小麦 Tappc3A 基因克隆及功能预测.pdf

华北农学报():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()四川省自然科学基金()四川省科学技术厅重大科技专项子课题()作者简介:向桂丽()女四川安岳人在读硕士主要从事小麦花发育研究通信作者:杨在君()男四川仪陇人教授博士主要从事小麦遗传育种研究小麦 基因克隆及功能预测向桂丽乌日娜 吴一超蒋 进廖明莉魏淑红彭正松杨在君(.西华师范大学 生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室四川 南充.西华师范大学 环境科学与工程学院四川 南充.南充市农业科学研究院四川 南充.西昌学院 农业科学学院四川 西昌)摘要:可催化磷酸烯醇式丙酮酸()生成草酰乙酸()进入三羧酸循环对植物的生长发育和逆境适应发挥重要作用 但目前尚无关于 参与植物器官发育的报道 发掘并研究小麦 在花发育中的生物学功能为探究小麦雄蕊同源转化为雌蕊性状的分子机制提供新的线索 通过 技术从 和 中克隆 基因使用生物信息学工具分析基因序列及系统进化关系利用 技术分析 在小麦幼穗不同发育阶段和不同生殖器官中的表达水平通过原核表达分析 基因编码的蛋白功能是否正常利用小麦数据库分析 与其他调控花器官发育基因之间的共表达情况 基因的 长 编码 个氨基酸残基具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶()保守结构域 端具有保守的丝氨酸()可逆磷酸化位点()端具有植物型 蛋白特征序列()第 位氨基酸为 植物 典型的丙氨酸 聚类分析也表明 属于 型 家族 分析表明在小麦幼穗发育的 个阶段二棱期至小花分化期和药隔时期 中的 基因的表达量高于 且 在雌蕊()和雌蕊化雄蕊()中的表达量显著高于雄蕊()原核表达结果显示 基因编码的蛋白能催化 生成 并且在 诱导后活性明显增强 基因共表达分析显示 可能参与了小麦花器官的形态发生 小麦 可能参与小麦雌蕊发育其在雄蕊中的过量表达可能与雄蕊同源转化为雌蕊性状形成有一定的关联关键词:小麦 基因基因表达雌蕊发育中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):()()().期向桂丽等:小麦 基因克隆及功能预测 .()()()().()()().:小麦(.)是典型的 植物也是世界绝大多数地区的主要粮食作物之一 在过去的几十年里以半矮秆小麦育种为代表的“绿色革命”使小麦的产量大幅度提高在很大程度上保障了过去几十年全世界的粮食安全 但由于人口的迅速增加以及生物和非生物胁迫等因素的影响到 年小麦产量仍需每年增加.左右方可满足全球的需求 因此提高小麦的单产水平仍然是小麦育种的根本目标 与其他谷类作物一样小麦花器官的发育直接影响其产量而花器官异常可以为改良小麦产量提供独特的遗传资源 三雌蕊小麦()具有 个正常的雄蕊和 个可育的雌蕊能结 颗种子具有显著的穗粒数优势 从 与中国春()的杂交后代中筛选出的雄蕊同源转化为雌蕊突变体()除具有三雌蕊性状外其雄蕊全部或部分同源转化为雌蕊自然结实率仅为 左右而正常雌蕊和完全转化的雌蕊发育正常一朵小花中可结 粒种子 因此 和 在提高小麦产量和创制杂交小麦中具有较大的潜力磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(.)