牙龈卟啉单胞菌感染食管癌细胞诱导M2型巨噬细胞极化促进食管癌进展.pdf

780安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：26：22 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1340.013.h t ml牙龈吓单胞菌感染食管癌细胞诱导M2型巨噬细胞 极化促进食管癌进展郭静宜，原 翔J，石林林2,3,张秀森彳，孔金玉2,3,张顶虜詁,高社干2,3摘要目的探讨牙龈吓咻单胞菌（P g）感染食管癌细胞对 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化及其功能变化的影响。方 法采用ELISA方法检测食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系上 清及P g感染的ESCC细胞系上清细胞因子分泌情况;构建 ESCC细胞与巨噬细胞体外共培养模型，采用q P CR、细胞免 疫荧光及流式细胞术方法检测TAMs表面标志的变化情况;采用ELISA方法检测共培养TAMs分泌细胞因子的影响;使 用共培养TAMs的条件培养基（CM）培养ESCC细胞，采用 CCK$、克隆形成实验、划痕实验及Tr a n sw el l实验评估TAMs 对ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果P g感 染的ESCC细胞白细胞介素（IL）$、IL-10表达量升高（P 0.01）；与P g感染的ESCC细胞共培养的TAMs表面CD163 及CD206表达量升高（P 0.001）；P g感染的ESCC细胞共 培养的TAMs分泌细胞因子IL-6.IL-10相对升高（P 0.01）；P g感染的ESCC细胞共培养的TAMs能够增强ESCC 细胞增殖、迁移和侵袭能力（均P 37弋厌 氧培养箱中培养。细菌复苏后传代至第2或第3代 处于对数生长期时，吸取300订菌液于石英比色皿 中,利用紫外分光光度计，检测600 n m下的吸光度,取600 n m下吸光度值在1 2之间的细菌进行梯度 传代或感染细胞。细菌感染:根据600 n m下吸光度 值计算菌液浓度为1 Xl O9 CFU/ml时对应的菌液体 积，吸取相应体积菌液,4咒，12 000 r/min离心10 min,去除培养基，加入1 ml无菌P BS重悬，获得1 Xl O9 CFU/ml P g 菌液。根据感染复数(mu l t ipl ic it y o f in f ec t io n,M0I)=20,即细菌与细胞比例为20：1,吸取相应体积菌液加入细胞培养基，进行细胞感染。1.2.3 ELISA实验按照说明书步骤准备好检测 细胞培养上清液,在包被好抗体的板孔中加入100 M标准品工作液或样本,50 pl抗体，室温孵育2 h；洗板6次，加入100|x l辣根过氧化物酶标记的链霉 亲和素,室温孵育45 min；洗板6次;每孔加入100|1显色底物溶液，室温孵育10 min左右;每孔加入 100|x l终止液;立即在450 n m波长检测吸光度值。1.2.4细胞免疫荧光 将不同条件下处理过的巨 噬细胞消化重悬计数，细胞密度按1 x 103个/孔接 种于玻璃底共聚焦小皿，放入培养箱孵育24 h以 上,4%多聚甲醛室温固定1 h,0.2%Tr it o n X-100透 化5 10 min,5%BSA 封闭 1 h,l%BSA 稀释抗 体，一抗 CD68(1:50)、CD206(l:100)4 戏过夜，P BS洗涤3次，荧光二抗室温避光孵育30 min,P BS 洗涤3次,DAP I核染色,激光共聚焦显微镜拍照。1.2.5 q RT-P CR实验 使用TRIzo l分别提取P g 感染与未感染的KYSE150细胞、P g感染与未感染 的KYSE140细胞、M0细胞、M2细胞、与KYSE150 共培养的TAMs、与P g阳性KYSE150细胞共培养的 TAMs总RNA,测量RNA浓度后将RNA逆转录为 c DNAo 采用 q P CR 方法检测 CD206、CD163 等 mR-NA相对表达量,每组样本重复3次。IL-6上游引物 5，-CCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3,下游引 物 5，-GTCGAGGATGTACCGAATTTGTTTG3；IL-10 上游引物 5，-GTGAAGACTTTCTTr CAAACAAAG-3，,下游引物 5，-CTGCTCCACTGCCTTGCTCTTATT-3，；CD163 上游引物 5-GCAAACTCAGAATGGTGCTAC-ITGA-3,下游引物 5，-CAGTAATGGTGAAGGGACT-CAGGTT-3；CD206 上游引物 5-TTGAATACTGTG-GTGAGCTGAAAGG3,下游引物 5，-GGCAAATC-CAG-TTGTTAAGGTGTTC-3。