PIT1基因多态性与鸡生长性状相关.doc

背景
作为POU蛋白家族成员之一，垂体特异性转录因子PIT1(PIT1，or GHF1，or POU1F1) 的主要作用在于结合生长激素(GH)，泌乳素(PRL)和促甲状腺激素(TSH-β)的启动子并促进他们转录，PIT1其他的生物活性也有报道，如调解垂体前叶发展、促进垂体细胞增殖，消除或者推迟人类肾上腺功能，同小鼠侏儒型有关，以及促使肝脏原始细胞分化成泌乳素生成细胞。PIT1基因最初的活化受其祖蛋白基因PROP-1控制，是自动调节表达，它的mRNA存在于各种垂体的细胞中。但是，PIT1蛋白主要在泌乳细胞、生长激素以及促甲状腺激素细胞中表达，促使分泌PRL、GH和TSH-β。
目前为止，PIT1的cDNA已经在很多物种中发现，以前的研究表明哺乳动物的PIT1基因含有6个外显子，禽和鱼类有7个，其前体长度不同。Tanaka等人首次分离出鸡PIT1基因的cDNA。其由选择性剪接形成的三个亚型PIT1、 PIT1β和PIT1ω也被分离出来，分别含有335，363和327个氨基酸。该PIT1基因的选择性剪接在其他物种上也有报道。根据2006年发表的鸡的基因组序列，鸡的PIT1基因在1号染色体(GGA1)上，长度超过14kb。
由于其重要的调节功能和多种的生物活性，PIT1一直被视为研究生产性能的关键候选基因。有迹象表明，猪的PIT1基因变异和生长、胴体以及脂肪性状相关。对鸡的研究中，虽然最近在PIT1基因离散区域2400bp处发现有23个单核苷酸多态性（SNP）和一个57bp的缺失，但它们对鸡生产性状的遗传效力仍不清楚。最近，有报道证明在POU结构域的一个非同义单核苷酸多态性(A → T, Asn229Ile)同第八周的体重显著相关。
在这项研究中，对全同胞F2代资源群中五个已知的鸡PIT1基因多态性进行基因分析，来评价他们的与鸡生长性状、胴体和脂肪性状的遗传相关性。

方法
鸡群体
在这项研究中采用Lei等提供的全同胞F2代资源群，九只隐性白公鸡（WRR）和九只中国杏花母鸡（X）的杂交，以及6只WRR母鸡和6只X 的反交产生17个F1家系和454个全同胞的F2代个体。F2鸡进行平养，饲喂满足NRC标准的商业谷物大豆基础日粮。三代的鸡都要进行基因分型，来评价PIT1基因变异对鸡生产性能的影响。57个待测性状是31个生长性状：孵化后体重，7，14，21，28，35，42，49，56，63，70，77，84和90天的体重，42，49，56，63，70，77 ，84和90天的胫长，42，49，56，63，70，77和84天的胫宽。0-4和4-8周的平均日增重，以及14个屠体性状，包括：头宽(HWD)，胸宽(BWD)，体长(BL)，胸角宽(BA)，胴体重(CW)，半净膛重(EWG)，净膛重(EW)，胸肌重(BMW)，腿肌重(LMW)， 翅膀重(WW)，头和颈重(HNW)，小腿和脚脚趾重(STW)，心肝腺胃肌胃重(HLPGW)，和小肠长度(SIL)。以及12个脂肪性状：皮下脂肪厚度(SFT)，肌间脂肪宽(CFW), 腹脂重(AFW), 腿肌颜色(LMC)，胸肌颜色(BMC)，腿肌剪切力(SFLM)，胸肌剪切力(SFBM)，腿肌导电率(LMCD)，胸肌导电率(BMCD)，肌肉失水率(WLRM)，腿肌纤维横截面积(TALMF)和胸肌纤维横截面积(TABMF)。
标记和引物
五个已知的鸡PIT1基因型，可以很容易的通过PCR-RFLP以及简单PCR进行基因分型，选定作为标记来评估对鸡生产性能的影响。这些多态性是一个57bp的缺失(MR1)和四个SNP(MR2-MR5)位点。设计并合成覆盖MR1-MR5的特异片段的四对引物PR1-PR4。引物的详细信息见表一。
运用PCR-RFLP进行基因分型
PCR在体系为25 µL的混合物中进行，包含：50ng的鸡染色体DNA，1× PCR扩增缓冲液，12.5 pmol的引物(PR1-PR4)，100 µM dNTP(dATP，dCTP，dGTP and dTTP各100µM)，1.5mM MgCl2和1.0 U Taq DNA聚合酶（上海生工生物工程技术服务有限公司，上海，中国）。在MasterCycler梯度PCR仪中按如下条件下进行：94℃热变性3 min，然后94℃变性30 s，58–62℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min。MR1的基因型通过用2%的琼脂糖凝胶电泳直接检测其PCR扩增产物。PR2-PR4的PCR产物则要在37℃下酶切过夜，酶分别为TaqI，MspI，EcoRI，和TasI（如表一）。消化液包含8μl的PCR产物，1 ×消化缓冲液，每种酶3.0 U，通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳半个小时后，用TFM-40紫外投射仪确定MR2-MR5的基因型。