催化磷酸烯醇式丙酮酸()发生不可逆的 羧基化反应生成草酰乙酸()和无机磷酸()在植物、藻类和细菌中广泛存在但在动物和真菌中缺失 在植物中 起着变构酶的作用并被 蛋白激酶磷酸化 在 植物和景天酸代谢途径()的植物中 得到了广泛而深入的研究因为在光合作用中它是催化大气中 固定初始反应的关键酶 在非光合细胞和 植物中 也发挥着重要作用例如:补充由脂质合成、生物合成和氮同化等过程消耗的三羧酸循环()中间体参与果实成熟、种子形成和发芽等生物过程 该酶还在保卫细胞的气孔开放 和 固 氮 豆 科 植 物 的 根 瘤 中 发 挥 特 殊 作用 基因组分析表明 植物中包含一个小的 家族主要由植物型()和细菌型 ()种 类 型 组 成 与 植 物 型 不同细菌型 在其 端不存在丝氨酸磷酸化结构域 植物在低 浓度、高温、强光和干旱胁迫条件下具有更高的光合作用水平、水和氮的利用效率以及更高的生物产量 因此将 基因转入 作物以提高 植物的光合速率和耐热性 是 途径的第一个关键酶它一直是 植物的转化靶点 研究表明通过将 植物玉米(.)的 基因转入 植物小麦中可以增强转基因小麦光化学和抗氧化酶活性上调光合作用相关基因的表达延迟叶绿素的降解改变小麦中脯氨酸和其他代谢物的含量并最终提高其耐热性 到目前为止尚无关于 参与小麦器官发育的报道 等研究表明小麦 基因在雌蕊中表达量较高因此推测其与雌蕊的发育相关 近期笔者从 等利用 的正常雌蕊()、雌蕊化雄蕊()和 的正常雄蕊()为材料构建的 数据库中筛选出一个在 和 中表达量异常高的基因经序列比对分析发现该基因与节节麦(.)和大麦(华 北 农 学 报 卷.)中编码 蛋白的基因同源由于该基因位于 染色体上因此命名为 在本研究中从 和三雌蕊近等基因系 中克隆了 基因并对其表达模式、共表达基因及原核表达后酶的活性进行了分析 结果表明 可能参与小麦雌蕊发育它在雄蕊中的过量表达可能与 的雄蕊同源转化为雌蕊性状形成有一定的关联 本研究为进一步阐明 基因的功能及其小麦雌蕊发育的调控机制奠定了基础 材料和方法.试验材料本研究选用三雌蕊小麦 和小麦雄蕊同源转化雌蕊突变体 为试验材料 是小麦三雌蕊突变体()与川麦()杂交后与 回交 代后获得的三雌蕊小麦株系 是从 与中国春()的杂交后代中筛选出的一个雄蕊同源转化为雌蕊的突变体其雄蕊部分或完全转变为雌蕊因此具有 个雌蕊因此 与 中均含有控制小麦三雌蕊性状的关键基因 小麦进入孕穗期后分别取采集长度为.(二棱期至小花分化期).(雌雄蕊原基分化期)和.(药隔时期)的 个阶段幼穗 同时采集 的雌蕊()、雌蕊化雄蕊()及 雄蕊()将上述材料浸入 保存液(中国大连)中置于 超低温冰箱中保存备用.总 提取和 合成利用 (兰博基因中国江苏)分别提取 和 个阶段的幼穗及、的总 具体提取方法参照生产商提供的说明书执行 利用 琼脂糖凝胶电泳和 微量分光光度计检测 的纯度和浓度 以上述提取的 为模板利用 (中国大连)参照说明书提供的方法进行反转录并将得到的 溶液置于 的冰箱中保存备用.的克隆测序基于小麦.序列利用 .设计 扩增引物(表)以 和 药隔时期幼穗 作为 扩增的模板退火温度 将扩增纯化后的 产物连接到 载体上导入 感受态细胞中最后涂布于含 /的 固体培养基上 静置培养过夜 阳性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序利用 .和 对测序结果进行分析.氨基酸序列分析及系统进化树的构建获得的 序列利用 在线软件(:/./)进行开放阅读框的分析.软件进行氨基酸序列比对利用 的蛋白结构域数据库(:/./)和 在线分析工具(:/./)分析蛋白保守结构域及功能域使用(:/./)分析蛋白的分子量、理论等电点和蛋白质的亲疏水性采用 网站(:/./)预测蛋白的二级结构运用 的(:/./.)搜索同源基因使用 .软件进行多重序列比对再使用 .软件中的邻近相连法构建系统发育树并进行 检测.荧光定量()分析利用 .设计 的 引物引物序列如表 所示 以.中的 作为模板利用 仪(美国加州)进行 具体操作参照 (美国加州)的说明书进行 以小麦 基因作为内参(:)利用 的方法计算各样品中 基因的相对表达量 利用 软件作图.重组表达载体 的构建及诱导表达根据 基因的 序列分别设计带有()和()限制性内切酶位点的引物(表)以.中克隆且测序正确的菌液为模板进行菌落 退火温度.