银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析_毕楷杰.pdf

植物遗传资源学报 2023，24（3）：829-842DOI：10.13430/ki.jpgr.20220924002Journal of Plant Genetic Resources银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析毕楷杰，孙耀国，杨敏生，张军（河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，保定 071000）摘要：本研究以银腺杨成年树木为对象，测定了不同类型叶片形态、生理和基因表达差异，为揭示银腺杨的成熟效应提供参考。主要研究结果如下：（1）长枝叶和短枝叶的叶片形态差异显著，不同部位的叶片有很大程度的重叠。（2）不同部位叶片所含化合物差异显著，即：下部叶片的叶绿素a和叶绿素总含量显著大于上部和中部；下部叶片的SOD酶活性显著高于上部和中部，MDA含量表现为中部上部下部；下部叶片的淀粉含量显著低于上部和中部；不同部位叶片的IAA含量随着高度的降低而上升，ABA含量表现为中部上部下部；长枝叶的IAA和IAA/ABA显著大于短枝叶，ZR含量呈现相反的变化趋势。（3）基于转录组数据对差异显著基因进行筛选，不同部位叶片之间的差异显著基因数量少于不同类型叶片之间差异显著基因数量。（4）对各比较组的差异显著基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示上部长枝叶相对于下部长枝叶（SC-vs-XC）、上部短枝叶相对于下部短枝叶（SD-vs-XD）差异显著基因显著富集到光合作用通路上，对其中的2个基因进行基因注释，发现这2个基因均编码PsbR蛋白，且下部叶片中基因表达量上调；对生长素转导过程进行分析，发现短枝叶中相关基因表达量均上调。关键词：银腺杨（Populus alba P.glandulosa）；叶片形态；生理特性；转录差异Leaf Morphology and Physiological Analysis of Different Parts of Silver Glandular PoplarBI Kai-jie，SUN Yao-guo，YANG Min-sheng，ZHANG Jun（College of Forestry Science，Agricultural University of Hebei/Hebei Key Laboratory for Tree Genetic Resources and Forest Protection，Baoding 071000）Abstract：In this study，the morphology，physiology and transcriptome of different types of leaves were measured in adult trees of Silver Poplar，which provided a reference for revealing the maturation effect.The main results are listed：（1）The leaf morphology at long branches and short branches was significantly different，and the leaves in different parts overlap to a large extent.（2）The in different parts of leaves was significantly different，and the content of chlorophyll a and total chlorophyll in the lower leaves were significantly higher than those of the upper and middle parts.The SOD enzyme activity in the lower leaves was significantly higher than that in the upper and middle parts.The MDA content was manifested as the middle upper lower par；.The starch content in lower leaves was significantly lower than that in upper and middle leaves；The IAA content of the leaves in different parts increased with the decrease of height，and the ABA content was the middle the upper part the lower part；The IAA and IAA/ABA of leaves at the long branches were significantly larger than those of the short branches，and the ZR content showed an opposite trend.