统计分析
单倍型推断
运用PHASE 2.0 软件，分析MR1-MR5位点在454个F2群体中组成的单倍体情况。
标记性状的关联分析
用SAS软件建立普通线性模型进行标记性状的关联分析，遗传效力则由下面的混合模型进行分析：Y = µ+G+D+H+S+e
其中Y是性状的表型值，μ是群体均值，G是基因型的影响值，D是母体的随机效应，H是孵化批次的影响值，S是性别因素（公鸡或者母鸡），e是残差。通过上述模型，分析每一个MR2-MR5及其单倍型同57个生产性能的关联，用来评价它对鸡生长、身体成分和脂肪沉着的遗传效力。
结果
基因型和单倍型推断
对MR1-MR5，在整个群体中共发现三个基因型。从基因型数据中推断出有13种单倍型，这些单倍型主要包含两个主要的H1("DTGCC"，74.56%或者671/900)和H2("ITGTT"，12.89% 或116/ 900)，六个次要的H3 ('ITACC'，2.66%或24/900)，H4('ITGCC'，2.33% 或21/900)，H5('ICGCC'，2.33%或21/900)，H6('ITGTC'，1.88%或17/900)，H7 ('DTGTC'，1.00%或9/900)和H7('DCGCC')，1.00% 或9/900)，发生频率介于1%到5%之间。还有五个较小的(H9-H13)发生频率低于1%。

单个SNP同鸡生长性能的关联
结果显示，MR1与84天的胫宽显著相关(P < 0.05)，并且同初重及84天的胫长显著相关(P < 0.01)，MR2同28,42天的体重及0–4周的平均日增重显著相关(P < 0.05)，MR3同4-8周的平均日增重显著相关(P < 0.05)，此外，MR4同63,77,84天的胫长及84天的体重显著相关(P < 0.05)，并且同77天的胫宽高度相关(P < 0.01)，并且T比C更有利于鸡的生长(Table 2)。MR5同21，35天的体重及63天的胫宽显著相关(P < 0.05)，同28天的体重及1-4周的平均日增重高度相关(P < 0.01)，并且等位基因C对鸡的生长更有利(Table 3)。

这些多态位点与鸡的屠体性状及脂肪性状没有显著相关性。
PIT1单倍型同鸡生产性能的关联
对于单倍型而言，对有10个二倍体型的428个体进行关联分析 (271 of H1H1，62 of H1H2，24of H1H3，15 of H1H6，13 of H1H4，10 of H1H5，9 ofH2H5，8 of H2H4，8 of H2H6，8 of H2H7)。结果显示MR1-MR5单倍型同生长性状的初重 (P = 0.0252)、28天的体重(P = 0.0390)及56天的胫宽(P = 0.0400)显著相关。在10个二倍体中，H2H4的初体重(mean = 30.2), 28天的体重(mean = 352.6)及56天的胫宽(mean = 9.24)比其它的都高。然而，PIT1单倍型同鸡的屠体性状和脂肪性状无显著相关(P > 0.05)。
可以得出结论即：PIT1基因的多态性同鸡的生长显著相关，但与屠体性状和脂肪性状无显著相关。
讨论和结论
在这项研究中，PIT1基因的多态性同鸡生长性能有关。到目前为止，PIT1基因同生长性能的关联在人，猪和牛上都有报道，在鸡PIT1基因外显子6上的非同义的SNP (Asn299Ile)同8周的体重显著相关，而且它的等位基因频率在肉鸡和蛋鸡中差异显著。此外，在内含子5上三个相邻的SNP(MR2-MR4)同0-4和4-8周的平均日增重，28，77和84天的体重，63,77及84天的胫长，以及77天的胫宽相关，到目前为止，在GGA1中已经鉴定了很多与体重有关的QTL(数量性状遗传位点)。然而，只有一个已知PIT1基因存在的QTL覆盖了96Mb的区域(总染色体的大小为201Mb)，似乎位于这个区域并且对鸡生长有重要作用的SNP的连锁不平衡可能与致病突变（S）有关。
有趣的是PIT1基因的多态性同鸡的屠体性状和脂肪性状没有相关，在以前的研究中， PIT1基因的变异同猪的屠体性状和脂肪性状相关，与牛的屠体性状有关。然而，在本次研究中，PIT1基因的五个多态位点都与屠体性状和脂肪性状无关，此外，单倍体分析也得出类似的结果，这个结果令人感到意外，因为在某种程度上，一些屠体性状同生长性状相关联，因此，它仍需要进一步的研究确认。
更进一步说明，PIT1基因的多态性在不同阶段影响鸡的生长性能，MR2，MR3和MR5似乎对鸡生长早期的影响较大，因为他们分别与0-4周和4-8周的平均日增重，21,28,35和42天的体重以及63天的胫宽有关。不同的，MR1和MR4对鸡中期生长有更高的影响，因为他们同63,77，84天的胫长，77和84天的胫宽以及84天的体重相关。至于不同的基因型相比较，MR4的T和MR5的C都对鸡的生长更为有利。
可以得出结论PIT1基因多态性及其单倍型与鸡的生长性状相关联。