猪繁殖与呼吸综合征病毒非结...白7多克隆抗体的制备及鉴定_李华玮.pdf

动物医学进展，（）：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白多克隆抗体的制备及鉴定收稿日期：基金项目：河南省科技研发计划联合基金项目（应用攻关类）（）；河南省科技攻关计划项目（；）；河南牧业经济学院预防兽医重点学科项目（）作者简介：李华玮（），女，河南郑州人，博士，副教授，主要从事动物病毒感染机制及相关诊断试剂研究。通讯作者李华玮，李莎，姬向波，刘昆，杨中元，侯文静，马辉，赵绪永（河南牧业经济学院，河南郑州 ；河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南郑州 ；河南农业大学，河南郑州 ）摘要：制备猪繁殖与呼吸综合征病毒（）非结构蛋白（）的多克隆抗体。根据 上公布的 序列，合成基因后克隆至原核表达载体 ，对重组菌进行诱导，获得表达并纯化 重组蛋白。采用皮下多点注射的方式对新西兰白兔进行免疫接种制备兔多克隆血清，分别使用 、等方法验证该多克隆血清与 以及 重组蛋白的免疫反应性。间接 检测结果显示，制备的多抗血清可以特异性识别原核表达的 ，检测结果证实制备的 多抗能特异性结合 ，结果证实多抗血清能特异性结合 以及纯化的重组蛋白 。以上结果表明，成功制备了 的多克隆抗体。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；非结构蛋白；多克隆抗体中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）猪繁殖与呼吸综合征病毒（，）属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为有囊膜不分节段的单股正链 病毒。感染可造成严重的繁殖障碍，引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，导致仔猪严重的呼吸障碍和免疫抑制。猪是该病毒的唯一天然宿主，该病毒感染后发病快、传染性强，可通过空气、呼吸道、精液、胎盘等进行传播。呈球形至椭圆形，直径大小约 ，囊膜表面具有明显的纤突，负染后在电子显微镜下 呈 卵 圆 形，核 衣 壳 为 面 体 对 称 结 构。基因组全长为 ，包含 个开放阅读框，分 别 为 、。其中占基因组 的 含有个非结构蛋白编码区 和 ，编码至少 个非结构蛋白（，），这些 参与病毒的复制以及调控宿主的抗病毒天然免疫反应。和 分 别 编 码 多 聚 体 蛋 白 和 ，最终裂解为 、和 等个非结构蛋白，主要功能是参与其他 蛋白的加工；蛋白最终裂解为 ，主要功能是参与病毒的转录和复制。而 编码个结构蛋白，分别为 、。结构蛋白是病毒粒子的构成成分，能作为病毒抗原物质刺激宿主产生免疫应答。是 非结构蛋白中较为保守的一个，其分子质量大小约 ，型 由 个氨基酸组成，型 由 个碱基编码的 个氨基酸组成。在蛋白水解酶的作用下可从多聚蛋白 中裂解出，蛋白酶通过内部切割位点，将 进一步切割成 和 两部分。结构的核磁共振分析表明，该蛋白具有个螺旋和个折叠，端带有 、三个螺旋束。通过反向遗传学研究表明，缺失会导致病毒蛋白包装的失败。对干扰素和白细胞介素的产生具有抑制作用，可以通过抑制 启动子的活性下调干扰素 刺 激 基 因（，）、和 基 因 的 表 达，从 而 抑 制 的抗病毒作用，导致机体的天然免疫应答被抑制，帮助 实现免疫逃逸。DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.003同一基因型 蛋白的同源性较高，型 具有 的同源性，型 具有 的同源性，型和型 蛋白之间只有 的氨基酸同源性。具有较强的免疫反应性，可以与 阳性血清发生强烈反应，在鉴别 型和型血清抗体方面表现出良好的敏感性和特异性，因此 可用于 血清学的鉴别诊断。目前，市场上尚无商品化的 抗体，本研究利用原核表达系统表达 重组蛋白，免疫新西兰 白 兔 后 制 备 抗 多 克 隆 抗 体，可 以 用 于 检测试剂盒的研发，也为 功能的研究提供有价值的实验材料。材料与方法材料病毒、菌株和实验动物 毒株（型），河南农科院动物免疫学重点实验室分离并惠赠（登录号为 ）；以及 感受态细胞，公司产品；原核表达载体 ，河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室保存；新西兰白兔，购自郑州大学实验动物中心。