植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制.pdf

动物营养学报，（）：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制张腾龙 郭晨阳 宋 洁 敖长金 王丽芳（内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特；内蒙古农牧业科学院，呼和浩特）摘 要：本试验旨在研究植物提取物复合制剂对脂多糖（）诱导的奶牛乳腺上皮细胞（）炎症模型免疫、抗氧化功能和转录组的影响，以揭示植物提取物复合制剂缓解 炎症反应的分子机制。试验选用第 代贴壁生长，随机分为 组，每组 个重复，每个重复 个培养孔。对照组 不添加 和植物提取物复合制剂，采用基础培养基培养 ；组 添加 作用 后，采用基础培养基培养 ；试验组 加入 作 用 后，分 别 加 入 （组）、（组）及 （组）的植物提取物复合制剂，采用基础培养基培养 。测定各组免疫及抗氧化相关指标，并选择 组和 组进行转录组测序及分析。结果表明：）组 相对增殖率显著低于对照组（），组 相对增殖率显著高于 组（），且 组、组和 组 中肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、白细胞介素（）及白细胞介素（）含量显著低于 组（）。）组 中丙二醛（）含量和诱导性一氧化氮合酶（）活性显著高于对照组（），组、组和 组 中 含量和 活性显著低于 组（），组 中总超氧化物歧化酶（）、过氧化氢酶（）和谷胱甘肽过氧化物酶（）活性及总抗氧化能力（）显著高于 组（）。）转录组测序结果表明，共有 个差异表达基因。富集分析显示，差异表达基因主要参与调节白细胞介素（）生成、白细胞介导的细胞毒素作用、细胞增殖等生物学过程。富集分析显示，差异表达基因主要集中在以 样受体（）信号通路和 信号通路为主的免疫相关信号通路。）以介数中心性为指标进行网络分析，发现 样受体（）、趋化因子（）和集落刺激因子（）等 个基因在植物提取物复合制剂调控的差异表达免疫基因中起到关键连接性作用。由此可见，植物提取物复合制剂可以提高 抗氧化功能，缓解 炎症反应，其分子机制是植物提取物复合制剂通过调节 信号通路和 信号通路缓解 的炎症反应，、和 等 个基因在差异表达免疫基因中起到关键性的连接作用。关键词：植物提取物复合制剂；奶牛乳腺上皮细胞；炎症反应；转录组中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国 家 自 然 科 学 基 金 项 目（）；内 蒙 古 自 治 区 科 技 计 划 项 目（）；内 蒙 古 自 然 科 学 基 金 项 目（）；内蒙古农牧业创新基金项目（）；奶牛疾病绿色防控技术应用示范（）作者简介：张腾龙（），男，内蒙古呼和浩特人，博士研究生，动物营养与饲料科学专业。：通信作者：敖长金，教授，博士生导师，：；王丽芳，研究员，：动 物 营 养 学 报 卷 乳房炎是世界范围内奶牛养殖业中成本最高的疾病之一，其本质是乳房内部被细菌感染并产生炎症反应。尽管有许多细菌会引起乳房炎，但只有少数细菌是普遍存在于奶牛养殖场中。其中，革兰氏阴性菌大肠杆菌不仅是广泛存在于环境中的致病菌，并且是在泌乳早期临床乳房炎奶牛中发现的最普遍的病原体，同时在日常养殖过程中很容易传播于牛群中，最终导致慢性或终身疾病。奶牛乳腺上皮细胞（）是抵御乳房感染的第 道防线，细菌的毒素、酶和细胞壁成分对 的功能有直接影响，产生细胞因子等各种炎症介质。脂多糖（）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，能够刺激 产生白细胞介素（）、白细胞介素（）、白细胞介素（）和肿瘤坏死因子（）等促炎性细胞因子，从而诱发乳房炎，是目前国际上公认的研究奶牛乳房炎的主要病理模型。使用抗生素进行奶牛乳房炎的防治是牧场生产中最普遍的方法，但是由此导致的病原体耐药性和乳中抗生素的残留问题也越来越严重。