利用 和 对扩增回收产物和 质粒进行双酶切再利用 连接酶连接获得 重组载体 利用热激法将重组载体转入大肠杆菌 中利用 和双酶切进行验证 最后将验证正确的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序 将测序正确的重组质粒 转化到大肠杆菌()中获得的 重组菌株在(含/)液体培养基中/培养培养至 值.左右加入终浓度为./的 诱导剂 诱导 /离心 期向桂丽等:小麦 基因克隆及功能预测 收集菌液细胞 按照钰博生物的大肠杆菌总蛋白提取试剂盒提取融合蛋白通过冰浴超声得到大肠杆菌总蛋白样品 按照磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶()试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书操作在 测定 减少速率从而计算 酶活性表 基因克隆、及原核表达引物序列.引物名称 引物序列()()退火温度/引物用途.克隆扩增.原核表达.挖掘与 共表达的基因利用中国春小麦()及其近等基因系 种 数据库中获得 值挖掘与 共表达的基因 这些共表达基因包括抽穗期和开花期的旗叶开花早期和晚期的茎、根、雌蕊、雌蕊化雄蕊、雄蕊、子房孕穗期的茎和穗种子萌发期的胚芽鞘、胚、根尖以及幼苗期叶片 计算 与其他基因之间表达量的 相关系数()将正相关的 相关系数阈值设定为.利用 (:/./.)对与 共表达的基因进行 富集分析 利用 在线工具(:/./)绘制 富集的气泡图 结果与分析.基因克隆及序列分析以 和 药隔时期幼穗 作为 扩增的模板克隆获得一条约 的单一条带与预期结果相符(图)经测序和比对分析后发现从 和 中克隆得到的目的基因序列完全一致 克隆得到的 长 度 为 开放性阅读框()长度为 编码 个氨基酸残基(图)通过 上的 比对后发现该基因序列与其他植物的 基因序列具.基因克隆:.扩增产物.扩增产物.基因的 序列.:.图 基因的 扩增及 序列.华 北 农 学 报 卷有.的相似性其中与小麦中国春品种 染色体上的 基因(.)具有.的一致性与二穗短柄草(.)和酸枣(.)的 基因分别具有.和.的一致性 因此将该基因命名为 并将该序列上传 数据库(登录号:)运用 .软件进行氨基酸序列多重比对分析发现目的基因与中国春(.)、二穗短柄草(.)、水稻(.)、高粱(.)、黄花菊(.)的氨基酸序列相似度分别为.比对结果显示(图)基因编码蛋白序列在 端具有保守的丝氨酸()可逆磷酸化位点()端具有植物型 蛋白特征序列()氨基酸序列第 位是 型 的丙方框分别为 端可逆磷酸化位点和 端植物型 氨基酸序列下划线.保守的 催化亚结构域箭头.第 位氨基酸残基 .图 与其他植物 氨基酸序列比对.期向桂丽等:小麦 基因克隆及功能预测 氨酸()而非高粱和黄花菊 型 的丝氨酸()表明小麦 蛋白是植物型 型.蛋白的特征性分析与系统进化树构建在 数据库中对 结构域进行预测发现该蛋白在氨基酸序列 位具有一个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶()保守结构域属于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶超级家族成员(图)进一步分析显示在该结构域中具有 个 活性位点分别在氨基酸序列第 位()和第 位()在这 个活性位点中分别含有与酶活性有关的氨基酸残基赖氨酸()和组氨酸()同时具有 个保守的 亚催化结构域(图)该蛋白质分子式 相对分子质量为.理论等电点为.不稳定系数.总平均亲水性为.因此该蛋白属于酸性亲水性蛋白 二级结构分析预测该蛋白含有.的 螺旋、.的 转角、.的延伸链和.的无规则卷曲(图、)为了进一步了解 基因的生物学功能采用 .软件 构建植物 蛋白氨基酸序列的系统进化树(图)结果表明相同光合作用途径且亲缘关系近的物种首先聚为一类 基因氨基酸序列与乌拉尔图小麦()、野生二粒小麦()、大麦()等的亲缘关系最近同属于 型分支.