95 戏 5 min,95 C 10 s,60弋30 s,39个循环。按2认0法计算基因相对 表达水平。1.2.6 流式细胞术 将M0细胞、M2细胞、与KYSE150 共培养的TAMs、与P g阳性感染的KYSE150细胞共 培养的TAMs分别消化下来,P BS洗涤2遍,2 000 r/min离心5 min去上清液,200讪P BS重悬细胞转移 至流式管，一抗 CDl l b-FITC、CD68-BV421、CD206-P E染色,4兀避光孵育30 min,加300以P BS洗涤 782安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)未结合染料,离心去上清液后加入300|x l P BS重悬 细胞上机检测。1.2.7 CCK-8 实验 将 KYSE150 细胞按 1 x 103 个/孔接种于96孔板，每组设置3个复孔，加上与 P g感染或未感染的KYSE150细胞共培养的TAMs 条件培养基以及对照组含血清培养基作为趋化条 件,分别在0、12、24、36、48 h每孔加入10 pl CCK-8 溶液,37七培养箱孵育1 h,使用多功能酶标仪在 450 r u n处检测吸光度值,绘制细胞生长曲线。1.2.8 克隆形成实验 将KYSE150细胞按1x 10?个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁，将培养基更换 为与P g感染或未感染的KYSE150细胞共培养的 TAMs CM,37咒培养箱培养2周，一周2次换液,当 细胞形成肉眼可见的克隆时，吸去培养基,P BS洗涤 3次,4%多聚甲醛固定，结晶紫染色后,P BS洗涤,拍照使用Ima g e J计数细胞克隆数。1.2.9 划痕实验 将KYSE150细胞按4 x 10个/孔接种于底部画好横线的6孔板中，待细胞长至 80%划痕,P BS洗涤漂浮细胞,加上与P g感染或未 感染的KYSE150细胞共培养的TAMs CM,显微镜 拍照0、24 h划痕愈合情况，使用Ima g e J软件测量 不同时间点划痕面积,进行统计。1.2.10 Tr a n sw eU实验 将饥饿过的KYSE150细 胞重悬于无血清培养基接种于Tr a n sw el l小室上室,加上与P g感染或未感染的KYSE150细胞共培养的 TAMs CM为趋化条件,37弋培养箱孵育24 48 h 终止。吸去培养基，用棉签去除未侵袭入膜的细胞,P BS洗涤小室,4%多聚甲醛固定，结晶紫染色后，光 学显微镜下拍照计数细胞量。1.3 统计学处理 采用SP SS 26.0和Gr a pP a d P r ism&0对实验数据进行统计学分析及制图，数据 以$表示,两组数据比较采用独立样本t检验,3 组或以上采用单因素方差分析。P 0.05为差异有 统计学意义。2 结果2.1 IL-6.IL-10在Pg感染的食管癌细胞中的表 达 为观察P g感染对ESCC细胞的影响，通过 ELISA方法检测细胞上清液中IL、IL-10的浓度变 化，利用q RT-P CR方法检测感染与未感染P g的ESCC 细胞IL-6JL-10 mRNA转录水平的变化。q RT-P CR结果显示：P g感染ESCC细胞系后,KYSE140 细胞系IL-6 mRNA表达较未感染组升高(2.46 0.10)(1.69 0.04),P 0.01、KYSE150 细胞系 IL-6 mRNA表达较未感染组升高(3.57 0.04)仍(1.29 0.06),P 0.001、KYSE140 细胞系 IL-10 mRNA表达较未感染组升高(3.34 0.08)”s(2.53 0.05),P 0.01、KYSE150 细胞系 IL-10 mRNA 表达较未感染组升高(2.57 0.04)(1.29 0.06),P 6水平较未感染组升高(1 650.07 31.86)pg/ml 0s(1 150.81 13.46)pg/ml,P 0.001、KYSE150细胞系分泌细胞因子IL-6水平较未感染 组升高(3 001.03 59.81)pg/ml vs(1 313.80 77.85)pg/ml,P 0.001、KYSE140 细胞系分泌的 细胞因子IL-10水平较未感染组升高(2 646.70 16.33)pg/ml vs(1 111.23 32.14)pg/ml,P 0.000 1、KYSE150细胞系分泌的细胞因子IL-10水平较 未感染组升高(2 926.56 57.68)pg/ml”s(1 393.58 35.07)pg/ml,P 0.001(图 1B)O 综上，P g感染ESCC细胞系IL-6JL-10 mRNA转录水平及 ESCC细胞分泌的细胞因子IL-6JL-10水平均有所 升高,差异有统计学意义。