隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究.pdf

罗志宏,钟雯雯,刘昕明,等.隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究收稿日期:2 0 2 2 0 6 1 2 修回日期:2 0 2 2 0 8 1 0*广西科技基地和人才专项(桂科A D 2 1 0 7 5 0 1 6),广西自然科学基金项目(2 0 2 0 G X N S F AA 2 9 7 1 6 3,2 0 2 0 G X N S F GA 2 9 7 0 0 2),国家自然科学基金项目(U 2 0 A 2 0 1 0 1,8 2 0 6 0 6 4 0),广西八桂学者专项经费项目(0 5 0 1 9 0 5 5)和广西中医药大学海洋药物研究院团队科研专项经费项目(2 0 1 8 Z D 0 0 5 A 0 2)资助。【第一作者简介】罗志宏(1 9 9 6-),男,在读硕士研究生,主要从事海洋药用天然产物化学研究。【*通信作者】陈显强(1 9 8 3-),男,副研究员,主要从事海洋药用天然产物化学成分研究,E m a i l:x i a n q i a n g c h e n y e a h.n e t。刘永宏(1 9 7 2-),男,研究员,主要从事海洋创新药物研究,E m a i l:y o n g h o n g l i u s c s i o.a c.c n。【引用本文】罗志宏,钟雯雯,刘昕明,等.隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究J.广西科学,2 0 2 3,3 0(3):4 8 5 4 9 3.L UO Z H,Z HON G W W,L I U X M,e t a l.I s o l a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f S y m b i o t i c o r E p i p h y t i c F u n g i f r o m G y m n o l o p h u s o b s c u r a a n d S t u d y o n t h e A n t i b a c t e r i a l A c t i v i t y o f T h e i r M e t a b o l i t e s J.G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,3 0(3):4 8 5 4 9 3.生物科学隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究*罗志宏,钟雯雯,刘昕明,高程海,夏辰曦,陈显强*,刘永宏*(广西中医药大学海洋药物研究院,广西南宁 5 3 0 2 0 0)摘要:为更好地开发和利用蛇尾共附生微生物资源,本研究对隐板裸刺蛇尾(G y m n o l o p h u s o b s c u r a)可培养共附生真菌及其代谢产物抑菌活性进行研究。实验采用3种培养基分离隐板裸刺蛇尾共附生真菌,通过B l a s t分析I T S r D NA基因序列鉴定真菌,并运用9 6孔板法评估真菌的乙酸乙酯提取物的抑菌活性。实验结果发现,从隐板裸刺蛇尾分离的共附生真菌有格孢腔菌目(P l e o s p o r a l e s)真菌7株和肉座菌目(H y p o c r e a l e s)真菌4株。两株真菌(G X I MD 0 2 0 2 1和G X I MD 0 2 0 2 2)与已报道菌株的I T S r D NA序列相似度小于9 7%,是潜在新菌种,占已鉴 定 菌 株 数 量 的1 8.2%。所 有 共 附 生 真 菌 代 谢 产 物 对 至 少 一 种 指 示 菌 有 抑 制 活 性。除G X-I MD 0 2 0 1 9、G X I MD 0 2 0 2 0、G X I MD 0 2 0 2 2和G X I MD 0 2 0 2 3外,其他菌株代谢产物均抑制表皮葡萄球菌(S t a p h-y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s);4株菌株(G X I MD 0 2 0 1 8、G X I MD 0 2 0 2 0、G X I MD 0 2 0 2 1和G X I MD 0 2 0 2 2)代谢产物抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M e t h i c i l l i n r e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s);3株菌株(G X I MD 0 2 0 2 1、G X-I MD 0 2 0 2 2和G X I MD 0 2 0 2 4)代谢产物抑制铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a a e r u g i n o s a);9株菌株(G X I MD 0 2 0 1 7和G X I MD 0 2 0 2 1除外)代谢产物抑制A c t i n o m y c e s v i s c o s u s。