有研究表明，植物提取物可以治疗奶牛乳房炎，且具有长期使用不会诱发耐药性的优势，已成为最具应用潜力的抗生素替代品。等研究发现，槐蓝属植物中提取的靛玉红能够通过抑制 样 受 体 （）和 下 游 核 转 录 因 子 （）及丝裂原活化蛋白激酶（）途径的炎症信号，改善由 诱导的小鼠乳房炎。等研究发现，蒲公英水提取物能够抑制 刺激的 牛 外 周 血 单 核 细 胞 中、和 等促炎性细胞因子的基因表达量，并抑制一氧化氮（）的产生。金银花具有抗炎解热、抗衰老、抗氧化等生物功能；蒲公英有广谱抗菌作用；连翘能够抑制大肠杆菌、葡萄球菌及链球菌等病原微生物的生长；益 母 草 具 有 提 高 动 物 繁 殖 性 能 的 作用。因此，本试验选择金银花、蒲公英、连翘和益母草的粗提取物制成植物提取物复合制剂，作用于 诱导的，研究其对炎症 的影响和机理，为植物提取物复合制剂在乳房炎奶牛上的应用提供数据支持。材料与方法 的培养 在奶牛屠宰后采集整个乳腺并迅速转移至实验室进行后续试验操作。使用无菌手术剪、手术刀及镊子进行样品的采集。将采集的乳腺组织分割为约 的组织块，要求腺泡丰富、导管和脂肪较少。每次使用约 个乳腺组织块进行后续试验。将采集的乳腺组织用无菌磷酸盐缓冲液（）（双抗浓度为 ）冲洗至无明显乳汁溢出，然后放入含 酒精的烧杯内清洗约，再依次在无菌（双抗浓度为 ）中清洗 次。使用无菌眼科剪去除酒精浸泡过的外层组织、脂肪、结缔组织和残留管腔结构。将符合上述要求的乳腺组织剪碎为直径 的颗粒并移入 刻度离心管内，向离心管内加入等体积 的型胶原酶溶液，置于 、饱和的培养箱中，消化 得到组织细胞混合液。将消化 的组织细胞混合液用 目孔径的无菌尼龙滤网过滤，将细胞滤液转移至 锥底刻度离心管中，于 离心，弃去上清液。然后向离心管内加入生长培养基悬浮细胞，将细胞和生长培养基的混合液接种于 一次性细胞培养瓶中，于 、饱和的培养箱中进行培养。待原代细胞生长且贴壁率达到 时，进行细胞纯化及传代。将分离纯化后的 鉴定后，连续培养到第 代，将其分别接种于试验设计要求的细胞培养器皿中，加入完全培养基，、条件下培养，待细胞贴壁率达到 时，弃去旧培养基，加入不含胎牛血清培养基培养 后，按试验设计进行后续试验。试验设计 植物提取物复合制剂添加量的筛选 植物提取物复合制剂为金银花、益母草、连翘、蒲公英的植物水提取物按照干物质重量比 混合制成，各植物提取物委托南京泽朗生物科技有限公司进行制备，提取工艺条件为：倍水，提取 ，然后 倍水，提取 。种植物提取物的活性成分含量见表，委托武汉迈特维尔生物科技有限公司采用广泛靶向代谢组学方法进行测定。期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制表 种植物提取物的活性成分含量 项目金银花连翘蒲公英益母草黄酮 酚酸 核苷酸 有机酸 脂质 木质素和香豆素 其他 合计 将贴壁生长的第 代 随机分为 组，每组 个重复，每个重复 个培养孔。对照组采用基础培养基，不添加植物提取物复合制剂，不同水平植物提取物复合制剂添加量分别为、和 ，培养时间为、和，以确定植物提取物复合制剂的适宜添加量。植物提取物复合制剂对炎症 的抑制作用 （，苯酚纯化，货号：）购自美国 公司。以 诱导 炎症损伤，建立炎症损伤模型，作用时间及作用浓度为课题组前期试验结果确定（添加剂量：，作用时间：）。将贴壁生长的第 代 随机分为 组，每组 个重复，每个重复 个培养孔。对照组（组）采用基础培养基，不添加 和植物 提 取 物 复 合 制 剂，培 养 ；组 加 入 的 作用 后，采用基础培养基培养 ；植物提取物复合制剂组在加入 的 培养 后，再分别加入 （组）、（组）和 （组）的植物提取物复合制剂，采用基础培养基培养。测定指标与方法 相对增殖率 的相对增殖率采用 法测定。将第 代 悬液接种于 孔板中，按试验设计培养后，向各培养孔中加入 的 溶液，培养 后，使用全自动酶标仪检测各孔 吸光值（），相对增殖率计算公式如下：相对增殖率（）（试验组 对照组 ）。