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实验20 氧电极法测定植物组织的光合与呼吸速率

氧电极是为测定水中溶解氧含量而设计的一种极谱电极。目前通用的是薄膜氧电极，又称Clark电极，由镶嵌在绝缘材料上的银极（阳极）和铂极（阴极）构成，电极表面覆盖一层厚约20～25μm的聚四氟乙烯或聚已烯薄膜，电极和薄膜之间充以KCl溶液作为支持电解质。由于水中溶解氧能透过薄膜而电解质不能透过，因而排除了被测溶液中各种离子电极反应的干扰，成为测定溶解氧的专用电极。氧电极具有灵敏度高，反应快、可连续测量记录，能够追踪反应的动态变化过程等特点，因而在叶绿体及线粒体悬浮液的光合放氧和呼吸耗氧，某些耗氧或放氧的酶促反应，以及叶碎块或游离叶细胞的光合放氧等的研究上，都得到了广泛的应用。
【原理】
氧电极法测定水中溶解氧属于极谱分析的一种类型。当两极间外加的极化电压超过氧分子的分解电压时，透过薄膜进入KCl溶液的溶解氧便在铂极上还原：
O2＋2H2O＋4e－＝4OH－
银极上则发生银的氧化反应：
4Ag＋4Cl－＝4AgCl＋4e－
此时电极间产生电解电流。由于电极反应的速度极快，阴极表面的氧浓度很快降低，溶液主体中的氧便向阳极扩散补充，使还原过程继续进行，但氧在水中的扩散速度则相对较慢，所以电极电流的大小受氧的扩散速度的限制，这种电极电流又称扩散电流。在溶液静止、温度恒定的情况下，扩散电流受溶液主体与电极表面氧的浓度差控制。随着外加电压的加大，电极表面氧的浓度必然减小，溶液主体与电极表面氧的浓度差加大，扩散电流也随之加大。但当外加的极化电压达到一定值时，阴极表面氧的浓度趋近于零，于是扩散电流的大小完全取决于溶液主体中的氧的浓度。此时再增加极化电压，扩散电流基本不再增加，使极谱波（即电流-电压曲线）产生一个平顶。将极化电压选定在平顶的中部，可以使扩散电流的大小基本不受电压微小波动的影响。因此，在极化电压及温度恒定的条件下，扩散电流的大小即可作为溶解氧定量测定的基础。电极间产生的扩散电流信号可通过电极控制器的电路转换成电压输出，用自动记录仪进行记录。
【仪器设备】
用氧电极法测定溶解氧的专用仪器国内外均有定型产品。国内有上海植物生理研究所生产的简易测氧装置；新华仪表厂生产的CY-Ⅱ型测氧仪等。国外产品有英国Hansatech科学仪器公司生产的CHOROLAB1、CHOROLAB2液态氧电极等型号，美国Yellow Springs 仪器有限公司生产的YSI-53型生物氧监测仪等。现将YSI-53型生物氧监测仪的主要部件及其所需其它部件介绍如下：
电极控制器：其主要作用是给电极提供极化电压；给电磁搅拌器提供工作电压；将电极电流转换成适当大小的电压输出，并通过记录仪进行记录；调节记录仪的满度等。故在其背面有电极插孔，电磁搅拌器插座，记录仪信号输出接线柱（＋、―），以及记录仪调整螺拴。面板上有电源开关及指示灯，电极选择开关（有两个电极可供选择），电极调节螺栓，指针式表头，以及测量选择开关等。电极调节螺栓用以校准电极满度；表头刻度指示待测溶液中占饱和含氧量的百分数；测量选择开关共有五档，其中零位档（AMP ZERO）零位调节螺栓供调零用，空气档（AIR）、氧气档（O2）系指测量时与溶液相平衡的气体成分。TEST A、B两档供检查电极性能用。

图20-1 氧电极测定溶解氧的装置示意图
1.记录仪 2.氧电极控制仪 3.光源 4.隔热滤色缸 5.透镜
6.电磁搅拌器 7.超级恒温水浴 8.反应杯 9.氧电极