本研究表明隐板裸刺蛇尾共附生真菌中潜在新菌占比较高,丰富了棘皮动物共附生真菌的多样性,为隐板裸刺蛇尾共附生真菌次级代谢产物及其生物活性研究提供了菌种。关键词:共附生真菌;隐板裸刺蛇尾;抑菌活性;微生物;棘皮动物中图分类号:P 7 4 5 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 5 9 1 6 4(2 0 2 3)0 3 0 4 8 5 0 9D O I:1 0.1 3 6 5 6/j.c n k i.g x k x.2 0 2 3 0 7 1 0.0 0 7 棘皮动物是海洋底栖无脊椎动物中的重要类群,蛇尾纲(O p h i u r o i d e a)在棘皮动物门(E c h i n o d e r m a-t a)中种类最多、资源丰富。蛇尾纲动物是中国海域最丰富的棘皮动物种群,共8 9属2 2 1种1。据报道,584广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3蛇尾纲动物含有多糖、甾族类化合物、皂苷、不饱和脂肪酸、倍半萜、神经节苷脂等成分,这些成分具有一定的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗血管形成、抗氧化等活性2 7,但蛇尾纲动物隐板裸刺蛇尾(G y m n o l o p h u s o b s c u r a)的化学成分研究还未见报道。有研究表明,从无脊椎动物中分离得到的许多化合物是由其共附生微生物产生的8 1 0。据统计,海参来源可培养真菌属于子囊菌门(A s c o m y c o t a)2 4科2 9属,并能够产生聚酮类、生物碱和萜类等化合物,这些化合物具有细胞毒、抗菌、抗血管生成和酶抑制等多种生物活性1 1。海星的共附生真菌研究报道较多,其次级代谢产物结构具有化学多样性,并具有抗菌和抗肿瘤等活性1 2 1 7。海百合可培养共附生真菌包括小光壳属(L e p t o s p h a e r u l i n a)、链格孢属(A l t e r-n a r i a)、曲霉属(A s p e r g i l l u s),其次级代谢产物也有众多的研究报道1 8 2 0。海胆共附生真菌的次级代谢产物具有抗菌和细胞毒活性2 1,2 2。但是国内外有关蛇尾纲的共附生真菌及活性物质方面的研究未见报道。为进一步阐明蛇尾纲动物共附生真菌的多样性,为其天然活性代谢产物研究提供微生物资源,本研究从西沙群岛采集隐板裸刺蛇尾,分离其可培养共附生真菌,并研究其共附生真菌代谢产物的抑菌活性,以丰富人们对隐板裸刺蛇尾共附生微生物的认知,为其微生物资源开发利用提供菌种基础,同时为海洋微生物的药用开发利用提供一定的科学依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试动物 隐板裸刺蛇尾于2 0 2 0年7月采自西沙群岛,采样后装入保鲜袋,于冰盒中保存,2 4 h内送至实验室保存在4 冰箱。参考 中国动物志:无脊椎动物 第四十卷 棘皮动物门 蛇尾纲2 3的特征描述鉴定其为隐板裸刺蛇尾。1.1.2 培养基 微生物分离所用培养基包括察氏培养基、MB培养基(麦芽提取粉1 5.0 g,海盐1 5.0 g,琼脂2 0.0 g,氯霉素和氨苄青霉素各1 0 0 m g,蒸馏水1 L)和孟加拉红 琼 脂 培 养 基。抑 菌 活 性 测 试 所 用 培 养 基 为L u r i a B e r t a n i(L B)固体培养基和营养肉汤(N B)固体培养基,不加琼脂则为液体培养基。大米培养基(大米1 0 0 g,海盐 2 g,蒸馏水1 1 0 m L)用于共附生真菌的发酵。1.1.3 指示菌 铜 绿 假 单 胞 菌(P s e u d o m o n a a e r u g i n o s a AT C C 1 0 1 4 5)、耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌(M e t h i c i l l i n r e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s AT C C 4 3 3 0 0,MR S A)、表皮葡萄球菌(S t a p h y l o c o c-c u s e p i d e r m i d i s AT C C 1 2 2 2 8)、A c t i n o m y c e s v i s c o-s u s AT C C 1 5 9 8 7、肺 炎 克 雷 伯 菌(K l e b s i e l l a p n e u-m o n i a e AT C C 1 3 8 8 3)、鲍曼不动杆菌(A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i AT C C 1 9 6 0 6)由广西中医药大学海洋药物研究院保藏。