蛋白结构域.蛋白二级结构.蛋白质亲水性预测 红色区域.螺旋蓝色区域.延伸链黑色区域.无规则卷曲.图 蛋白序列分析.基因 分析进一 步 探 讨 克 隆 得 到 的 基 因 在 和 中的表达是否有差异通过 对 和 个阶段的幼穗及、的表达量进行分析(图)结果显示 基因在 种材料及、中均有表达但各个时期及、表达量有显著差异 在 小穗中 的表达量在雌雄蕊原基分化期(.)最高其次是二棱期至小花分化期(.)表达量最低的是药隔时期(.)在 小穗中 的表达量在二棱期至小花分化期最高雌雄蕊原基分化期和药隔时期表达量相近 在二棱期至小花分化期和药隔时期 小穗中 的表达量都要显著高于 而在雌雄蕊原基分化期无显著差异 在 和 中的表达量显著高于 的表达量.重组蛋白诱导表达及 活性分析构建的 重组质粒经双酶切和电泳检测后获得 条带一条大小为 左右(载体)一条大小为 左右(目的条带)而未经双酶切的 线性质粒只有一条大小 左右的条带条带大小与预测的一致(图)重组质粒测序结果与目的基因序列一致证明重组质粒 构建成 华 北 农 学 报 卷图 与其他植物 的系统进化树.二棱期至小花分化期.雌雄蕊原基形成期.药隔期.雌蕊.雌蕊化雄蕊.雄蕊不同字母的均值表示存在差异显著(.)图 同.图 基因在 和 幼穗发育的 个时期及、的相对表达水平分析.功 将重组质粒转化到大肠杆菌()中活化获得 重组菌株 对 诱导浓度、诱导时间及诱导温度进行优化 在 、终浓度为./时诱导 后 蛋白表达量最大 表达菌液经超声破碎后取上清部分测定融合蛋白中 的活性 结果表明(图)空载体组中是否添加 对 活性影响显著且酶活性均较低与 空载组相比 组的 活性增强加入 诱导后其酶活性进一步得到显著提升 原核表达分析证明 基因编码的蛋白能催化磷酸烯醇式丙酮酸()生成草酰乙酸并且在 诱导后活性显著增强.与 共表达的基因分析为探究 与其他调控花器官发育基因之间是否存在相互关系从小麦 数据库中挖掘出与 共表达的基因 当 相关系数的阈值设定为.时从小麦 个 数据库中共筛选到了 个基因其中 个基因得到 注释信息当 .时获得 个富集显著的 在这些 中有 个 与花器官的发育与分化相关(图)这些 主要包括:花器官形成、生殖芽系统发育、胚胎后器官形态发生、花器官形态发生、生殖过程的调节、单体生殖过程、生殖过程、花器官的发育、花器官特性的维持、器官特性的维持、生殖结构发育、生殖系统发育、多细胞生物繁殖过程、分生组织营养期到生殖期的转变、器官形态发生、花轮发育、胚胎后器官发育和花器官特性规范等 这表明 可能与这些基因一起调控了小麦花器官的发育 期向桂丽等:小麦 基因克隆及功能预测 .重组质粒 的双酶切鉴定:.质粒经、双酶切.线性质粒.活性测定:.对照组.试验组.:.:.图 原核表达分析.颜色表示富集程度大小表示基因数量 .图 共表达基因 富集分析.结论与讨论在 植物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶()的主要作用是催化磷酸烯醇式丙酮酸()生成草酰乙酸()进入三羧酸循环从而弥补三羧酸循环中消耗的中间产物 此外 在植物的生长发育和逆境适应过程中也发挥了重要的作用如果实的成熟、种子的萌发和发育、抗旱、抗盐等 到目前为止除 等报道了细菌型 基因可以加速花粉成熟过程中贮藏物质的积累外尚无关于 参与植物器官发育的报道 等研究表明小麦 基因在雌蕊中表达量较高因此推测其与雌蕊的发育相关 本研究以小麦 个特有的雌蕊突变体 和 为试验材料克隆了一个 家族基因 它是 位于 染色体上的同源基因该基因具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性位点和功能位点 华 北 农 学 报 卷第 位氨基酸为 植物 典型的丙氨酸 聚类分析结果也表明 属于 型 家族原核表达分析结果表明构建 重组质粒在大肠杆菌中能表现出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性且 