（3）The number of differentially significant genes between different parts of leaves was less than the number of differentially significant genes between different types of leaves based on transcriptome data screening.（4）GO and KEGG enrichment analysis of different genes in each comparison group showed that the genes significantly enriched in the photosynthetic pathway in the upper long branching leaves relative to the lower long branching leaves（SC-vs-XC）and in the 收稿日期：2022-09-24 修回日期：2022-12-07 网络出版日期：2022-12-27URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20220924002第一作者研究方向为林业生物技术，E-mail：通信作者：张军，研究方向为林木遗传育种，E-mail：基金项目：河北省重点研发计划项目（21326301D）Foundation project：Hebei Province Key R&D Project（21326301D）植物遗传资源学报24 卷upper short branching leaves relative to the lower short branching leaves（SD-vs-XD），and gene annotation of two of these genes showed that both genes encoded PsbR proteins，and the gene expression was up-regulated in the lower leaves.The expression of these two genes was found to be up-regulated in the lower leaves，and the analysis of the growth hormone transduction process showed that the expression of the genes was up-regulated in the shorter leaves.Key words：Populus albaP.glandulosa；leaf shape；physiological characteristics；transcriptome difference林木无性繁殖过程中，常伴随着成熟效应和位置效应。当无性繁殖材料因年龄的逐渐变大，随之产生生理衰老的现象，即成熟效应。因无性繁殖材料在原株上生长位置不同而造成影响的现象，称为位置效应。在杨树无性繁殖过程中成熟效应和位置效应常会对无性系造林造成严重影响。有研究表明成熟效应会严重影响扦插繁育和嫁接繁殖的过程1，进而对杨树的无性系造林造成严重影响。成熟效应与繁殖材料的母树年龄有关，繁殖材料衰老程度越深，成熟效应越明显。不仅如此，在同一棵树上，当同种繁殖材料不在同一位置，其组织和成熟度也大不相同。为解析杨树成熟效应和和位置效应形成机制，本研究以银腺杨成年树木为对象，测定了不同部位及同一部位长枝叶和短枝叶形态及生理差异，并基于转录组测序技术探究不同部位和不同类型叶片的基因表达差异，解析不同部位及类型叶片差异的生理及分子机制。1材料与方法1.1试验材料试验材料取自河北省保定市易县洪崖山国有林场七里亭分场，为场区内一株30多年生的银腺杨，于2020年8月初从树体的同一方向分别采集树冠上部（S）、中部（Z）和树干基部（X）（以下简称为：上部、中部和下部）萌生出来的枝条上的功能叶，再分别从这3个部位上采集相对位置一致的长枝叶（C）和短枝叶（D），分别用上部长枝叶（SC）、上部短枝叶（SD）、中部长枝叶（ZC）、中部短枝叶（ZD）、下部长枝叶（XC）、下部短枝叶（XD）表示6种不同处理的叶片。每一项指标的测定均采集相对位置一致的长枝叶和短枝叶（56叶位）。1.2试验方法1.2.1不同部位叶片形态变异分析对同一类型不同部位的叶片（SC/ZC/XC和SD/ZD/XD）分别进行叶片形状差异分析。（1）根据长枝叶和短枝叶的形态特征，在叶片上选取12个标志点，叶片标志点的位置及其描述详见表1和图1。利用Image J2软件对每个叶片上的12个标志点进行标记，用于后续分析。