电磁搅拌器：由电极控制器控制。当打开控制器电源开关时，电磁搅拌器的磁棒即开始转动，带动其上反应杯中的磁性搅块转动，从而搅拌反应液。可提供400～480转/min的搅拌速度。电磁搅拌器上还附有制动器，可随时停止磁棒的转动。
标准浴器及电极固定器件：安装在电磁搅拌器的上方，水浴中装有进出水口，可与超级恒温水浴相连。标准浴器上方的盖上有四个插孔，可插入并固定四个反应杯，供盛放待测样品溶液，插入电极进行测定。
电极：为一银-铂电极，装膜后被固定在一有机玻璃外套中，电极套下端稍有倾斜，使插入反应杯时能将气泡集中于一侧，并通过位于该侧与纵轴平行的沟槽排出。
装膜器：可保证安装在电极上的薄膜无皱褶。
自动记录仪：可用上海大华仪表厂生产的多量程自动记录仪。根据不同类型控制器改变量程。
超级恒温水浴：提供循环恒温水以控制反应杯温度。
光源：可用幻灯机聚光灯泡，于灯前放置方型玻璃缸，盛水以隔热，再于缸后放一聚光透镜聚光于反应杯上，使光强大于900μmol·m-2·s-1。
【试剂】
0.5mol/L KCl溶液；0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）；0.1mol/L 碳酸氢钠溶液。
【方法】
1．仪器安装
（1） （1）将四个玻璃反应杯插入标准浴器上部四个孔中，分别罩以两个橡胶“O”型环和尼龙固定器，转动并固定在不锈钢螺栓下。
（2） （2）将浴器线头和记录仪终端插在53型电极控制器后部的插座中。
（3） （3）用乳胶管连接标准浴器和超级水浴（恒温水流应从下口进入）。
（4） （4）用蒸馏水灌满恒温水浴并调到要求温度。
（5） （5）用5350型装膜器把聚乙烯薄膜装到电极上。装上的膜应平整、无皱褶，膜下无气泡。然后将电极插入53型电极控制器后部的塞孔中。
2．调试
（1） （1）检查各部件之间连接是否正确。
（2） （2）接通电源并使水浴达到要求的温度。
（3） （3）关闭电极控制器电源时检查仪表的机械零点。
（4） （4）打开53型控制器电源并放松磁力搅拌制动器，把选择开关旋到AMP零位档。
（5） （5）将3ml空气饱和的蒸馏水和一个磁力搅块放入样品管，等待3min使温度平衡。
（6） （6）制动磁块后，把电极插入样品管中，从狭槽中排出全部空气，然后放松磁块制动器。
（7） （7）调整AMP零位使仪表指针指零。
（8） （8）调整记录仪指针指零。
（9） （9）将选择开关旋到“空气”档，电极开关旋到“电极Ι”，调整“电极Ι”调节螺栓使仪表达满度。
（10）调整53型电极控制器后部“记录仪调整”档，使记录仪指针达满度。
（11）从记录仪图录上观察系统稳定性，图录应无噪音，15min内漂移不大于0.5％。
3．电极的标定及结果计算
通常用在一定温度和大气压下被空气饱和的水中氧含量进行标定。空气饱和水中氧的含量可由手册查出（表20-1）。向反应杯中加入3ml蒸馏水，放松搅拌制动器，搅拌5min左右，使之充分被空气饱和。然后插入电极，将选择开关旋到“空气”档，按前述调试步骤9及10调节使表头及记录仪均达到满度。此时，可根据当时水温查出溶氧量。例如，若水温为25℃，由表上查得饱和溶氧量为0.253μmol/ml，所以3ml水中的总含氧量为3×0.253＝0.759μmol，记录纸上每格代表的含氧量为0.759/100＝0.00759μmol/格。在正式测定时，若加入3ml反应液并经温度平衡后，记录仪指针指在第92格，经过5min反应后，指针移到第66格，则溶液中含氧量降低值为(92～66)×0.00759＝0.197μmol，此即5min内的实际耗氧量。
4．光合速率及呼吸速率的测定
（1）材料准备 取菠菜或蚕豆等植物的功能叶，切成1cm2大小的叶块，放在注射器中加水抽气，使叶肉细胞间隙内的空气排出。然后取出一块再切成1mm×1mm的小块。
（2）呼吸测定 按上述步骤调好仪器后，用蒸馏水洗净反应杯，加入3ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，将总面积为1cm2的小块移入反应杯，电极插入反应杯，注意电极下面不得有气泡。开启电磁搅拌器和恒温水浴，经3～4min，温度达到平衡，用黑布遮住反应杯，开启记录仪，调好走纸速度，待信号稳定后，落下记录笔开始记录。记录笔向左移动约10格即可停止记录。
（3）光合速率测定 测定完呼吸速率后，去掉反应杯上的黑罩，打开光源，灯光应通过盛满冷水的玻璃缸再照射到反应杯上以隔热。照光3～5min后，由于叶片进行光合作用，溶液中溶氧增加，记录笔逐渐向右移动，待信号稳定后，落下记录笔进行记录，记录笔移动约10格即可停止记录。可按照呼吸-光合-呼吸-光合的顺序重复3次。无须更换样品，但测定时间不能太长。
（4）结果计算：
呼吸强度（CO2mg/dm2·h）＝(a×n1×100×60)/(A×t)×(44/1000)
光合强度（CO2mg/dm2·h）＝(a×n2×100×60)/(A×t)×(44/1000)
a－记录纸每小格代表的氧量(μmol)，根据灵敏度标定求得；
A－叶面积（cm2）；
T－测定时间(min)即记录纸走纸距离(mm)/走速(mm/min)；
44/1000－氧气的μmol换算为二氧化碳的mg；
n1－测定呼吸速率时记录笔向左走的小格数；
n2－测定光合速率时记录笔向右走的小格数。
表20-1 不同温度下水中氧的饱和溶解度
温度（℃）
O2（ppm）
O2（μmol/ml）
0
5
10
15
20
25
30
35
14.16
12.37
10.92
9.76
8.84
8.11
7.52
7.02
0.442
0.386
0.341
0.305
0.276
0.253
0.230
0.219

【注意事项】
1.氧电极对温度变化非常敏感，测定时需要维持温度恒定。
2.样品管中不应有气泡，否则会造成指针不稳，记录线扭曲。
3.由黑暗转入照光后，光合作用有一段滞后期，需延迟数min才开始放氧。
4.电极使用一段时间后，会发生污染，灵敏度下降，可用1：1稀释后的氨水清洗10～60秒，然后用蒸馏水清洗干净。
5.所用膜必须无洞，无皱褶，并不能用手接触。为避免经常灌充KCl溶液，不用时可把电极头放在蒸馏水中，以防止膜内水分蒸发引起KCl沉淀。
6.注意洗净样品管以消除遗留在样品溶液中的霉菌或细菌的影响。
【思考题】
1. 1.用氧电极法测定叶碎块光合作用时，测得的数值与在空气中测定（用IRGA法）相比，是偏高还是偏低？为什么？
2.用氧电极法测得光合、呼吸时，为何必须不断搅拌溶液？如果停止搅拌将会出现怎样的现象？如果搅拌速度不均匀将出现什么情况？