诱导后酶活性明显增强 这表明本研究获得了具有正常功能的 基因 通过对、和 的 数据分析表明 在 和 中的表达量显著高于 因此推测小麦雄蕊同源转化为雌蕊可能与 的过量表达相关 序列比对结果分析表明在 和 中克隆得到 基因 序列及推导氨基酸序列完全相同这表明雄蕊同源转化为雌蕊性状不是 基因序列的差异造成的可能与其表达量有关前期研究表明小麦 基因在不同组织中的表达具有特异性如 基因在根和生殖器官中表达量较高 基因在幼苗期的叶片中高水平表达 的表达具有普遍性因此可能是一个看家基因 雌蕊等生殖器官中高水平表达 在成熟叶片中表达量较高在蓖麻()中 等也观察到 基因在雌蕊的珠被中的表达量高于雄蕊因此推测 与雌蕊发育相关 本研究重点探讨了 在小麦幼穗、雌蕊()、雄蕊()以及雌蕊化的雄蕊()中的表达情况 在幼穗发育的 个阶段除阶段二(雌雄蕊原基分化期)外 中的 基因的表达量均高于 尤其是在第三阶段(药隔形成期)中的 基因表达量约为 的 倍 在这个阶段雌雄蕊原基已完成分化雄蕊突起由球状变为柱状且沿中部自顶向下出现微凹纵沟同时雌蕊原基顶端凹陷分化出 枚柱头原基 因此在这个阶段雄蕊和雌蕊发育所需要的物质具有较大的差异 而 在雄蕊中的过量表达可能造成蛋白质和脂质代谢混乱从而导致雄蕊发育异常 已有研究表明花药和花粉发育过程中脂质代谢的紊乱会导致花药角质层、花粉外壁和花药亚细胞器膜的发育异常从而引起细胞核雄性不育()基因在 的、及 的 中的表达模式进一步表明该基因可能与雌蕊发育相关因为 在 和 中的表达量显著高于 该结果也与之前的 结果一致 共表达分析显示 基因与花器官形成、花器官形态发生、花器官的发育、花器官特性的维持、器官形态发生、花轮发育和花器官特性规范等花器官的发育与分化相关基因共表达进一步表明 可能参与了小麦花器官的形态发生 此外研究表明基因表达模式的改变会导致小麦雄蕊心皮化 综上所述 可能与小麦雌蕊发育相关其在雌蕊中的过量表达可能与 的雄蕊同源转化为雌蕊性状形成有一定的关联 本研究为进一步阐明 基因的功能及小麦雌蕊发育的调控机制奠定了基础从小麦中克隆得到 基因该基因编码 个氨基酸具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性位点和功能位点是植物 型 构建的 重组质粒在大肠杆菌中能表现出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性且 诱导后酶活性显著增强这表明 基因具有正常的功能 在 幼穗发育的二棱期至小花分化期和药隔时期 基因的表达水平都显著高于 且 的 和 中的表达量显著高于 中的 共表达分析结果进一步表明 可能参与了小麦花器官的形态发生 因此推测 可能参与小麦雌蕊发育其在雄蕊中的过量表达可能与小麦雄蕊同源转化为雌蕊性状形成有一定的关联参考文献:.().():.:./.():.:./.:.:./.?.():.:./.():.:./.(.).():.:./.():.:./.:.:.:./.期向桂丽等:小麦 基因克隆及功能预测 .:.:.:./.():.:./().:.:./.():.:./().():.:./().():.:./.:.():.:./().():.:./.():.:./.(/):.:./:.().():.:./.:.:./.(.).():.:./.杨在君彭正松周永红彭丽娟魏淑红.利用 分子标记评价小麦三雌蕊近等基因系的遗传背景.核农学报():.:./.():.王俊英赵春江杨宝祝.小麦小花发育与退化的研究.华北农学报():.:./.():.():.:./.:.():.:./.():.:./.():.:./.():.():.:./.():.:./.丁在松周宝元孙雪芳赵明.干旱胁迫下 过表达增强水稻的耐强光能力.作物学报():.:./.():.():.:./.:.:./.:.():.:./.():.:./.