（2）数据的处理把上一步的数据信息导入到Morpho J3中进行分析，分析的第一步，使用普氏叠印法（GPA，generalized procrustes analysis）对不同部位的长枝叶和不同部位的短枝叶进行分析，通过GPA分析可以得到一个样品平均形状的图像化结果。经过去除离群值，对数据进行提取和重新分类4。（3）统计分析根据上一步分析出来的叶片标志点数据，进行主成分分析（PCA，principal component analysis），通过PCA分析找出与叶片形态变化相关的几个主要因素，并且可以发现叶片形态变化的主要特征。1.2.2叶片解剖结构从树体上采集6个不同处理的功能叶各3片，经FAA固定液处理后，根据石蜡制片法5制作永久切片。对每个切片选取3个视野，通过Motic B1Series System Microscope 软件进行拍照、观察并测量叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和细胞结构紧实度（CTR，cell structure compactness）。将测得的数表1叶片标志点位置描述Table 1Description of leaf landmark标志点Landmark123456789101112描述Description叶片与叶柄的连接点叶片的顶端叶片轮廓上能代表叶尖程度的点（叶片左侧）叶片轮廓上能代表叶尖程度的点（叶片右侧）叶片轮廓上能代表叶片最宽部位的端点（叶片左侧）叶片轮廓上能代表叶片最宽部位的端点（叶片右侧）紧接标志点5下边的凹陷点紧接标志点6下边的凹陷点能代表叶基部形状的点（叶片左侧），叶片基部第一个突出的点能代表叶基部形状的点（叶片右侧），叶片基部第一个突出的点能代表叶基部形状的点（叶片左侧），在标志点1和9之间能代表叶基部形状的点（叶片右侧），在标志点1和10之间8303 期毕楷杰等：银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析据取平均值。CTR的计算公式如下：CTR=(栅栏组织厚度/叶片厚度)1001.2.3叶片色素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片，把叶片用蒸馏水洗净吸水纸擦干后，置于液氮中带回实验室，参照李合生6的方法测定叶片光合色素含量。在470、649和665 nm下用紫外分光光度计测定叶片的吸光度值（A470、A649、A665），计算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。计算公式如下：Ca=13.95 A665 6.88 A649Cb=24.96 A649 7.32 A665C类=(1000 A470 2.05 Ca 114.8 Cb)/245叶绿素含量=CVb/S 1000，其中，C 为各光合色素的浓度；S为叶片鲜重；V代表提取液总体积（10 mL）；b为稀释倍数。1.2.4SOD、POD、CAT 酶活性及 MDA 含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片，洗净擦干后用锡箔纸包好，放入液氮中保存，后期进行超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、过氧化物酶（POD，peroxidase）、过氧化氢酶（CAT，catalase）酶活性和丙二醛（MDA，malondialdehyde）含量的测定。测定方法参照李合生6的方法，采用紫外吸收法测定叶片中的CAT含量，采用氮蓝四唑法测定叶片中的SOD含量；采用愈创木酚法测定叶片中的POD含量；采用硫代巴比妥酸法测定叶片中的MDA含量。1.2.5营养元素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片，洗净擦干后用锡箔纸包好，放入液氮中保存，采用考马斯亮蓝法6测定可溶性蛋白含量，利用邹琦7的方法测定淀粉含量，采用国标法8-9测定粗脂肪和粗纤维含量。1.2.6内源激素含量测定从树体的同一方向上采集6个不同处理的功能叶各3片，经过剪碎混合后用于植物内源激素含量的测定。提取内源激素后使用Rigol L3000高效液相色谱仪对样品进行测定，色谱柱为Kromasil C18（250 mm4.6 mm，5 m）反相色谱柱，流动相为甲醇 1%乙酸水=4 6，进样量10 L，流速0.8 mL/min，柱温35，走样时间为40 min，紫外检测波长254 nm。1.2.7转录组测序分析从树体的同一方向上分别采集上部和下部两个部位相对位置一致的长枝叶和短枝叶，每个处理采集3片，作为3次重复，将叶片清洗干净，吸水纸擦干后，用锡箔纸包好后放进液氮中，以备后期转录组测序。转录组测序分析主要包含以下步骤：（1）用植物总RNA提取试剂盒提 取 叶 片 中 的 总 RNA，随 后 用 NanoPhotometer spectrophotometer 和 Agilent2100 bioanalyzer 检 测RNA的纯度和完整性。（2）用带有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，用超声波把mRNA打断。