炎症因子及抗氧化指标 将试验中的细胞培养液收集于 管中，离心 ，收集上清液用于炎症 因 子 及 抗 氧 化 指 标 的 测 定。一 氧 化 氮（）含量采用 法测定，试剂盒购自美国 公司。诱导性一氧化氮合酶（）、总超氧化物歧化酶（）、过氧化氢酶（）活 性 和 总 抗 氧 化 能 力（）及、白细胞介素（）含量均采用酶联免疫吸附法测定。谷胱甘肽过氧化物酶（）活性采用二硫代二硝基甲苯酸法测定。丙二醛（）含量采用硫代巴比妥酸法测定。上述指标所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。转录组测序 细胞培养液收集完成后，用预冷的 溶液清洗 次细胞，加入胰蛋白酶消化细胞至部分细胞呈球状，用培养基终止消化后，加入 吹打，悬浮细胞，离心，弃去上清液，加入细胞保存液，保存，选择 组和 组委托上海美吉生物医药科技有限公司进行 的提取和测序。采用（公司，美国）法提取 中的总，并使用 （公司，日本）去除基因组。分别采用 （公 司，美 国）、（公司，美国）检测 样品的质量，以保证使用合格的样品进行转录组测序。动 物 营 养 学 报 卷 文库的建立采用 试剂盒（公司，美国）。首先利用带有（）的磁珠从 总 中富集有 尾的。再加入，将 随机断裂成 左右的小片段。接着采用 试剂盒（公司，美国），加入六碱基随机引物（公司，美国），以 为模板反转合成一链，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。双链的结构为黏性末端，加入 将其补成平末端，随后在 末端加上 个 碱基，用于连 接 字 形 的 接 头。经 过 富 集（试剂盒中自带）后，筛选 的条带。使用 荧光染料（公司，美国）经 微型荧光计定量后，文库使用 测序平台进行高通量测序，测序读长为双端测序（，）。数据处理与分析 试验数据采用 进行整理分析，并使用 统计制图软件进行标准曲线的绘制，使用 统计软件中的 程序进行单因素方差分析。表示差异显著，表示差异不显著。委托上海美吉生物医药科技有限公司通过 平台进行高通量测序。应用 软件进行差异表达基因的筛选，多重验证采用（）方法，显著性水平设置为校正后的 值（），差异倍数（，）设置为 以上。得到差异表达基因后对差异表达基因做 功能分析和 信号通路分析。使用 数据库搜索已知和预测的蛋白质相互作用的基因产物，置信评分临界值设置为。利用 软件进行互作网络图的绘制，从主网络集群中分离出的单节点、双节点和三节点被移除，并进行网络分析。节点颜色和大小分别基于差异基因表达量的上调、下调和介数中心性（，）。结 果 植 物 提 取 物 复 合 制 剂 对 相 对增殖率的影响 从表 可以看出，当植物提取物复合制剂的添加量大于 时，会对 造成损伤；当培养时间超过 时，大部分添加量的植物提取物复合制剂会对 造成损伤。因此，根据相对增殖率最大值可以得出，植物提取物复合制剂的适宜添加量为 ，适宜培养时间为 。表 植物提取物复合制剂对 相对增殖率的影响 时间 植物提取物复合制剂添加量 （）植物提取物复合制剂对 诱导损伤的 相对增殖率、抗氧化和炎症因子指标的影响从 表 可 以 看 出，与 对 照 组 相 比，组 相对增殖率显著降低（）；中炎症因子指标、和 含量显著上升（）；中抗氧化指标、活性和 显 著 下 降 期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制（），含量和 活性显著上升（），含量无显著变化（）。与 组相比，组 相对增殖率显著上升（）；组、组和 组 中、和 含量显著下降（），含量无显著变化（）；组 中 活性和 显 著 上 升（）；组、组 和 组 中 和 活性显著上升（），含量和 活性显著下降（），含量无显著变化（）。