2.2 Pg对ESCC细胞调控M2型TAMs极化的影 响2.2.1 流式细胞术检测与P g感染的ESCC细胞共 培养的TAMs表面标记物变化 为观察P g感染与 未感染ESCC细胞CM对TAMs极化的影响,采用流 式细胞术方法检测M0细胞、M2细胞、与KYSE150 共培养的TAMs细胞及与P g感染的KYSE150共培 养的TAMs细胞表面M2型巨噬细胞标记物CD206 的表达水平。流式结果显示:与KYSE150CM组比 较,KYSE150(P g+)CM 组 CD206+TAMs 比例升高，差异有统计学意义(20.90 1.25)%”s(60.97 0.81)%,P 0.000 1。见图 2。2.2.2 q RT-P CR检测P g感染对共培养TAMs表面 标记物表达水平的影响 为观察P g感染与未感染 ESCC细胞CM对TAMs极化的影响，分别提取M0 细胞、M2细胞、与KYSE150共培养的TAMs细胞及 与P g感染的KYSE150共培养的TAMs细胞总 RNA,通过q RT-P CR检测各分组转录因子的表达水 平。q RT-P CR结果显示：P g感染ESCC细胞后,KYSE150(P g+)CM 组 TAMs CD206 mRNA 表达量 比 KYSE150CM 组 CD206 mRNA 表达量高(5.10 0.42)”s(1.60 土0.45),P 0.001,KYSE150(P g+)CM 组 TAMs CD163 mRNA 表达量比 KYSE150CM 组 TAMs CD163 mRNA 表达量高(6.30 0.50)vs安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)783A sir图1 Pg感染对ESCC细胞IL-6.IL-10表达的影响A:q RT-P CR检测ESCC细胞转录因子表达水平变化;B：ELISA法检测ESCC细胞分泌细胞因子浓度变化；a：KYSE140组；b：KYSE140+P g组;c：KYSE150 组；d：KYSE150+P g 组;与 P g 未感染组比较：*P 0.01,*P 0.001,*P 0.000 1b b*o o o o oo o o o o8 6 4 28 6 4 2()ml+90za。61010a a510o o51010 o o o o o O o o o o o O-0 8 6 4 20 8 6 4 2图2流式细胞术检测与Pg感染的ESCC细胞共培养的TAMs CD206比例变化a：MO 组；b：M2 组；c：KYSE150CM 组;d：KYSE150(P g+)CM 组;与 KYSE150CM 组比较:*P 0.000 1(2.35 0.12),P 0.001,差异有统计学意义。见 图3。9 0 s。2 2 O O 8 6 4 2 8 6 4 2 亠B B 1 1S6O图3 qRT-PCR检测与Pg感染的KYSE150细胞共培养的 TAMs CD206 mRNA、CD163 mRNA 表达水平变化A：TAMs CD206 mRNA 相对表达量;B：TAMs CD163 mRNA 相对 表达量;8：皿0组止：血组；0：KYSE150CM 组;d：KYSE150(P g+)CM 组;与 KYSE150C M 组比较：*P 0.0012.2.3 免疫细胞荧光检测与P g感染的ESCC细胞 共培养的巨噬细胞表面标记物变化 为观察P g感 染与未感染ESCC细胞CM对TAMs极化的影响，将 M0细胞、M2细胞、与KYSE150共培养的TAMs细 胞及与P g感染的KYSE150共培养的TAMs细胞,消化重悬接种于共聚焦小皿,激光共聚焦显微镜观 察。结果显示：与KYSE150CM组比较，M0+KYSE150(P g+)CM组,M2型巨噬细胞表面标记物 CD206与巨噬细胞表面标志物CD68共定位增加,即M2型巨噬细胞表面标志物CD206表达升高。见 图4。2.3 Pg感染ESCC细胞细胞对共培养TAMs分 泌IL-6.IL-10水平的影响 采用ELISA方法检测 与KYSE150细胞或P g感染的KYSE150细胞共培 养的TAMs分泌细胞因子水平的变化。结果显示:TAMKYSE150组TAMs分泌IL-6水平较M0组升高(662.78 59.15)pg/ml vs(232.85 19.10)pg/ml,P 0.01 ,TAMKYSE150(P g+)组分泌 IL-6 水 平较TAMKYSE150组进一步升高(1 183.11 44.12)pg/ml vs(662.78 59.15)pg/ml,P 0.01 ；TAMKYSE150 组 TAMs 分泌 IL-10 水平较 M0 组升高(419.61 12.63)pg/ml vs(175.72 6.70)pg/ml,P 0.001,TAMKYSE150(P g+)组分 泌IL-10水平较TAMKYSE150组进一步升高(1 163.64 35.07)pg/ml o s(419.61 12.63)pg/ml,P 0.01o 见图 5。