随后以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I 体系下，以 dNTPs 为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。构建好的文库利用NanoPhotometer spectrophotometer和Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA的纯度和完整性。（3）文库质检合格后，利用Illumina HiSeq2500平台进行测序，下机数据通过过滤掉低质量的数据，得到Clean reads。本研究与NCBI版本的毛果杨基因组（Populus trichocarpa-NCBI-NLM（nih.gov）进行比对。（4）利用StringTie v1.3.1软件10进行转录本的重构，并利用RSEM11计算每个样本中基因的表达量，结果再以 FPKM 的形式表现出来。利用DESeq212软件筛选各比较组的显著差异显著基因，筛选的标准为：FDR1。（5）利用clusterProfiler（3.4.4）软件对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。（6）根据转录组测序数据，从4个比较组中的植物激素信号转导途径中寻找与IAA和ABA有关的差异表达基标记点序号同表1Number of leaf landmark is the same as Table 1图1标志点位置Fig.1Location of the landmark831植物遗传资源学报24 卷因，共10个差异表达基因进行RT-qPCR验证（其中上部长枝叶相对于上部短枝叶（SC-vs-SD）、下部长枝叶相对于下部短枝叶（XC-vs-XD）共有6个差异表达基因，上部长枝叶相对于下部长枝叶（SC-vs-XC）内有2个差异表达基因，上部短枝叶相对于下部短枝叶（SD-vs-XD）内有2个差异表达基因）。利用Primer 5.0软件设计每个基因的的特异性引物，内参基因为杨树18s ribosomal基因，每个基因的引物信息见表2。利用反转录试剂盒将每个样本的RNA反转录为cDNA，之后进行RT-qPCR试验。RT-qPCR试验用 2 M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox（SYBRgreen，with anti-Taq）试剂盒，购于北京聚合美生物科技有限公司。试验扩增的体系为10 L 2 M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox，上下游引物各0.5 L，1 L cDNA，8 LddH2O，共20 L，每个样品进行3次生物学重复。PCR反应条件为：95 30 s；95 变性15 s，退火15 s（根据引物设定不同温度），延伸72 30 s，共35个循环。利用2CT法计算基因的相对表达量。1.2.8数据分析使用Excel对数据进行处理，利用SPSS 26.0软件对各项指标进行方差分析和差异显著性检验，利用Origin 2019软件进行作图。2结果与分析2.1不同部位叶片形态变异分析2.1.1叠印后形状利用Morpho J软件对不同部位的长枝叶以及不同部位的短枝叶的标志点数据进行普氏叠印法分析（图 2）。不同部位的长枝叶和短枝叶的散点集中分布在12个标志点（蓝色的点）附近，使所有叶片最大限度地重合，没有多余散点距对应标志点较远，说明GPA分析排除了非形态变异因素带来的差异，较好的表现了叶片形状。表2RT-qPCR引物信息表Table 2Primer sequence for RT-qPCR处理TreatmentSC-vs-SD/XC-vs-XDSC-vs-XCSD-vs-XD引物名称Primer nameLOC7472133LOC7490982LOC7475739LOC7494286LOC7472711LOC7453841LOC7465052LOC18108586LOC7480000LOC7469610正向引物序列（5-3）Forward primer sequence（5-3）ACTACTTACACTGCTTGGTACCGACTAGAAATCACAGAGCTAAGGTTGGGGACTTGAAATCACAGAGCTAAGGTTGGGGAAAGGTTTCATAGCGGTATATGTTGGGAGAAGTATAAGCCATTTGTAAGCAGGTGAAGAGGAGGGATAGGATGTGTTGAGAGTCAGTAATGAACCTTTACGTGCCGAGCTTCGCGTTGTTAAGATAGGAAGTGCAAGAACAGAAGCTACGTATCCAAGCATTTTAGCCCAG反向引物序列（5-3）Reverse primer