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第 36 卷第 3 期2023 年 6 月华 夏 医 学Acta Medicinae SinicaVol.36 No.3Jun.2023DOI:10.19296/ki.1008-2409.2023-03-005论 著ORIGINAL ARTICLE脱钙液的组分与处理时间对骨髓活检组织 HE 和免疫组化染色的影响伍爱华,郑锦花,张英展,阳玉中,郑 翔(桂林医学院附属医院病理科,广西 桂林 541000)摘要 目的:探讨不同组分的脱钙液及脱钙时间对骨髓活检组织 HE 染色和免疫组化染色效果的影响。方法:收集 36 例骨髓活检穿刺组织,分为 10%硝酸甲醛液(A 液)、10%盐酸甲醛液(B 液)和30%甲酸甲醛液(C 液)3 组,每组 12 例,分别观察各组的脱钙时间。另收集 5 例骨髓活检穿刺组织,将同一例标本分成两份,观察不同组分的脱钙液和脱钙处理时间对 HE 染色和免疫组化染色效果的影响。结果:A 液、B 液的脱钙时间比 C 液短;3 种方法的 HE 染色效果均较好;而 C 液脱钙 2 h的 Ki67 免疫组化染色效果好,但其他方法的 Ki67 免疫组化染色效果欠佳。结论:采用 30%甲酸甲醛液处理 2 h 的脱钙法,实验操作简便,HE 染色和免疫组化染色效果较为满意。关键词:骨髓活检;脱钙液;HE 染色;免疫组化染色中图分类号:R446.8 文献标志码:A 文章编号:1008-2409(2023)03-0025-05Effects of different decalcification solutions and treatment time on HE andimmunohistochemical staining of bone marrow biopsy tissuesWU Aihua,ZHENG Jinhua,ZHANG Yingzhan,YANG Yuzhong,ZHENG Xiang(Dept.of Pathology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541000,China)AbstractObjective:To investigate the effects of different components of decalcification solutions anddecalcification time on HE and immunohistochemical staining of bone marrow biopsy tissues.Methods:36cases of bone marrow biopsies were collected,which were divided into three groups,with 12 cases in eachgroup.Decalcification time of 10%nitric acid formaldehyde solution(solution A),10%hydrochloric acidformaldehyde solution(solution B)and 30%formic acid formaldehyde solution(solution C)was observedrespectively.Another five bone marrow biopsies were collected and the same sample was divided into twoparts,whoseeffectsofdifferentdecalcificationsolutionsanddecalcificationtimeonHEandimmunohistochemical staining were observed.Results:The decalcification time of solution A and solution Bwas shorter than that of solution C.The HE staining effects decalcified by all methods were good.The Ki67immunohistochemical staining effect was even better when the sample was decalcified with the 30%formic52基金项目:广西自然科学基金项目(2020GXNSFBA297082);广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2020KY12017)。第一作者简介:伍爱华,本科,主管技师,研究方向为病理学技术。通信作者:郑翔,E-mail:xiangzheng12 。第 3 期华 夏 医 学第 36 卷acid formaldehyde solution for 2 h.And the Ki67 immunohistochemical staining effects decalcified by othermethods were not good enough.Conclusion:Decalcification with 30%formic acid formaldehyde solutionfor 2 h is simple and convenient,and the effects of HE and immunohistochemical staining are satisfactory.Keywords:bone marrow biopsy;decalcification solution;HE staining;immunohistochemical staining 近年来,随着骨病理学、血液病理学的快速发展,临床上有关骨组织和骨髓组织的病理活检呈现增多的趋势,并具有重要的应用价值1-2。