2.4 Pg感染ESCC细胞调控M2型TAMs极化对 ESCC细胞恶性增殖的影响 为观察与P g感染的 ESCC细胞共培养后TAMs对ESCC细胞增殖、迁 移、侵袭能力变化，将ESCC细胞分为3组,对照组 加入MO-CM培养，实验组分别加入TAMKYSE150-CM,TAMKYSE150(P g+)-CM 培养后进行 CCK-8、克隆形成实验、划痕实验及Tr a n sw el l实验。CCK-8 细胞增殖活性实验结果显示：与对照组MO-CM比 较,TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞增殖能力 增强,TAMKYSE150(P g+)-CM 组比 TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞增殖能力进一步增强,差异有 统计学意义(F=108.03,P 0.01),见图6A。克隆 形成实验结果显示：与对照组MO-CM比较，784安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)DAPIC Db8MergeZOOMD21I6a00 20 40 60距离(各像素点)口E0o o o o8 6 4 2CD68250 r 鰹 200-隅 150-S 100 _20 40 60距离(各像素点)一 CD68CD206L ji50-0CD68+CD206 20*bd150理10050图4免疫细胞荧光检测与Pg感染的KYSE150细胞共培养的TAMs CD206表达水平变化x 400a：M0 组；b：M2 组;c：KYSE150CM 组;d：KYSE150(P g+)CM 组o o o15105 亠對盖0 20 40 60距离(各像素点)=CD68 十 CD2060 20 40 60距离(各像素点)A1 00050001 5001 5001 0005000(赛33聲9 9日图5 ELISA法检测Pg感染ESCC细胞对共培养TAMs分泌细胞因子水平的影响A:ELISA法检测共培养TAMs分泌IL-6水平变化;B:EUSA法 检测共培养TAMs分泌IL-10水平变化;a：M0组；b：TAMKYSE150 组;c：TAMKYSE150(P g+)组;与 M0 组比较:*P 0.01/*P 0.001；与 TAMKYSE150 组比较严P0.01TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞增殖能力增 强，TAMKYSE150(P g+)-CM 组比 TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞增殖能力进一步增强,差异有 统计学意义(F=610.18,P 0.05),见图6B。划痕实验结果显示：与对照组M0-CM比较,TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞迁移能力增 强，TAMKYSE150(P g+)-CM 组比 TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞迁移能力进一步增强,差异有 统计学意义(F=3 539.502,P 0.01)。见图 7。Tr a n sw el l实验结果显示：与对照组M0-CM比 较,TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞侵袭能力 增强,TAMKYSE150(P g+)-CM 组比 TAMKYSE150-CM组促进ESCC细胞侵袭能力进一步增强,差异有 统计学意义(F=482.553,P 0.05)。见图8。3讨论食管癌的发病机制复杂,其中微生物感染是主 要高危因素之一。随着细菌调控免疫作用被发现,其对肿瘤免疫影响相关机制的研究得到越来越多的 关注。以微生物为靶点的治疗对食管癌的预防、早期发现与治疗均具有重要意义。研究发现,P g 感染ESCC细胞介导TME中T淋巴细胞免疫抑制,协助ESCC细胞免疫逃逸，从而维持自身定植。巨 噬细胞是TME中数量最多的固有免疫细胞，可以有 效清除病原菌。在此，本研究重点关注P g感染ES-CC细胞对TME中巨噬细胞的影响，进而研究P g对 微环境的改变及其对肿瘤进展的影响。