sequence（5-3）CAATATACTGCTGCTGCTGAAGTCTTCTTTCGATAGGAACATACTGGTGGCTCTTTGTTTGAACTTTTCGGTCATCGGGAAGTGACATCAAGGAAAGTCTCTTCGTAATCTTCATACCAAAAATATGCTCATCGATGAAAGGCTTGTACTTCTGTGGTTGATGGGTTCTTGTTTCAGACTTCACGAAGAACCTCGTAATGGTGCTACTCTCGGAACACAACTAGAGTTTTCTCAGATGTATTCCTCGCTCSC代表上部长枝叶；XC代表下部长枝叶；SD代表上部短枝叶；XD代表下部短枝叶；SC-vs-SD代表上部长枝叶相对于上部短枝叶；XC-vs-XD代表下部长枝叶相对于下部短枝叶；SC-vs-XC代表上部长枝叶相对于下部长枝叶；SD-vs-XD为上部短枝叶相对于下部短枝叶；下同SC represents the upper long branch；XC represents the lower long branch；SD represents the upper short branch；XD represents the lower short branch；SC-vs-SD represents the upper long branch relative to the upper short branch；XC-vs-XD represents the lower long branch relative to the lower short branch；SC-vs-XC represents the upper long branch relative to the lower long branch；SD-vs-XD is the upper short branch relative to the lower short branch；The same as below蓝色点是经Moepho J分析后的标志点，黑色点是不同叶片样本的标志点The blue dot is the marker point after Moepho J analysis，and the black dot is the marker point of different leaf samples图2不同部位之间叶片普氏叠印分析散点图Fig.2Generalize procrustes analysis of the leaf shape between different positions8323 期毕楷杰等：银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析2.1.2不同部位叶片差异可视化分析图3中的A1、B1、C1、D1图展示了不同部位的长枝叶在PC1和PC2轴上的变化趋势，在PC1轴的负方向上，叶片的宽度较大，表现为表示叶尖程度的3个标志点（2、3、4）向内收缩，其他标志点向外扩张；而处于PC1正轴方向的叶片表现出相反的趋势。在PC2轴上，表示叶尖程度的3个标志点变化较小，其他标志点变化较大，在负轴的叶片表现为5、6、7、8标志点向外扩张，表示叶基程度的5个标志点向内收缩，并且叶片最宽处以下部分的叶片发生向左扭曲；当PC2逐渐增大时，叶片的的形状表现出相反的变化。图3中的A2、B2、C2、D2图展示了不同部位的短枝叶在PC1和PC2轴上的变化趋势，在PC1轴的负方向上，叶片的最宽处距叶尖的距离较大，叶片基部距叶片最宽出的距离较小，并且叶片上表现叶尖程度的3个点（2、3、4标志点）向外扩张，5、6、7、8标志点向下延伸，表示叶片基部的5个标志点向内收缩；而处于PC1正轴上的叶片则表现出相反的趋势。在PC2轴的负方向上，叶片较尖，并且叶片基部较窄，叶片更加的狭长，12个标志点都表现为向内收缩；当PC2逐渐增大时，叶片的的形状表现出相反的变化，12个标志点都向外扩张，叶片的叶尖较钝，叶基较宽。叶尖、叶基以及叶片最宽处的变化为叶形变异的主要特征。2.2不同部位及类型的叶片解剖结构分析由图4可知，在长枝叶中，下部叶片的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度均显著小于上部和中部的叶片；而上部叶片的上表皮厚度则显著大于中部和下部。而在短枝叶中，下部叶片的栅栏组织厚度和细胞结构紧实度显著大于上部和中部。5个观测指标中，长枝叶的栅栏组织厚度、细胞结构紧实度均显著大于短枝叶；且长枝叶的栅栏组织厚度占整个叶片厚度的比例更大。每个网格图中深蓝色圆点代表的是叶片的平均形态，线条的末端代表的是每个标志点与叶片平均形态之间的差异，线条的长短代表的是对应标志点的变化幅度，浅蓝色网格的变化即代表叶片的变化趋势。A1：PC2轴的值为0.12时的叶片平均形态；B1：PC2轴的值为0.12时的叶片平均形态；C1：PC1轴的值为0.15时的叶片平均形态；D1：PC1轴的值为0.15时的叶片平均形态。