表 植物提取物复合制剂对 诱导损伤的 相对增殖率、抗氧化和炎症因子指标的影响 ，项目组别 均值标准误 值相对增殖率 肿瘤坏死因子 （）细胞白介素 （）细胞白介素 （）细胞白介素 （）细胞白介素 （）总超氧化物歧化酶（）总抗氧化能力 （）过氧化氢酶 （）谷胱甘肽过氧化物酶（）丙二醛 （）一氧化氮 （）诱导型一氧化氮合酶（）同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（），相同或无字母表示差异不显著（）。下表同。，（），（）测序结果统计总共对 个样本进行测序，总读数从 万个到 万个不等，中位数为 万个。在 组中，的总读数能够定位到参考序列；在 组中，的总读数能够定位到参考序列，说明所选参考序列能够满足后续分析需求。差异表达基因 使用 软件并进行表达量差异统计，统计 组与 组之间的差异表达基因。设置 为，多重检验校正方法采用 方法，显 著 性 水 平 为 。在 组 与 组之间总共检测到 个差异表达基因，其中上调基因 个，下调基因 个（图）。对差异表达基因进行聚类分析，绘制聚类热图（图），图中颜色越红代表基因表达量越高，颜色越蓝代表基因的表达量越低。从图中可以看出，组内样品基因的表达量基本趋于一致，说明生物学重复性良好，组间样品则存在差异基因表达变化。动 物 营 养 学 报 卷图 差异表达基因分析 对差异表达基因进行 功能分析（图）和 信号通路分析（图）。在 注释分析 中 注 释 到 免 疫 系 统 过 程（）的基因有 个，在 注释分析中注释到 个免疫系统通路的基因有 个。总共有 个基因注释在 数据库和 数据库的免疫相关基因（图），其中 个基因在 个数据库中均注释为免疫相关基因，个基因仅在 数据库中注释为免疫相关基因，个基因仅在 数据库中注释为免疫相关基因。差异表达免疫基因生物功能分析 将上述 个基因作为差异表达免疫基因，进行 富集和 富集分析。富集分析发现（图），差异表达免疫基因主要富集在调节白细胞介素（）生成、白细胞介导的细胞毒素作用、细胞增殖等生物学过程。通路富集分析发现（图），差异表达免疫基因主要富集在自然杀伤细胞介导的细胞毒素作用、样受体（）信号通路、趋化因子信号通路和 信号通路等生物学过程。将差异表达免疫基因所对应的蛋白质产物形成互作网络图（图），以确定差异表达免疫基因之间的相互作用关系。样受体（）、趋化因子（）和集落刺激因子（）等 个基因的 值最高，表明它们在与其他基因的连接中起到关键作用（表）。、和蛋白激酶（）等 个基因的表达量显著下调（），和磷脂酰肌醇 激酶调节 亚 基 （）的 表 达 量 显 著 上 调（）。讨 论 植物提取物复合制剂对 炎症因子的影响 是抵御外部感染的第 道防线，分泌的细胞因子作为化学信使能够在细胞之间传递信息并 调 节 机 体 的 免 疫 稳 态 和 炎 症 反 应。、和 被认为是促炎性细胞因子，在炎症 中的含量显著提高。因此，减少促炎性细胞因子的产生可能是治疗乳房炎的有效方法。本试验中观测到，诱导的 中，、和 含量均显著提高，这与前人的研究结果一致；同时，植物提取物复合制剂组促炎性细胞因子含量低于 组，说 明 植 物 提 取 物 复 合 制 剂 对 诱 导 的 炎症反应有积极的调节作用。是最广为人知的抗炎性细胞因子，能够抑制、和 等细胞因子的产生，从而调节机体的炎症反应。本试验中，组 含量显著 期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制高于对照组，与 等关于大肠杆菌引起 炎症反应的研究结果相一致，的释放能够防止 的过度炎症反应，从而维持乳腺健康，但增加 含量并不能完全抑制促炎性细胞因子的产生。同时，本试验中，植物提取物复合制剂组与 组 含量差异不显著，推测植物提取物复合制剂并不是通过调节 的释放来调节 的炎症反应。图 差异表达基因功能注释分析 动 物 营 养 学 报 卷图 差异表达免疫基因富集分析 植 物 提 取 物 复 合 制 剂 对 抗 氧 化功能的影响 氧化应激是炎症过程中的伴随现象，是病原微生物所引起的免疫反应和活性氧生成共同作用的结果。