肿瘤发生发展过程中常常伴有感染引起的炎 症，肿瘤细胞分泌相关细胞因子作用于募集的免疫 细胞,改变其细胞形态及功能,从而改变TME,进而安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)785B B图6与Pg感染的ESCC细胞共培养的TAMs对ESCC细胞增殖的影响A：CCK-8法检测TAMs对ESCC细胞增殖的影响;B：克隆形成实验检测TAMs对ESCC细胞增殖的影响;a：M0-CM组;b：TAMKYSE150CM组;c：TAMKYSE150(P g+)-CM 组;与 M0-CM 组比较:*P 0.05,*P 0.01；与 TAMKYSE150-CM 组比较:0.01ba图7与Pg感染的ESCC细胞共培养的TAMs对ESCC细胞迁移的影响x 200a:M0-CM 组;a：TAMKYSE150-CM 组;c：TAMKYSE150(P g+)-CM 组;与 M0-CM 组比较：*P 0.001；与 TAMKYSE150-CM 组比较严 P0.01ab b图8与Pg感染的ESCC细胞共培养的TAMs对ESCC细胞侵袭的影响x 200a:M0-CM 组;b：TAMKYSE150-CM 组;c：TAMKYSE150(P g+)-C M 组；与 M0-CM 组比较:*P 0.01；与 TAMKYSE150-CM 组比较：#P V0.05(V)软舉哩50502 250501A1A000011110000助力肿瘤细胞逃避机体的免疫识别与攻击。在 微环境中不同细胞因子和趋化因子的作用下,TAMs 可极化为不同亚型，从而发挥不同的功能。在TME 中,TAMs向M2型极化是一个多因素、多步骤的复 杂病理过程问。病原菌可以通过调控宿主产生不 同的细胞因子而间接调控巨噬细胞的极化状态，从 而抑制宿主免疫系统，使病原菌得以逃避宿主免疫 系统的防御及杀伤。研究发现结直肠癌细胞分 泌的IL4影响TAMs的M2极化。具核梭杆菌感染 通过TLR4依赖性机制促进巨噬细胞向M2型极 化。本研究通过检测P g感染对ESCC细胞的影 响，发现P g感染促进ESCC细胞中IL-6JL-10的分 泌水平。为了进一步探究P g感染ESCC细胞对 TAMs调控作用，本研究建立P g感染的ESCC细胞 与TAMs共培养模型,证实与P g感染ESCC细胞共 培养的TAMs表面M2型标志物表达量升高,提示 P g可以促进ESCC细胞调控M2型TAMs极化。同 时,P g感染ESCC细胞促进共培养TAMs分泌IL-6、786安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)IL-10水平升高。M2型TAMs通常被认为在肿瘤进展过程中抑 制炎症反应和促进肿瘤免疫逃逸。本研究利用 与P g感染或未感染的ESCC细胞共培养的TAMs CM再去培养ESCC细胞，观察其对肿瘤细胞功能变 化的影响。实验结果表明，被P g感染的ESCC细胞 极化的TAMs,可以进一步促进ESCC细胞的增殖,迁移及侵袭能力。但P g如何通过刺激ESCC上调 IL-6JL-10的分子机制尚不清楚，以及极化后的 TAMs促进ESCC恶性生物学行为的详细机制仍需 一步的研究。综上所述，本研究初步探究了 P g感染ESCC细 胞通过诱导肿瘤细胞分泌IL-6JL-10介导TAMs向 M2型极化，将TAMs重塑为免疫抑制表型，从而促 进食管癌细胞恶性进展，并揭示了 P g对巨噬细胞极 化的调节作用，有助于今后更好的解析EC的微环 境变化，为临床上开展以TAMs为靶点的抗肿瘤免 疫治疗奠定理论基础。参考文献1 Su n g H,Fer l a y J,Sieg el R L,et a l.Gl o ba l c a n c er st a t ist ic s 2020:GLOBOCAN est ima t es o f in c id en c e a n d mo r t a l it y w o r l d w id e f o r 36 c a n c er s in 185 c o u n t r ies J.CA Ca n c er J Cl in,2021,71(3)：209-49.2 Mil l er K D,No g u eir a L,Ma r io t t o A B,e t a l.Ca n c er t r ea t men t a n d su r v iv o r sh ip st a t ist ic s,2019 J.CA Ca n c er J Cl in,2019,69(5):363-85.3 Da r v ea u R P,Ha jish en g a l l is G,Cu r t is M A.P o r ph y r o mo n a s g in g i-v a l is a s a po t en t ia l c o mmu n it y a c t iv ist f o r d isea se 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immu