1.1.4 主要试剂和仪器 氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜(DM S O)试剂等均为分析纯,广东光华科技股份有限公司生产;引物I T S 1/I T S 4,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;D NA提取试剂盒(D P 3 0 5),天根生化科技(北京)有限公司生产;P C R试剂盒(2E a s y T a q P C R S u p e r M i x),北京全式金生物技术股份有限公司生产;P C R仪(S 1 0 0 0型),美国B i o R a d公司生产;电泳仪(D Y-C P 3 1 E型),北京六一生物科技有限公司生产;凝胶成像分析仪(I N F I N I T Y 3 0 2 6型),V I L B E R L OUR-MAT公司生产;培养箱(S H P 1 5 0型),上海精宏实验设备有限公司生产;旋转蒸发仪(N 1 3 0 0 D WB型),日本东京理化器械株式会社生产。1.2 方法1.2.1 共附生真菌的分离 用无菌水清洗隐板裸刺蛇尾表面3遍,加入5 m L无菌海盐水研磨,研磨后的液体视为样品原液,保存于离心管备用。样品原液稀释至1 0-2、1 0-3和1 0-4倍后,均匀涂布到相应的3种分离培养基平板上,于2 5 培养箱培养,自第5天开始每日观察菌落生长情况,并将其转接到另一新的平板上进行三区划线纯化。记录菌落数及菌落的形态特征。1.2.2 菌株鉴定 取新鲜菌体,液氮研磨,按照D NA提取试剂盒的说明提取真菌基因组。采用真菌通用引物 I T S 1(5 T C C G T AG G T GAA C C T G C G G 3)和 I T S 4(5 T C C T C C G C T T AT T GAT AT G C 3)进 行 P C R扩增。扩增样品经琼脂糖凝胶电泳验证后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。测序结果提交至G e n B a n k数据库,应用B l a s t进行序列相似性比对,获得相似度高的种属信息。使用ME G E X软件的U P GMA法构建系统发育树,置信值检测设为B o o t s t r a p 1 0 0 0次。684罗志宏,钟雯雯,刘昕明,等.隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究1.2.3 共附生真菌代谢产物的制备 将分离得到的菌株接种到大米培养基,2 5 静置培养3 0 d。使用乙酸乙酯作为溶剂,超声提取代谢产物3次,合并提取液并减压浓缩,回收溶剂,得到共附生真菌代谢产物。1.2.4 共附生真菌代谢产物的抑菌活性测试 利 用DM S O溶 解 代 谢 产 物,样 品 浓 度 为5 0 m gm L-1,备用。指示菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌培养于L B培养基,A c t i n o m y c e s v i s c o s u s、鲍曼不动杆菌培养于N B培养基。采用9 6孔板法测定发酵产物对指示菌的抑制活性。9 6孔板的第1列加入1 9 0 L灭菌液体培养基,第2-1 1列加入1 0 0 L灭菌液体培养基;然后再往第1列中加入1 0 L样品溶液,混合均匀,取1 0 0 L加入到第2列,采用倍比稀释法稀释至第9列。第1-9列的每孔加入1 0 0 L菌液,混合均匀,使得对应列的样品终浓度分别为1.2 5 0 0 0、0.6 2 5 0 0、0.3 1 2 5 0、0.1 5 6 2 5、0.0 7 8 1 3、0.0 3 9 0 6、0.0 1 9 5 3、0.0 0 9 7 7、0.0 0 4 8 8 m gm L-1。第1 0列加入1 0 0 L灭菌液体培养基代替菌液作为阴性对照,第1 1列加入1 0 0 L菌液但不加测试样品作为空白对照。阳性药物氨苄青霉素钠和环丙沙星终浓度均为5 0.0 0 0、2 5.0 0 0、1 2.5 0 0、6.2 5 0、3.1 2 5、1.5 6 3、0.7 8 1、0.3 9 1、0.1 9 5 gm L-1。置3 7 恒温培养箱培养2 4 h,观察实验现象。如孔内液体呈浑浊状态,说明相应浓度的样品无抗菌活性;若孔内液体澄清,说明小孔内细菌生长被抑制。对应澄清孔的最小样品浓度为发酵产物抑制致病菌的最低抑制浓度(M I C)。2 结果与分析2.1 共附生真菌的分离 从隐板裸刺蛇尾共分离出2 5株可培养共附生真菌。根据菌落形态特征,这2 5株真菌可初步分为1 1种,其菌落培养特征如图1所示。