瘤的免疫治疗疗效评估。关键词：颗粒酶B；分子影像探针；近红外荧光成像探针；正电子发射断层扫描探针；免疫疗法；恶性肿瘤doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.024 中图分类号：R730.51；R814 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0094-05免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段。使用抗体阻断免疫检查点的免疫治疗已被证实在晚期恶性肿瘤中有效，被批准用于多种恶性肿瘤的治疗1-5。然而目前仅有少部分肿瘤患者可以从免疫治疗中受益，不当治疗还可诱发免疫相关不良反应（如肝炎、结肠炎等），甚至会引起患者死亡。因此，在免疫治疗早期评估患者的治疗反应，不仅可以最大限度地发挥免疫治疗的作用，还能为治疗不响应的患者及基金项目：国家自然科学基金面上项目（22076069）。通信作者：林建国（E-mail：linjianguojsinm.org）25KANBE A，ISHIKAWA T，HARA A，et al.Novel hepatitis B virus infection mouse model using herpes simplex virus type 1 thymidine kinase transgenic miceJ.J Gastroenterol Hepatol，2021，36（3）：782-729.26UEHARA S，HIGUCHI Y，YONEDA N，et al.An improved TK-NOG mouse as a novel platform for humanized liver that overcomes limitations in both male and female animalsJ.Drug Metab Pharmac，2022，42：100410.27WASHBURN M L，BILITY M T，ZHANG L，et al.A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection，immune 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