A2：PC2轴的值为0.15时的叶片平均形态；B2：PC2轴的值为0.1时的叶片平均形态；C2：PC1轴的值为0.18时的叶片平均形态；D2：PC1轴的值为0.18时的叶片平均形态；ZC代表中部长枝叶；ZD代表中部短枝叶；下同The dark blue dots in each grid graph represent the average shape of the leaves，the end of the line represents the difference between each marker point and the average shape of the leaves，the length of the line represents the change amplitude of the corresponding marker point，and the change of the light blue grid represents the change trend of the leaves.Average leaf shape with PC2 axis values of 0.12（A1）and 0.12（B1）；Average leaf shape with PC1 axis values of 0.15（C1）and 0.15（D1）.Average leaf shape with PC2 axis values of 0.15（A2）and 0.1（B2）；Average leaf shape with PC1 axis values of 0.18（C2）and 0.18（D2）；ZC represents the middle long branch；ZD represents the middle short branch；The same as below图3不同部位之间叶片形态主成分分析散点图及网格轮廓图Fig.3Principal component analysis and outline variation of the leaf share between different positions833植物遗传资源学报24 卷2.3不同部位及类型叶片生理指标分析2.3.1叶片光合色素含量差异由图5可知，不同部位叶片的光合色素含量差异显著，在长枝叶中，下部叶片的叶绿素a、叶绿素总含量都显著大于上部和中部；在短枝叶中，下部叶片的叶绿素a、类胡萝卜素含量和叶绿素总含量显著大于其他两个部位。长枝叶和短枝叶的光合色素含量对比中，不同类型叶片的类胡萝卜素含量存在差异，在不同部位呈现不同的变化趋势，在下部，短枝叶的类胡萝卜素含量大于长枝叶。2.3.2叶片抗氧化酶分析由图6可知，不同部位的SOD酶活性和MDA含量存在显著差异且具有明显的变化趋势，下部叶片的SOD酶活性显著高于上部和中部，不同部位的长枝叶和不同部位的短枝叶的MDA含量均表现为中部上部下部。SOD酶活性在长枝叶和短枝叶中差异显著，在不同部位中呈现不同的变化规律，上部的长枝叶和短枝叶未表现出显著差异，下部和中部均表现为短枝叶长枝叶。图中的比例尺为50 mThe scale bar in the figure is 50 m图4不同部位及类型叶片横切结构（40）Fig.4Blade cross-cutting structure of different positions and types（40）图中的小写字母代表同一类型不同部位在P0.05水平下的差异显著性；大写字母代表每个部位不同类型叶片在P0.05水平下的差异显著性；下同The lowercase letters in the figure represent the difference in the difference between different parts of the same type at the level of P0.05 and the uppercase letters represent the difference in the significance of the difference between different types of leaves in each part at the level of P上部下部的趋势，下部叶片的ZR含量显著小于上部和中部，IAA/ABA值则是下部显著大于上部和中部，不同部位的GA3含量在不同叶片类型中呈现不同的变化趋势。长枝叶和短枝叶的激素含量存在显著差异。长枝叶和短枝叶在观测的5个指标中均差异显著，长枝叶的IAA含量、IAA/ABA值均显著大于短枝叶，ZR含量呈现相反的变化趋势，长枝叶和短枝叶的ABA含量和GA3含量存在显著差异，在不同部位中的变化趋势不同。2.4不同部位及类型叶片转录组测序分析2.4.1转录组数据质量分析对12个样品进行转录组测序共获得79.3 Gb的数据，531193874条Clean reads。平均每个样本的数据量为6.6 Gb。各样本GC含量均大于43%，Q20和Q30的碱基百分比分别在98%和94%左右。利用HISAT2软件，将测序得到的序列与毛果杨参考基因组进行比对，比对结果显示各样本的总映射（Total_Mapped）都超过了70%，非重复映射（Unique_Mapped）在68.83%72.33%之间，多重映射（Multiple_Mapped）在2.78%3.18%之图8不同部位及类型叶片内源激素含量差异Fig.8Difference of endogenous hormone content in different parts and types8363 期毕楷杰等：银腺杨不同部位叶片形态、生理及转录差异分析间。