主要试剂感受态细胞 及 、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，宝生物工程有限公司产品；蛋白质量标准品，美国 公司产品；介质、镍填料，公司产品；胎牛血清，公司产品；培养基、卡那霉素、标记的羊抗兔 ，索莱宝生物科技有限公司产品；标记羊抗兔 ，公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，公司产品；限制性内切酶 和 、连接酶，公司产品；超敏发光液，上海碧云天生物公司产品；、，均为国产分析纯试剂。主要仪器设备紫外可见光分光光度计，上海奥普勒仪器有限公司产品；旋转混合器，上海苑胜仪器设备有限公司产品；高速离心机，日立公司产品；恒温振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；酶标仪（），美国热电雷勃公司产品；电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；转膜仪，公司产品；凝胶成像仪，上海天能公司产品；超净工作台，苏州安泰公司产品；二氧化碳培养箱，赛默飞公司产品；恒温培养箱，美国 公司产品；倒置荧光显微镜，奥林巴斯公司产品。方法 基因合成及克隆根据 （）发布的基因序列合成 基因，在合成时两端加入 （）和 （）酶切位点。用限制性内切酶 和 分别对 和合成的 基因序列进行双酶切（于 水浴过夜），随后进行核酸电泳，使用胶回收试剂盒对目的条带进行回收。纯化后的酶切产物用 连接酶于 连接过夜，连接产物转化大肠埃希氏菌 感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性的 平板，倒置培养过夜。挑取单克隆，接种于卡那霉素抗性的 液体培养基中，在、条件下振荡培养过夜，提取重组质粒进行测序和酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为 。重组蛋白的诱导表达将重组质粒 转化至 感受态细胞，转化后的阳性克隆继续在、条件下振荡培养，加入浓度为 的 ，、摇床培养，诱导蛋白表达；离心收集菌体，用 的破菌缓冲液（，）重新悬浮，进 行超声破碎处理（，超声，间隙，次），离心后分别收集沉淀和上清进行 检测，确定重组蛋白的表达情况。重组蛋白的纯化取离心后的上清液，加样于 预 先 使 用 倍 柱 体 积 平 衡 缓 冲 液（、碱 、咪唑，溶解于 的双蒸水中，调节至，双蒸水定容至）平衡后的镍纯化柱；完成样品上样后，使用洗涤缓冲液（、碱 、咪唑，溶解于 的双蒸水中，调节 至，双蒸水定容至）冲洗纯化柱 个柱体积，洗涤去除杂蛋白；之后 使 用 含 不 同 咪 唑 浓 度 的 洗 脱 缓 冲 液（、碱 、咪唑 ，溶解于 的双蒸水中，调节 至，用双蒸水定容到）各洗柱个柱体积；将收集的洗脱缓冲液放入透析袋中透析以去除咪唑；将透析后的洗脱缓冲液进行 检测，最终目标蛋白混合在一起得到重组蛋白 。多克隆抗体的制备选取只 体型相似健康的新西兰白兔，进行编号并饲养观察周无异常后，对其中只进行免疫，另只作为空白对照。首次免疫时，取纯化抗原（蛋白含量为）与弗氏完全佐剂充分混合乳化；动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）分别取的乳化抗原液免疫只新西兰白兔，免疫方法为颈背部皮下多点注射；后进行第二次免疫，取纯化抗原与不完全弗氏佐剂等体积充分混合乳化，分别取 的乳化抗原液免疫只新西兰白兔，免疫方法为颈背部皮下多点注射；后进行第三次免疫，方法和剂量同二免；后进行第四次免疫，方法和剂量同二免；后将新西兰白兔颈动脉放血处死；将采集到的兔血保持过夜后，离心 收集血清。多克隆抗体的纯化血清经 滤膜过滤后，与等体积 的 混合，调节 至，以便达到更好的挂柱效果；使用 倍柱体积的 （）平衡 柱后，加入多抗血清，收集流穿液（流穿液中含有暂时未挂柱的蛋白，收集起来再次纯化）；使用 倍柱体积的 （）洗涤 柱，之后加入倍柱体积的 的甘氨酸溶液（）。依次收集的洗脱液于预先加入 溶液（）的收集管中进行中和反应，使用 倍柱体积的 （）平衡 柱，之后加入倍柱体积的 乙 醇，对 柱床 进 行封闭 保 存；使 用 仪于 处对收集的洗脱液进行检测，合并吸光值大于的洗脱液，并使用 对洗脱液于透析过夜，得到所需的多克隆抗体备用。