骨髓组织因含有钙质,结构质地较硬,需要进行脱钙处理,使组织软化,便于制片和观察。脱钙是制作骨髓组织切片的重要步骤,选择一种合适的脱钙方法对制作优良的骨髓组织切片并进行进一步的免疫组化染色尤为关键。本研究比较了三种混合脱钙液的脱钙时间,对比了不同作用时间对 HE 染色和免疫组化染色的影响,为临床选择合适的脱钙方法、制作优质切片、缩短含骨组织标本的病理诊断周期提供参考。1 材料与方法1.1 材料选取桂林医学院附属医院的骨髓活检标本作为研究对象,标本经过取材和固定 6 h,待脱钙处理。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。1.2 主要仪器和试剂全自动组织脱水机(深圳达科为医疗科技有限公司,HP300),包埋机(美国 Thermo 公司,Histostar),切片机(德国 Leica 公司,RM2235),全自动免疫组化染色机(德国 Leica 公司,bond),全自动染色机(深圳达科为医疗科技有限公司,DP260),自动封片机(宁波察微生物科技有限公司,cw-400);4%中性甲醛(固定液江西南昌雨露实验器材有限公司),甲酸、硝酸、盐酸、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯(四川西陇科学有限公司),Ki67(福州迈新生物技术开发有限公司),苏木素、伊红(河南赛诺特生物技术有限公司)。1.3 脱钙液制备A 液:浓硝酸 10 ml,加入 90 ml 4%中性甲醛固定液,制成 10%硝酸甲醛脱钙液;B 液:浓盐酸10 ml,加入 90 ml 4%中性甲醛固定液,制成 10%盐酸甲醛脱钙液;C 液:浓甲酸 30 ml,加入 70 ml 4%中性甲醛固定液,制成 30%甲酸甲醛脱钙液。1.4 方法1.4.1 脱钙方法 收集 36 例骨髓活检穿刺组织,分为3 组,每组12 例,分别使用 A 液、B 液、C 液进行脱钙,记录脱钙时间。密切观察 A 液、B 液、C 液的脱钙时间,当组织块浮于液面,用手捏柔软富有弹性代表脱钙完全,记录时间。另收集 5 例骨髓活检穿刺组织,将同一例标本分成两份,每份成分相当,一份使用 C 液脱钙 2 h,另一份使用其他方法进行脱钙,其他脱钙方法包括 A 液脱钙 1 h,A 液脱钙 2 h,B 液脱钙1 h,B 液脱钙2 h,C 液脱钙4 h,用于后续的 HE染色和免疫组化染色。1.4.2 脱钙后处理 脱钙后流水冲洗 0.5 h,常规脱水、包埋、切片、HE 染色和免疫组化染色。1.4.3HE 染色将玻片插入染色架,放入 DP260自动染色机中进行染色。染色步骤:常规脱蜡至水,苏木素染色 10 min,流水冲洗,1%盐酸乙醇分化液分化 6 s,流水返蓝 2 min,伊红染色 25 s,流水冲洗,脱水、透明、封固。1.4.4免疫组化染色将已烤好的玻片放入 LeicaBond全自动免疫组化染色机,添加相应抗体及辅助试剂。染色步骤:脱蜡液脱蜡水化 5 min,专用碱性修复液修复 20 min,H2O2处理 5 min,一抗孵育30 min,二抗增强剂孵育 20 min,二抗孵育 20 min,DAB 显色 6 min,苏木素染色 2 min,蒸馏水冲洗,脱水、透明、封固。1.5 统计学方法采用 SPSS 16.0 统计学软件分析数据,计量资料以(xs)表示,采用 t 检验。P0.05);与 C 液比较,A 液和 B 液的脱钙时间都显著小于 C 液(P0.05),见图 1。62第 3 期伍爱华等:脱钙液的组分与处理时间对骨髓活检组织 HE 和免疫组化染色的影响第 36 卷与 C 液比较,P0.05图 1 A 液、B 液、C 液的脱钙时间2.2 HE 染色5 例病例的骨髓活检组织分别经 A 液、B 液、C液不同时长脱钙处理后进行 HE 染色。不同的脱钙方法处理后的切片质量均较好,切片厚薄均一,无裂隙、皱褶等情况。HE 染色苏木素和伊红颜色鲜艳,细胞核与细胞质染色对比清晰,透光度良好,细胞饱满,见图 2。A.A 液脱钙 1 h;B.A 液脱钙 2 h;C.B 液脱钙 1 h;D.B 液脱钙 2 h;E.C 液脱钙 4 h;F-J.C 液脱钙 2 h图 2 不同脱钙液脱钙后的 HE 染色结果图(200)2.3 Ki67 免疫组化染色5 例病例的骨髓活检组织脱钙后的 Ki67 免疫组化染色结果显示,与 C 液脱钙 2 h 后进行免疫组化Ki67 染色效果比较,A 液脱钙 1 h、A 液脱钙 2 h、B液脱钙 1 h、B 液脱钙 2 h 以及 C 液脱钙 4 h 的染色效果较差,细胞核着色强弱不等,Ki67 阳性细胞率较低,见图 3A-E。C 液脱钙 2 h 中细胞核的着色均一、颜色饱满,呈弥漫强阳性(棕褐色),Ki67 阳性细胞率较高,见图 3F-J。A.A 液脱钙 1 h;B.A 液脱钙 2 h;C.B 液脱钙 1 h;D.B 液脱钙 2 h;E.C 液脱钙 4 h;F-J.C 液脱钙 2 h图 3 不同脱钙液脱钙后的 Ki67 免疫组化染色结果图(200)72第 3 期华 夏 医 学第 36 卷3 讨论造血系统疾病是临床常见的一类疾病,骨髓活检常用于造血系统疾病的诊断3-5。