从上面的结果可以看出，转录组测序数据质量较好，可以用于后续生物信息学分析。2.4.2不同比较组间差异显著基因分析图9A结果显示，由不同类型叶片（上部长枝叶相对于上部短枝叶（SC-vs-SD）、下部长枝叶相对于下部短枝叶（XC-vs-XD）所引起的差异显著基因数量明显多于不同部位叶片（上部长枝叶相对于下部长枝叶（SC-vs-XC）、上部短枝叶相对于下部短枝叶（SD-vs-XD）引起的差异显著基因数量。此外，上部长枝叶相对于下部长枝叶的上调基因数量大于下调基因数量，而其他3个比较组的上调基因数量都小于下调基因数量。差异显著基因维恩图可以看出不同比较组中共有和特有的差异显著基因数量，从图9B可以看出，上部长枝叶相对于下部长枝叶和上部短枝叶相对于下部短枝叶之间共有的差异显著基因有32个。上部长枝叶相对于上部短枝叶和下部长枝叶相对于下部短枝叶之间共有的差异显著基因有7380个。2.4.3差异表达基因的GO功能注释和富集分析（1）不同部位叶片比较组分析，上部长枝叶相对于下部长枝叶差异显著基因富集在344个GO条目上，其中细胞组分中富集到34个条目上，分子功能中富集到94个条目上，生物学过程中富集到216个条目上。上部短枝叶相对于下部短枝叶差异显著基因共富集到655个GO条目上，其中细胞组分中富集到68个条目上；分子功能中富集到158个条目上；生物学过程中富集到399个条目上。如图10A所示，涉及生物学过程的差异表达基因显著富集在单一生物代谢过程（Single-organism metabolic process）、三萜类生物合成过程（Triterpenoid biosynthetic process）和氨基糖代谢过程（Aminoglycan metabolic process）、细胞过渡金属离子稳态（Cellular transition metal ion homeostasis）等GO 条目上。涉及分子功能的差异表达基因显著富集在氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）和氧化还原酶活性，作用于成对的供体上，并结合或还原分子氧，还原的黄素或黄素蛋白作为一 个 供 体，并 结 合 一 个 氧 原 子（Oxidoreductase activity，acting on paired donors，with incorporation or reduction of molecular oxygen，reduced flavin or flavoprotein as one donor，and incorporation of one atom of oxygen）等GO条目上；涉及细胞组分的差异表达基因显著富集在细胞间连接（Cell-cell junction）、细胞连接（Cell junction）和膜部分（Membrane part）等GO条目上。总体来说，不同部位叶片差异表达基因在细胞组分主要富集到细胞间连接、膜和膜的固有成分GO条目上；在分子功能主要富集到结合过程、氧化还原酶活性GO条目上；在生物学过程主要富集到生物合成过程、代谢过程和金属离子稳态GO条目上。（2）不同类型叶片比较组分析，上部长枝叶相对于上部短枝叶差异显著基因共富集到1831个GO条目上，其中富集到细胞组分、分子功能和生物学过程上的数量分别是170、437和1224个。下部长枝叶相对于下部短枝叶差异显著基因共富集到1934个GO条目上，其中富集到细胞组分、分子功能和生物学过程上的数量分别是181、449和1304个。从图10B可以看出，下部长枝叶相对于下部短枝叶涉及生物学过程的差异表达基因显著富集在分生组织发育的调控、苯丙烷代谢过程和分生组织发展等GO条目中；涉及分子功能的差异表达基因显著富集在微管蛋白A表示不同比较组上调和下调基因数量图。B表示不同比较组之间差异显著基因韦恩图。其中，图B左图表示不同类型叶片比较组差异显著基因韦恩图，图B右图表示不同部位叶片比较组差异显著基因韦恩图。图B中每一个圆圈内数字表明相对应比较组的差异显著基因数量，圆圈重叠处数字为两个比较组之间共有的差异显著基因数量A represents the number of up-regulated and down-regulated genes in different comparison groups.B represents the Wayne map of different genes between different comparison groups.Among them，the left figure of figure B shows the Wayne map of different types of leaf comparison groups，and the right figure of figure B shows the Wayne map of different types of leaf comparison groups.In figure B，the number in each circle indicates the number o