从孟加拉红琼脂培图1 隐板裸刺蛇尾共附真菌在MB培养基上的菌落形态F i g.1 C o l o n y m o r p h o l o g y c u l t u r e d o n MB m e d i u m o f s y m b i o t i c a n d e p i p h y t i c f u n g i f r o m G y m n o l o p h u s o b s c u r a784广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3养基中可分离出菌株G X I MD 0 2 0 1 6、G X I MD 0 2 0 1 7、G X I MD 0 2 0 1 8、G X I MD 0 2 0 1 9、G X I MD 0 2 0 2 3,MB培养基中可分离出菌株G X I MD 0 2 0 1 8、G X I MD 0 2 0 2 0、G X I MD 0 2 0 2 1、G X I MD 0 2 0 2 2、G X I MD 0 2 0 2 3,察氏培养基中可分离出菌株G X I MD 0 2 0 1 7、G X I MD 0 2 0 2 3、G X I MD 0 2 0 2 4、G X I MD 0 2 0 2 5、G X I MD 0 2 0 2 6。将 菌株纯化至平板上供后续实验使用。2.2 菌株鉴定 通过B l a s t比对I T S r D NA基因序列的结果如表1所示。G X I MD 0 2 0 2 1和G X I MD 0 2 0 2 2株菌与已确定分类地位和未确定分类地位菌株的相似度均不到9 7%,为潜在新菌,占已鉴定菌株数量的1 8.2%;G X I MD 0 2 0 1 6、G X I MD 0 2 0 2 0与已确定分类地位菌株的序列同源性最高相似度小于9 7%,但与未确定分类地位的格孢腔菌目(P l e o s p o r a l e s)菌株序列同源性最高相似度大于9 8%;其他菌株与已报道菌株的相似度均大于9 9%,包括3株枝顶孢属(A c r e m o n i-u m)菌株、2株T r e m a t o s p h a e r i a属菌株、1株拟盾壳霉属(P a r a c o n i o t h y r i u m)菌株、1株丛赤壳属(N e c-t r i a)菌株。表1 隐板裸刺蛇尾共附生真菌I T S序列在G e n B a n k数据库的比对结果T a b l e 1 A l i g n m e n t r e s u l t s o f I T S s e q u e n c e s o f s y m b i o t i c a n d e p i p h y t i c f u n g i o f G.o b s c u r a i n G e n B a n k d a t a b a s e菌株编号S t r a i n c o d e相似菌株S i m i l a r s t r a i n相似菌株登录号S i m i l a r s t r a i n r e g i s t r a t i o n n u m b e r相似度/%S i m i l a r i t y/%G X I MD 0 2 0 1 6P l e o s p o r a l e s s p.MH 1 4 1 2 9 0.19 8.8 2T r e m a t e i a c h i a n g r a i e n s i sN R 1 6 8 8 6 7.19 3.7 6G X I MD 0 2 0 1 7A c r e m o n i u m a l t e r n a t u mMK 9 5 2 5 2 7.19 9.8 1G X I MD 0 2 0 1 8T r e m a t o s p h a e r i a g r i s e aK X 7 5 7 0 3 0.19 9.8 0G X I MD 0 2 0 1 9P a r a c o n i o t h y r i u m c y c l o t h y r i o i d e sMF 1 3 5 5 1 1.11 0 0.0 0G X I MD 0 2 0 2 0P l e o s p o r a l e s s p.MK 7 3 2 1 4 9.11 0 0.0 0B i m u r i a n o v a ez e l a n d i a eOM 3 3 7 5 3 8.19 2.6 1G X I MD 0 2 0 2 1L e p t o s p h a e r u l i n a s p.KY 8 2 7 3 5 2.19 4.9 8L e t e n d r a e a h e l m i n t h i c o l aMH 4 8 3 9 9 6.19 1.7 7G X I MD 0 2 0 2 2L e p t o s p h a e r u l i n a s p.KY 8 2 7 3 5 2.19 6.6 9P s e u d o p i t h o m y c e s a n g o l e n s i sN R 1 6 1 1 2 1.19 3.1 9G X I MD 0 2 0 2 3T r e m a t o s p h a e r i a g r i s e aK T 2 2 0 6 6 2.19 9.6 0G X I MD 0 2 0 2 4A c r e m o n i u m s c l e r o t i g e n u mMT 2 2 6 5 9 8.19 9.8 0G X I MD 0 2 0 2 5N e c t r i a d e m a t i o s aMH 7 4 8 1 7 6.19 9.0 3G X I MD 0 2 0 2 6A c r e m o n i u m a l t e r n a t u mMT 5 2 9 3 4 2.19 9.8 0 应用ME G E X软件中的C l u s t a l W模块进行D NA排序,用U P GMA法构建系统发育树(图2)。