随着血液病理学的快速发展,骨髓活检的需求也逐渐增多。骨髓活检组织因含有大量的钙质,需进行脱钙处理,溶解钙盐,使组织变软,便于切片、HE 染色、免疫组化染色等检测。对骨髓组织进行脱钙处理是制片过程中的重要环节。脱钙不完全和脱钙过度都将对病理诊断造成不利影响。脱钙不完全,会造成切片刀刃的损坏和组织脱片等现象的出现。脱钙过度则会破坏组织结构,影响染色效果或使组织抗原丢失,影响病理诊断结果6-7。因此,研究并选择合适的脱钙方法,既保证脱钙效果,又不影响后续的 HE 染色和免疫组化染色对骨髓活检组织的病理诊断尤为重要。骨髓组织的脱钙方法总体上可分为酸类脱钙法、离子交换树脂脱钙法、螯合剂脱钙法等8-10。单纯强无机酸脱钙液具有脱钙速度快的优点,但强酸对组织的破坏能力很大,极大影响了后续的 HE 染色和免疫组化染色。螯合剂脱钙法常使用 EDTA 脱钙液,尽管 EDTA 是一种优良的脱钙螯合剂,具有脱钙时对组织破坏极小等优点,但存在脱钙时间较长的缺点7-8,11-12。有研究探讨了改良 EDTA 脱钙液和混合酸脱钙液(4%中性甲醛固定液500 ml,95%乙醇500 ml,甲酸 200 ml,浓盐酸 150 ml)在骨髓活检组织中的染色效果,改良 EDTA 脱钙液的脱钙时间为 2024 h,混合酸脱钙液的脱钙时间为 34 h。二者 HE 染色效果均明显优于不脱钙的骨髓,改良 EDTA 脱钙液CD56、Kappa、Ki67、Lambda 和 MPO 免疫组化表达强度明显高于混合酸脱钙液13。本研究观察了 10%硝酸甲醛脱钙液、10%盐酸甲醛脱钙液和 30%甲酸甲醛脱钙液对骨髓组织的脱钙效果,尽管 30%甲酸甲醛脱钙液的脱钙时间长于另外两种,但2 h 左右的脱钙时间已可以满足当前临床病理检验的需求。本研究将同一标本分为两份,每份组分相当,分别对比了 30%甲酸甲醛脱钙液作用 2 h 以及另外五种脱钙条件的 HE 染色和免疫组化染色结果,最大程度上排除因标本组成的差异带来的脱钙效果差异的影响,且便于对 Ki67 免疫组化结果判读比较。10%硝酸甲醛脱钙液处理 1 h,尽管 HE 的染色效果理想,但免疫组化 Ki67 染色透亮度和清晰度欠佳,且与30%甲酸甲醛脱钙液作用 2 h 相比,Ki67 热点区的阳性细胞占比明显降低,这种情况在其他条件处理时也同样存在。因此,30%甲酸甲醛脱钙液脱钙处理 2 h,该方法所制成的石蜡切片质量高、HE 染色和免疫组化染色效果较为满意。脱钙条件对免疫组化染色的影响较大,选择合适的脱钙方法在满足 HE 染色的前提下,最大程度保存抗原等生物化学成分以进行免疫组化等后续检测,并缩短报告发放周期是临床病理科工作中处理骨髓组织等标本的追求。本研究发现脱钙条件的不同会对免疫组化的结果造成影响,可能会导致检测结果偏离真实值,直接影响到病理诊断的结果,这是病理科工作需要注意的。综上所述,在骨髓组织活检中,采用 30%甲酸甲醛脱钙液脱钙 2 h,具有操作简单、脱钙效果好、对细胞形态和抗原影响小、试剂便于采购和制备等优点,可满足目前病理科的临床工作需求。参考文献:1 杨雯雯,查艳芳,毛菊,等.流式细胞术和病理骨髓活检在非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯的诊断价值比较J.蚌埠医学院学报,2022,47(2):227-230.2 袁晓婧,王勇强,朱晨雨,等.骨髓活检联合基因检测在血液病诊疗中的应用价值J.医学食疗与健康,2021,19(14):159-160.3 陈敏,刘勇,LAURENT C,等.骨髓活检标本中经典型霍奇金淋巴瘤的诊断J.临床与实验病理学杂志,2021,37(4):493.4 周华,林雪峰.骨髓活检、涂片对儿童血液疾病鉴别诊断的价值分析J.中外医疗,2021,40(7):34-37.5 GARCIA-MANERO G,CHIEN K S,MONTALBAN-BRA-VOG.Myelodysplastic syndromes:2021 update on diagno-sis,risk stratification and managementJ.Am J Hematol,2020,95(11):1399-1420.6 方捷迪,王晓星,李争艳,等.骨组织脱钙方法探讨J.检验医学与临床,2018,15(5):670-672.7 罗灿峤,莫木琼,钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用J.中国实用医药,2011,6(19):27-28.8 施栋梁,胡晓梅,郑宇辉,等.盐酸脱钙液后脱钙在骨髓组织活检中的应用及体会J.临床与实验病理学杂志,2020,36(4):483-485.82第 3 期伍爱华等:脱钙液的组分与处理时间对骨髓活检组织 HE 和免疫组化染色的影响第 36 卷9 沈吟芳,王谦,郭凌川.石蜡包埋中骨髓标准化脱钙的应用J.临床与实验病理学杂志,2021,37(7):867-868.10 王德田,董建强.实用现代病理学技术M.北京:中国协和医科大学出版社,2012:197-201.11 翁丹枫,傅晓丹,陈淑惠,等.EDTA 脱钙在骨组织大切片制片中的应用效果J.临床与实验病理学杂志,2021,37(3):350-352.12 CORNELISON J B,ISAAC C V,DEVOTA C J,et al.Acomparison of three 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