n it y a g a in st P.gingivalis in f ec t io n J.Ca n c er Immu n o l Res,2019,7(9)：1440-56.9 Me Al l ist er F,Ho u ssea u F,Sea r s C L.Mic r o bio t a a n d immu n e r espo n ses in c o l o n c a n c er:mo r e t o l ea m J.Ca n c er J,2014,20(3):232-6.10 Ma n t o v a n i A,So zza n i S,Lo c a t i M,et a l.Ma c r o ph a g e po l a r iza t io n:t u mo r-a sso c ia t ed ma c r o ph a g es a s a pa r a d ig m f o r po l a r ized M2 mo n o n u c l ea r ph a g o c y t es J.Tr en d s Immu n o l,2002,23(11):549-55.11 Lin X,Wa n g S,Su n M,et a l.Co r r ec t io n t o:miR-195-5p/NOCTH2-med ia t ed EMT mo d u l a t es IL-4 sec r et io n in c o l o r ec t a l c a n c er t o a ff ec t M2-l ik e TAM po l a r iza t io n J.J Hema t o l On c o l,2019,12(1):122.12 Ch en T,Li Q,Wu J,et a l.Fu so ba c t er iu m n u c l ea t u m pr o mo t es M2 po l a r iza t io n o f ma c r o ph a g es in t h e mic r o en v ir o n men t o c o l o r ec t a l t u mo u r s via a TLR4-d epen d en t mec h a n ism J.Ca n c er Immu n o l Immu n o t h er,2018,67(10)：1635-46.13 No y R,P o l l a r d J W.Tu mo r-a sso c ia t ed ma c r o ph a g es:f r o m mec h an isms t o t h er a py f J.Immu n it y,2014,41(1)：49-61.Porphyromonas gingivalis infection of esophageal cancer cells induces M2 macrophage polarization and promotes esophageal cancer progressionGu o Jin g y i1,2,Yu a n Xia n g2,3,Sh i Lin l in2,3,Zh a n g Xiu sen3,Ko n g Jin y u2,3,Zh a n g Din g y u 1,2,Ga o Sh eg a n2,3(1 Basic Medical College of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003；2Henan Key Laboratory of Microbiome and Esophageal Cancer Prevention and Treatment,Henan Key Laboratory of Cancer Epigenetics,Luoyang 471003 The First Affiliated Hospital of Henan University cf Science and Technology,Clinical Medicine College of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003)Abstract Obje c t ive To in v est ig a t e t h e ef f ec t o f Porphyromonas gingwallis(P g)in f ec t io n o f eso ph a g ea l c a n c er c el l s o n t h e po l a r iza t io n o f t u mo r a sso c ia t ed ma c r o ph a