从图2可以看出,1 1株真菌与序列同源性最高菌株构成了2个大聚类,分别属于格孢腔菌目(P l e o s p o r a-l e s)和 肉 座 菌 目(H y p o c r e a l e s)。G X I MD 0 2 0 1 6与P l e o s p o r a l e s s p.(MH 1 4 1 2 9 0.1)、T r e m a t e i a c h i a n-g r a i e n s i s(N R 1 6 8 8 6 7.1)形成了一个1 0 0%支持率的聚类,且 与 未 确 定 分 类 地 位 的 格 孢 腔 菌 目 真 菌P l e o s p o r a l e s s p.(MH 1 4 1 2 9 0.1)形成了末端聚类,说明G X I MD 0 2 0 1 6与格孢腔菌目(P l e o s p o r a l e s)隔孢假壳科(D i d y m o s p h a e r i a c e a e)的真菌亲缘关系密切,但尚不能具体到属和种。G X I MD 0 2 0 2 1与未确定 分类地位真菌L e p t o s p h a e r u l i n a s p.(KY 8 2 7 3 5 2.1)、P l e o s p o r a l e s s p.(MK 7 3 2 1 4 9.1)构成 了7 7%支 持 率 的 聚 类。G X I MD 0 2 0 2 0、G X-I MD 0 2 0 2 2分别与P l e o s p o r a l e s s p.(MK 7 3 2 1 4 9.1)和L e p t o s p h a e r u l i n a s p.(KY 8 2 7 3 5 2.1)形成末端聚类。虽 然G X I MD 0 2 0 2 0、G X I MD 0 2 0 2 1、G X-I MD 0 2 0 2 2 I T S r D NA基因序列分别与B i m u r i a n o-v a ez e l a n d i a e(OM 3 3 7 5 3 8.1)、L e t e n d r a e a h e l m i n-t h i c o l a(MH 4 8 3 9 9 6.1)、P s e u d o p i t h o m y c e s a n g o l e n-s i s(N R 1 6 1 1 2 1.1)相似度较高,但是没有形成末端聚类。目 前,G X I MD 0 2 0 2 0、G X I MD 0 2 0 2 1、G X-I MD 0 2 0 2 2尚不能解析到具体的种,但是从系统发育树(图2)可知,它们与隔孢假壳科(D i d y m o s p h a e r i-a c e a e)的真菌亲缘关系密切。其他菌株与I T S r D NA基因序列高度相似的菌株均构成了末端聚类,且支持率为5 4%-1 0 0%。884罗志宏,钟雯雯,刘昕明,等.隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究图2 运用U P GMA法基于I T S r D NA序列构建的系统发育树F i g.2 P h y l o g e n e t i c t r e e c o n s t r u c t e d b y U P GMA m e t h o d b a s e d o n t h e I T S r D NA s e q u e n c e2.3 共附生真菌的抑菌活性 隐板裸刺蛇尾共附生真菌代谢产物抗菌活性如表2所 示。G X I MD 0 2 0 1 6、G X I MD 0 2 0 1 7、G X-I MD 0 2 0 1 8、G X I MD 0 2 0 2 1、G X I MD 0 2 0 2 4、G X-I MD 0 2 0 2 5、G X I MD 0 2 0 2 6菌株代谢产物有一定的抗表皮葡萄球菌活性,其M I C值为0.3 1 2 5-1.2 5 0 0 m gm L-1。G X I MD 0 2 0 1 8、G X I MD 0 2 0 2 0、G X-I MD 0 2 0 2 1、G X I MD 0 2 0 2 2代谢产物抑制MR S A的M I C值 为0.6 2 5 0-1.2 5 0 0 m gm L-1。G X-I MD 0 2 0 2 2和G X I MD 0 2 0 2 4菌株代谢产物显著抑制铜绿假单胞菌,M I C值为0.0 3 9 0 m gm L-1;G X-I MD 0 2 0 2 1菌株代谢产物抑制铜绿假单胞菌的M I C值为1.2 5 0 0 m gm L-1。除G X I MD 0 2 0 1 7和G X-I MD 0 2 0 2 1外,其他菌株代谢产物均具有一定的抑制A c t i n o m y c e s v i s c o s u s活 性,其 中G X I MD 0 2 0 1 9和G X I MD 0 2 0 2 5菌株代谢产物具有显著的抑制A c t i-n o m y c e s v i s c o s u s的 活 性,M I C值 为0.1 5 6 m gm L-1。