在细胞中，是脂质过氧化的产物之一，其含量可以反映氧化应激水平，同时，含量和 活性能够反映奶牛乳腺的氧化损伤水平。本试验中，组 含量和 活性显著高于对照组，植物提取物复合制剂组 含量和 活性显著低于 组；组 含量高于对照组，植物提取物复合制剂组 含量低于 组，但差异不显著，说明 的刺激能够引起 的氧化应激反应，而植物提取物复合制剂的添加能够缓解炎症 的氧化应激水平。、和 是动物机体内广泛存在的抗氧化酶，能够消除氧自由基的产生，维持机体的动态平衡。本试验中，植物提取物复合制剂组 及、和 活性显著高于 组，说明植物提取物复合制剂能够提高炎症 的抗氧化能力，缓解炎症 的氧化应激水平。植 物 提 取 物 复 合 制 剂 缓 解 炎 症反应的分子机制 转录组测序技术能够揭示机体组织或细胞在特异生物学状态下的差异表达基因，并为后续的差异性分析奠定数据基础，已广泛应用于奶牛乳房炎的研究当中。高通量测序的准确性依赖于碱基值（）和测序获得的总读数，本研究 中，组 和 组 总 读 数 均 在 个以上，值均在 以上，且与参考序列的比对效率均在 以上，说明测序结果准确，所选参考基因能够满足后续分析。期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制 ：样受体 ；：集落刺激因子 ；：蛋白激酶 ；：趋化因子 ；：脾酪氨酸激酶 ；：原癌基因 ；：原癌基因 ；：分子 ；：磷脂酰肌醇激酶调节亚基 ；：酪氨酸蛋白激酶 ；：分子 ；：血管内皮生长因子受体 前体 ；：白细胞介素；：磷脂酰肌醇，二磷酸磷酸酯酶 ，；：磷脂酰肌醇，二磷酸 激酶，催化亚单位 ，；：淀粉样 蛋白前体 ；：牛整合素 ；：分子 ；：限制素；：环状核苷酸门控嗅觉通道 ；：含核苷酸结合的寡聚结构域蛋白 ；：线粒体抗病毒信号蛋白 ；：白细胞介素 受体 型前体 ；：样趋化因子 ；：样趋化因子 ；：乳铁蛋白前体 ；：蛋白亚单位 ；：牛 分子 ；：磷脂酰肌醇，二磷酸酯 激酶，催化亚单位 ，；：样配体 。网络图中包含 个节点和 条边，每个节点代表 个基因所对应的蛋白质，每条边代表 个蛋白质之间的相互作用。节点大小代表 值。节点的颜色对应表达量，蓝色为表达量下调，红色为表达量上调。图中仅展示 值最高的前 个节点及相关的边。，图 差异表达免疫基因功能互作网络图 本研究结果显示，组与 组的 中差异表达基因共有 个，与 组相比，处 理 组 中 上 调 基 因 个，下 调 基 因 个。对差异表达基因进行 功能注释和 功能注释分析，将 个注释到免疫系统过程（功能注释）和免疫系统通路（功能注释）的差异表达基因定义为差异表达免疫基因，与 组相比，组中上调差异表达免疫基因 个，下调差异表达免疫基因 个。基因表达量的变化影响其表达蛋白质和因子的分动 物 营 养 学 报 卷泌发生改变，并通过一系列的信号通路过程最终对机体产生重要影响。表 关键免疫基因 基因调节 值 校正后的 值原癌基因 下调原癌基因 下调磷脂酰肌醇 激酶调节亚基 上调 样受体 下调脾酪氨酸激酶 下调趋化因子 下调集落刺激因子 上调蛋白激酶 下调 分子 下调原癌基因 下调 富集分析发现，差异表达免疫基因主要富集在调节 生成、白细胞介导的细胞毒素作用、细胞增殖等生物学过程。其中，白细胞介导的细胞毒素作用、免疫受体的体细胞多样性和抗菌性体液反应属于生物学过程中的免疫系统过程。通路富集分析发现，差异表达免疫基因在自然杀伤细胞介导的细胞毒素作用、信号通路、趋化因子信号通路和 信号通路均有较高的富集，信号通路和 信号通路可能是本植物提取物复合制剂差异调控 炎症反应的主要信号通路。在基因功能互作网络图分析中，本研究选用 值筛选差异表达免疫基因中的关键基因。值能够量化网络图中 个节点控制其他节点之间信息流的能力，即 值越高，说明该基因对网络的连接性越重要，通常用来评估哺乳动物调控网络的生物学意义。本研究选取 值最高的 个基因为关键基因，与 组相比，其中、和 等 个基因为显著下调基因，、为显著上调基因。