检测使用 溶液（的 溶液）将纯化的 重组蛋白稀释至，加入酶标板中，每孔 ，包被过夜；次日弃去包被液，使用 洗涤板孔次后，每孔加入 的封闭液（含 脱脂奶粉的 ），封 闭；弃 去 封 闭 液，使 用 洗涤次，将纯化的多克隆抗体依次以 、稀释后，每孔 加入酶标板，孵育；洗涤次；使用封闭液将 标记的羊抗兔 按 稀释，每孔 加入酶标板，孵育 ；洗涤次，每孔加入 底物溶液，避光作用 ；每孔加入 终止显色反应，使用酶标仪检测 波长吸光值。检 测将 生 长 状 态 良 好 的 细胞接种孔板，细胞长至底面积 以上时按 接种 ，后收获细胞样品。感染细胞样品以及纯化的 重组蛋白加入 ，在沸水中煮 后进行 ，并将蛋白转印至 的 膜，用 的脱脂奶粉在常温条件下封闭，然后用 稀释的 多抗血清在 条件下孵育，以未感染的细胞孔以及非免疫兔的血清作为对照。洗涤后加入 标记的山羊抗兔 抗体孵育，用 超敏发光液进行检测。检测用 株感染 细胞，同时设置未感染的板孔作为空白对照，分别在感染、后收获细胞样品，用 轻轻洗涤细胞后，用预冷的甲醇固定细胞样品 ，脱脂奶于 封闭 ，之后用 多抗血清（稀释）在 孵育细胞，轻轻洗涤细胞遍后，使用 标记山羊抗兔二抗 避光孵育，检测细胞的感染情况，细胞核用，（）染色，荧光图片用奥林巴斯荧光显微镜 进行拍摄。结果原核表达载体 的构建及鉴定根据 基 因 组（）基因的序列由上海碧云天生物技术有限公司合成并测序。取构建成功的原核表达载体 ，用限制性内切酶 和 进行双酶切鉴定，结果见图。电泳结果显示，目的基因条带大小约 ，载体条带大小 ，与预期片段大小相符。标准 ；质粒；双酶切的 ；图重组质粒的双酶切结果 重组蛋白诱导表达对 重组菌进行 诱导表达，后收集菌体，对超声破碎后的菌体进李华玮等：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白多克隆抗体的制备及鉴定行 检测，结果显示在 附近有一条带与目的条带大小相符，且 鉴定结果显示超声上清液和沉淀中均有目的蛋白，说明 重组蛋白以可溶性和包涵体形式均有表达（图）。蛋白分子质量标准；总菌体裂解液（未诱导）；总菌体裂解液（诱导）；超声上清；超声沉淀 ；（）；（）；图 验证 蛋白的表达 重组蛋白纯化将 经过 诱导表达后进行超声破碎，离 心 后 收 集 超 声 上 清 液，使 用 镍 柱 进 行 重组蛋白的纯化，对经过、咪唑 缓 冲 液 洗 脱 的 蛋 白 样 品 进 行 鉴定，结果显示 咪唑均可洗脱获得 ，咪唑获得蛋白浓度和纯度最高。将纯度较高的 蛋白溶液合并，超滤浓缩后用作 试验的包被抗原（图）。检测以诱 导 表 达 纯 化 后 的 目 的 蛋 白 作 为 检测的包被抗原，以的抗原包被浓度分别与 、稀释后的新西兰白兔阳性血清中的多克隆抗体进行反应，结果显示，试验获得的多克隆抗体与 蛋白具有良好的免疫反应，依据 检测 大于为判定标准，该方法能够检测到 多抗血清的最大稀释度为 （表）。检测 感染 后收取的细胞样本进行 检测，以未感染的细胞作为对照，使用 多抗血清作为一抗，标记的山羊抗兔的单抗为二抗，结果显示出特异性反应条带，证明制备的多克隆抗体能够特异性结合 蛋白，具有良好的免疫反应性（图）。蛋白分子质量标准；流穿液；、咪唑缓冲液洗脱 ；，图 鉴定纯化后的 表免疫学活性检测 血清稀释比例 阴性血清 阳性血清 阴性对照 未感染细胞，感染的细胞 ，图 多克隆抗体 检测结果 检测结果 验证制备的 多抗血清对 的特异性结合情况，发现在 感染细胞后 有荧光信号出现，荧光信号显著增强，未接毒的对照组细胞未呈现任何荧光信号，这说明制备的 多抗血清具有良好的免疫反应性。使动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）用 对细胞核染色，发现 感染后细胞数量略有减少，这可能与病毒感染后宿主细胞的崩解死亡相关（图）。图 检测 多抗血清与 的特异性结合（）（）讨论猪繁 殖 与 呼 吸 综 合 征（，）于 首次在美国发现，年被命名为 ，年郭宝清等 学者首次在中国发现该病。猪是该 的唯一宿主，该病毒可通过飞沫等进行水平传播，还可通过胎盘进行垂直传播，传染性极强、发病迅速，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。