所有测试样品未显示有抑制肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌活性。表2 隐板裸刺蛇尾共附生真菌代谢产物的M I C值T a b l e 2 M I C v a l u e o f t h e m e t a b o l i t e s o f s y m b i o t i c a n d e p i p h y t i c f u n g i f r o m G.o b s c u r aU n i t:m gm L-1菌株S t r a i nM I C v a l u eS t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i sMR S AP s e u d o m o n a a e r u g i n o s a A c t i n o m y c e s v i s c o s u sK l e b s i e l l a p n e u m o n i a eA c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i iG X I MD 0 2 0 1 60.6 2 5 0 0-1.2 5 0 0 0-G X I MD 0 2 0 1 70.3 1 2 5 0-G X I MD 0 2 0 1 81.2 5 0 0 01.2 5 0 0 0-0.6 2 5 0 0-G X I MD 0 2 0 1 9-0.1 5 6 2 5-G X I MD 0 2 0 2 0-1.2 5 0 0 0-0.6 2 5 0 0-984广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3续表C o n t i n u e d t a b l e菌株S t r a i nM I C v a l u eS t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i sMR S AP s e u d o m o n a a e r u g i n o s a A c t i n o m y c e s v i s c o s u sK l e b s i e l l a p n e u m o n i a eA c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i iG X I MD 0 2 0 2 10.6 2 5 0 01.2 5 0 0 01.2 5 0 0 0-G X I MD 0 2 0 2 2-0.6 2 5 0 00.0 3 9 0 60.3 1 2 5 0-G X I MD 0 2 0 2 3-0.6 2 5 0 0-G X I MD 0 2 0 2 4 0.6 2 5 0 0-0.0 3 9 0 61.2 5 0 0 0-G X I MD 0 2 0 2 50.3 1 2 5 0-0.1 5 6 2 5-G X I MD 0 2 0 2 61.2 5 0 0 0-1.2 5 0 0 0-Am p i c i l l i n s o d i u m3.1 2 53.1 2 5-6.2 5 01.5 6 31.5 6 3C i p r o f l o x a c i n6.2 5 00.7 8 13.1 2 53.1 2 50.7 8 13.1 2 53 讨论 本研究开展蛇尾纲动物共附生真菌研究,从隐板裸刺蛇尾分离2 5株共附生真菌,按其形态特征归属为1 1种。G X I MD 0 2 0 1 6、G X I MD 0 2 0 1 9仅从孟加拉红琼 脂 培 养 基 中 分 离 得 到;G X I MD 0 2 0 2 0、G X-I MD 0 2 0 2 1、G X I MD 0 2 0 2 2仅从MB培养基中分离得到;G X I MD 0 2 0 2 4、G X I MD 0 2 0 2 5、G X I MD 0 2 0 2 6 仅从察氏培养基中分离得到,说明不同的培养基对海洋真菌有选择性且有助于丰富真菌的多样性,与刘思远等2 4的研究结论相似。本研究分离得到的9株真菌与已报道真菌的基因序列相似度大于9 8%,且形成末端聚类。此外,G X I MD 0 2 0 2 1和G X I MD 0 2 0 2 2菌株在B l a s t分析时与确定分类地位菌株的相似度均小于9 7%,且没有形成末端聚类。通常相似度9 4.9%-9 8.0%或平均相似度9 6.4%被 认 为 是 区 分 新 种 的 界 限2 5,G X-I MD 0 2 0 2 1和G X I MD 0 2 0 2 2与其他菌株相似度小于9 7%,因而无法确定其种,为潜在新菌种,在后续研究中可根据形态特征以及基于其他基因序列构建的系统发育树进一步确定其归类。G X I MD 0 2 0 1 6和G X-I MD 0 2 0 2 0菌株与未确定分类地位的格孢腔菌目菌株基因序列相似度大于9 8%且在系统发育树中与其形成末端聚类,但与已确定分类地位菌株的最高相似度小于9 4%,其种属归类需要进一步确认。