属于 样受体家族成员，能够与淋巴细胞抗原（）、样受体（）或 样受体（）协同介导对细菌脂蛋白或脂肽的固有免疫反应，并通过髓样分化因子（）和肿瘤坏死因子受体相关因子（）作用，活化 信号通路，从而产生炎症反应和细胞因子的分泌。是 的识别受体，但是本研究中没有观测到 的差异显著性变化。然而，也有报道指出，刺激的奶牛子宫内膜细胞中 的表达量显著提升，因此推测在 中，刺激也会导致 表达量的提升。同时，等研究发现，激动剂能够通过不同的信号通路引起 诱导的促炎性细胞因子基因表达量的提升。本试验中，植物提取物复合制剂能够抑制 的表达。编码的 蛋白能与 蛋白组成二聚体复合物转录激活蛋白（），是调节炎症因子表达的重要转录因子，同时是 信号通路、等炎症信号通路的下游信号因子。本试验中观测到 基因的表达量显著下调，同时其上游调控基因 的表达量也呈现显著下调，推测植物提取物复合制剂能够抑制 与 基因的表达，抑制炎症细胞因子的释放，从而抑制 产生过度炎症反应。是参与多种生物过程的促炎性细胞因子，本试验中观测到 的表达量显著降低，同时也观测到趋化因子（）、趋化因子配体（）和 等促炎性细胞因子基因的表达量均显著降低。是生长因子样细胞因子，类似的细胞因子还有 等。能够通过自身 结构域结合蛋白质酪氨酸激酶并调节其酶活性，蛋白质酪氨酸激酶在细胞的生长、增殖和分化中具有重要作用。是钙激活的磷脂和二酰甘油依赖的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，参与氧化应 期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制激诱导的细胞凋亡等多种生物学过程。本试验中，植物提取物复合制剂组细胞的相对增殖率显著高于 组，可能跟 和 基因表达量的显著上调和 基因表达量的显著下调有关。结 论 植物提取物复合制剂能够降低 诱导的 中、和 的含量，进而缓解 的炎症反应。植物提取物复合制剂能够降低 诱导的 中 含量和 活性，提高 及、和 活性，进而提升 抗氧化能力，缓解其氧化应激水平。植物提取物复合制剂调控的差异免疫基因主要富集于 信号通路和 信号通路等免疫调控信号通路，其中、和 等 个基因起到关键连接性作用。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：高瑞峰绿原酸抗乳腺炎作用及机制研究博士学位论文长春：吉林大学，：，：（），：，：，（）：，（）：，：，（）：赵国玲，刘佳佳，林丹，等金银花化学成分及药理研究进展中成药，（）：，（）：（）洪金锁，闵继光，刘建雷中草药添加剂（蒲公英流浸膏）对奶牛乳房炎及其生产性能的影响当代动 物 营 养 学 报 卷畜牧，（）：，（），（）：（）周艳，张涛，郑勤琴，等连翘有效成分提取及提取物对奶牛乳房炎致病菌的抑制效果生物技术进展，（）：，（）：（）安胜英，刘观忠，景大明，等三种植物提取物对蛋鸡初产性能的影响黑龙江畜牧兽医，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，：，（），（）：，：，：，：卢德勋动物营养学科发展在战略方向上的重大突破：构建动物健康营养理论和技术体系及其实际应用动物营养学报，（）：，（）：（），：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：期张腾龙等：植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制 霍金金，褚耀诚，金娜，等基于转录组测序分析研究枸芪多糖对育肥猪肠黏膜免疫功能的作用机理动物营养学报，（）：，（）：（），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：；，：（，；，）：，（）（），；，；，（），（）（），：）动 物 营 养 学 报 卷（），（），（），（），（）（），（）（）（）（），（），（），（）（）（）（）（），（）（），（）（），（）：；（责任编辑 武海龙）