g es(TAMs)a n d f u n c t io n a l c h a n g es Me t hods Th e sec r et io n o f t u mo r-r el a t ed c y t o k in es in t h e su per n a t a n t o f P g in f ec t ed a n d u n in f ec t ed eso ph a g ea l sq u a mo u s c el l c a r c in o ma(ESCC)c el l s w a s d et ec t ed by ELISA A c o-c u l t u r e mo d el o f ESCC c el l s a n d ma c r o ph a g es in vitro w a s est a bl ish ed,安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)787网络出版时间：2023-04-23 16：07：43 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230423.1046.001.h t mlMBL2作为男性肝癌患者预后标志物的分析与验证王延峰韩嘉奇，张 静1摘要 目的 探究甘露糖结合凝集素2(MBI2)基因表达对 肝细胞癌(HCC)细胞系增殖和预后的影响。方法采用生 物信息学方法分析MBI2在不同性别HCC患者中的表达及 其对HCC患者预后的影响。利用q RT-P CR和West er n bl o t 检测基因的mRNA和蛋白表达水平。MTT实验和细胞克隆 形成实验检测细胞增殖能力;采用流式细胞术检测细胞周期 和细胞凋亡的变化。基因集富集分析(GSEA)筛选MBI2富 集的相关信号通路。结果 生物信息学分析和q RT-P CR结 果显示,MBI2在男性HCC患者中的表达高于女性患者，并 且与HCC患者预后相关;与对照组比较,MBI2过表达后 Hu h 7细胞和MHCC-97H细胞的活力和克隆形成率下降，细 胞周期转化受阻，细胞凋亡数增加;GSEA和West er n bl o t结 果表明,MBL2富集在细胞周期信号通路上，过表达MBI2能 够抑制CDK4蛋白表达，促进P 16和BAX蛋白表达。结论MBL2在HCC组织中表达下调,与男性HCC患者预后相 关，并且参与细胞增殖过程。MBI2可能是男性HCC患者治 疗的潜在靶点。关键词 肝癌;MBI2；预后;增殖;凋亡2023-02-03 接收基金项目：国家自然科学基金(编号=81860444)作者单位J延安大学医学院，延安7160002延安大学附属医院检验科，延安716000作者简介:王延峰,男，主管检验师；张 静，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:y a d x zj y a u.ed u.c n*对本文具有同等贡献中图分类号R 735.7文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0787-07 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.014肝细胞癌(h epa t o c el l u l a r c a r c in o ma,HCC)是原 发性肝癌的主要组织学亚型，原发性肝癌是2020年 全球第六大最常见的癌症和第三大癌症死亡原因，男性的发病率和病死率比女性高2 3倍，且预后较 差。HCC的发生是一个涉及多种风险因素的复 杂过程。慢性肝炎病毒感染、吸烟和过度饮酒是男 性患者常见的危险因素。早期筛査、诊断和治疗 是改善HCC预后的关键。然而，性别相关的诊断、预后标志物的缺乏，高转移和复发率等因素直接降 低了手术切除后HCC患者的生存率一勺。甘露糖 结合凝集素 2(ma n n o se bin d in g l ec t in 2,MBL2)位于 人类10号染色体，在先天免疫系统中起着重要作 用,而在恶性肿瘤中的关键作用是免疫监测,MBI2 基因变异是癌症风险增加的因素之一。目前，在 儿童血液肿瘤中发现,MBI2基因的多态性与中性 粒细胞减少症发生相关o而MBI2在HCC中的 作用尚不清楚。该研究利用生物信息学技术分析 MBI2在不同性别HCC患者中的表达，细胞实验探 究其对HCC细胞增殖的作用，为不同性别HCC患 者个性化治疗提供新的靶点。a n d t h e c h a n g es o f TAMs su r f a c e ma r k er s w er e d et ec t ed by q P CR,c el l u l a r immu n o f l u o r esc en c e a n