一直以来疫苗免疫是防控 最有效的方法，但该病毒具有高度变异性，导致新的流行毒株不断出现，灭活疫苗不能提供足够的免疫防护，弱毒疫苗又存在毒力返强的可能，现有商用疫苗已不能为猪群提供足够的免疫保护。目前 对全球养猪业的危害仍然大，病毒抗体的血清学检测是一种标准的诊断和监测方法，正确诊断对于防控 有重要意义，目前常用的血清学检测方法有间接荧光试验（）、免疫过氧化物 酶 单 层 试 验（）、酶 联 免 疫 吸 附 试 验（）、免疫层析试纸检测。基于抗原 蛋白的 试剂盒已广泛应用于监测猪群 感染以及疫苗免疫后产生抗体的情况，虽然 蛋白高度保守且具有较强的免疫原性，但以 蛋白为靶标的 试剂盒约存在 假阳性率。重组蛋白的表达存在两种形式，一种是具有生物学活性的可溶性表达，另一种是无生物学活性的包涵体形式。可以可溶性形式表达，猪在感染 后约 就产生针对 的高水平抗体，该抗体在猪体内可以持续存在 。因此，可以作为检测 的合适靶标蛋白。等 通过表达 重组蛋白，经过亲和层析和分子筛层析两步纯化得到的单体作为金标抗原制备 抗体检测试纸，该试纸具有良好的敏感性和特异性。以型（）和型（）两种不同的病毒形式存在，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（）于 年在中国首次出现，与经典毒株相比 具有更强的致病性，给养猪业带来了更为巨大的经济损失。我国主要流行毒株属 （和 样毒株），近年来陆续出现 。建立能特异性区分不同类型 的方法对于 的防控具有一定的意义。同型 之间氨基酸序列相似度极高，型和型 蛋白之间只具有 的氨基酸同源性，以 作为包被抗原可以建立区分不同基因型 的 试剂盒。本研究成功获得了高效可溶性表达的 重组蛋白，该蛋白通过亲和层析和分子筛层析纯化后对新西兰白兔进行免疫注射获得多克隆抗体，使用 稀释的抗原包被浓度，通过 验证了获得的 多抗血清具有良好免疫反应性，能够检测到 蛋白的最大稀释度为 。用 和 证实制备的多克隆抗体与 也有良好的免疫学活李华玮等：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白多克隆抗体的制备及鉴定性。本研究成功制备了高效价的 多抗血 清，这 为 的 功 能 研 究 以 及 检测试剂的研发提供了实验材料。参考文献：，（）（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，：，（）：，（），：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）动物医学进展，（）：致牛腹泻种细菌多重荧光定量 检测方法的建立及应用高睿，徐伟，罗艳，谢晓刚，李梦磊，张琪，许信刚（杨凌职业技术学院动物工程学院动物疫病防控陕西省高校工程研究中心，陕西杨凌 ；陕西省彬州市动物疫控中心，陕西彬州 ；西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 ）摘要：随着规模化和集约化养牛业的不断发展，多种致病菌混合感染造成牛腹泻严重制约了养牛业的快速发展，对腹泻病原进行快速准确鉴别诊断对疫病防控至关重要。根据沙门氏菌的 基因、大肠埃希氏菌的 基因、产气荚膜梭菌的 基因以及志贺氏菌的 基因的保守区域建立了可同时检测这种细菌的多重荧光定量 检测方法，并对其特异性、灵敏性和重复性进行了研究。结果显示，建立的标准曲线线性关系良好；优化后的检测方法仅可特异性扩增出种目标细菌；对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和产气荚膜梭菌的最低检出限分别为 、和 ，该方法的灵敏性高于普通单项 检测方法 倍；批内、批间差异均小于。用此方法检测人工感染病料，每份病料均检测出对应攻毒细菌的荧光信号。以上结果表明，所建立的多重荧光定量 方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于致牛腹泻细菌的实验室检测。关键词：大肠埃希氏菌；沙门氏菌；志贺氏菌；产气荚膜梭菌；多重荧光定量 中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）大肠埃希氏菌（.）、沙门氏菌（）、志贺氏菌（）和产气荚膜梭菌（.）收稿日期：基金项目：陕西省重点研发计划项目（）作者简介：高睿（），女，陕西长安人，硕士，副教授，主要从事分子病原学研究。通讯作者 ，（.，；.，；.，）：（）（），：；