海洋微生物来源的天然产物是海洋新药开发的研究热点,主要来自海洋真菌和海洋细菌。然而,最新统计分析表明7 0%海洋真菌天然产物与已知化合物相似,新颖结构类型化合物较少,研究海洋特定且未研究的微生物有利于发现结构新颖的化合物2 6。本研究已获得两株潜在新菌G X I MD 0 2 0 2 1和G X-I MD 0 2 0 2 2,今后可对其化学成分开展研究以期获得结构新颖的海洋天然产物。本研究分离得到了枝顶孢属(A c r e m o n i u m)、T r e m a t o s p h a e r i a属、拟盾壳霉属(P a r a c o n i o t h y r i u m)、丛赤壳属(N e c t r i a)的菌株,这些属菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制、抗氧化、抗炎、抗疟疾、细胞毒性、植物毒性、抗病毒、神经保护、杀虫和酶抑制等多种生物活性2 7 3 2,有着广泛的药用前景。因此,本研究分离得到的菌株可以为发掘生物活性物质提供微生物资源。表皮葡萄球菌、MR S A、铜绿假单胞菌是临床致病菌,本研究结果表明隐板裸刺蛇尾共附生真菌的代谢产物对表皮葡萄球菌、MR S A、铜绿假单胞菌有一定的抑制作用。因此,隐板裸刺蛇尾共附生真菌是发掘抗菌活性物质的资源,具体的抗菌成分有待于进一步研究。A c t i n o m y c e s v i s c o s u s是菌斑的主要成员,与龋病以及牙周病的发生有关,隐板裸刺蛇尾共附生真菌的代谢产物对其有一定的抑制作用,具有开发成口腔护理产品的潜在价值。4 结论 隐板裸刺蛇尾共附生真菌属于格孢腔菌目真菌和肉座菌目真菌,包括枝顶孢属、T r e m a t o s p h a e r i a属、拟盾壳霉属、格孢腔菌属和丛赤壳属菌株。潜在新菌的数量占已分离菌株的1 8.2%,比例较高。隐板裸刺蛇尾共附生真菌的代谢产物有一定的抗菌活性。本研究进一步丰富了棘皮动物共附生真菌的多样性,完善了棘皮动物门共附生真菌样品库,为隐板094罗志宏,钟雯雯,刘昕明,等.隐板裸刺蛇尾共附生真菌的分离鉴定及其代谢产物的抑菌活性研究裸刺蛇尾共附生真菌次级代谢产物及其生物活性研究提供了菌种来源,有利于海洋药用微生物资源的开发。参考文献1 史博洋,鲁亚莉,潘雅君,等.蛇尾纲生物学研究进展J.琼州学院学报,2 0 1 6,2 3(2):9 2 9 8.2 AN D E R S S ON L,B OHL I N L,I OR I Z Z I M,e t a l.B i o l o g-i c a l a c t i v i t y o f s a p o n i n s a n d s a p o n i n l i k e c o m p o u n d s f r o m s t a r f i s h a n d b r i t t l e s t a r s J.T o x i c o n,1 9 8 9,2 7(2):1 7 9 1 8 8.3 MAN S OUR M P,HO L D S WO R TH D G,F O R B E S S E,e t a l.H i g h c o n t e n t s o f 2 46(n 3)a n d 2 01(n 1 3)f a t t y a c i d s i n t h e b r i t t l e s t a r Am p h i u r a e l a n d i f o r m i s f r o m T a s m a n i a n c o a s t a l s e d i m e n t s J.B i o c h e m i c a l S y s-t e m a t i c s a n d E c o l o g y,2 0 0 5,3 3(7):6 5 9 6 7 4.4 NU Z Z O G,G OME S B A,AMO D E O P,e t a l.I s o l a t i o n o f c h a m i g r e n e s e s q u i t e r p e n e s a n d a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f i s o o b t u s a d i e n e f r o m t h e b r i t t l e s t a r O p h i o n e r e i s r e-t i c u l a t a J.J o u r n a l o f N a t u r a l P r o d u c t s,2 0 1 7,8 0(1 1):3 0 4 9 3 0 5 3.5 甄静荣,丛建森,刘艳萍,等.金氏真蛇尾皂苷的抗氧化和抑菌活性研究J.食品科技,2 0 1 5,4 0(6):2 8 5 2 8 8.6 AM I N I N D L,A G A F ONOVA I G,F E D OR OV S N.B i-o l o g i c a l a c t i v i t y o f d i s u l f a t e d p o l y h y d r o x y s t e r o i d s f r o m t h e