小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究_万永乐.pdf

收稿日期:2022-07-29 基金项目:国家发展改革委藏粮于地藏粮于技专项（发改投资2021430 号），2022 年度安徽省科技重大专项（202203a06020016）和农业农村部 2022 年农产品质量安全监管专项（农药）（15227023）共同资助。作者简介:万永乐，硕士研究生。E-mail：W*通信作者:毕亚玲，博士，教授。E-mail：byl- 安徽农业大学学报,2023,50(3):416-422 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.023 网络出版时间：2023-06-26 15:24:51 URL https:/ 小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究 万永乐1，戴玲玲1，邢雨诚2，孙倩倩1，项 晶1，毕亚玲2*(1.安徽科技学院资源与环境学院，凤阳 233100；2.安徽科技学院农学院，凤阳 233100)摘 要：为明确小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性情况及潜在的抗药性机制，应用整株生物测定法测定了采自安徽省、江苏省多个日本看麦娘发生严重地区共 19 个日本看麦娘种群对唑啉草酯的抗药性水平，并选取 6 个高抗种群进行 ACCase 基因测序和 GSTs 活性测定，比较抗药性、敏感种群间的基因序列和 GSTs 活性差异，同时测定了 AH-29 对其他 8 种除草剂的敏感性。结果显示，9 个日本看麦娘种群对唑啉草酯产生了高水平抗性，占被测总数的 47.37%，抗性指数在 12.70 38.77 之间；种群 AH-28、AH-29 和 JS-15 的 ACCase 基因 CT 区域第 1781位异亮氨酸（ATA）突变为亮氨酸（TTA），种群 AH-36 和 JS-16 第 2027 位色氨酸（TGG）突变为半胱氨酸（TGT），种群 AH-34 未发现突变；6 个高抗种群体内 GSTs 活性经唑啉草酯处理后均明显高于同处理敏感种群 AH-7；种群AH-29 均对 ACCase 抑制剂炔草酯、烯草酮以及 ALS 抑制剂的甲基二磺隆和氟唑磺隆产生了高水平抗性，抗性指数分别为 45.32、29.54、37.53 和 23.04；对三甲苯草酮产生了中水平抗性，对双草醚和啶磺草胺表现低抗，但对PSII 抑制剂异丙隆较为敏感。研究表明，ACCase 基因突变与 GSTs 活性增强是导致日本看麦娘种群对唑啉草酯产生抗药性的重要原因之一。关键词：日本看麦娘；唑啉草酯；江淮地区；抗药性；交互抗性 中图分类号：S481.4;S482.4 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0416-07 Study on resistance mechanism of Alopecurus japonicus to pinoxaden in wheat field WAN Yongle1,DAI Lingling1,XING Yucheng2,SUN Qianqian1,XIANG Jing1,BI Yaling2(1.College of Resource and Environment,Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100;2.College of Agriculture,Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100)Abstract:In order to clarify the resistance level and possible resistance mechanism of Alopecurus japonicus to pinoxaden in wheat field,the resistance level of 19 A.japonicus populations in Anhui Province and Jiangsu Province to pinoxaden were determined by whole-plant bioassay.The ACCase gene sequencing and GSTs activity determina-tion were performed on the six populations with the highest resistance to compare the difference in gene sequences and GSTs activity between resistant and sensitive populations,and the sensitivity of AH-29 to other eight herbicides was also determined.The results showed that the nine A.japonicus populations had high level resistance to pinoxa-den,accounting for 47.37%of the total tested population,and the resistance indices ranged from 12.70 to 38.77.Iso-leucine(ATA)was mutated to leucine(TTA)at position 1781 of ACCase gene CT region in AH-28,AH-29 and JS-15,and tryptophan(TGG)to cysteine(TGT)at position 2027 of ACCase gene in AH-36 and JS-16.No mutation was found in population AH-34.The GSTs activity in six resistant populations was higher than that in susceptible population AH-7 after treated with pinoxaden.Population AH-29 showed high level of resistance to the acetyl-CoA carboxylase(ACCase)inhibitor clodinafop-propargyl,clethodim,and acetolactate synthase(ALS)inhibitor mesosulfuron-methyl and flucarbazone-sodium,with RI value of 45.32,29.54,37.53 and 23.04,respectively.In ad-dition,AH-29 showed moderate resistance to tralkoxydim,low resistance to bispyribac-sodium and pyroxsulam,but it was sensitive to photosynthetic II(PSII)inhibitor isoproturon.The increases of ACCase gene mutations and the GSTs activity were very likely the reasons resulting in pinoxaden resistance of A.japonicus populations.50 卷 3 期 万永乐等:小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究 417 Key words:Alopecurus japonicus;pinoxaden;Jianghuai region;resistance;cross-resistance 日本看麦娘Alopecurus japonicus是我国麦田主要恶性禾本科杂草，具有抗逆性强、分蘖旺盛等竞争优势，在黄河及长江中下游流域等地的稻麦轮作区危害十分严重1-2。目前，生产上仍以化学防除为主3。乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACCase）抑制剂类除草剂通过减少杂草体内ACCase 参与的羧化反应，使其合成脂肪酸受阻而死亡，具有活性高、毒性低、选择性强等优点，被广泛用于麦田防除禾本科杂草4-5。但随着其长期、大量使用，加之作用靶标位点单一，导致多种禾本科杂草逐渐对其产生抗药性6。自 1986 年首次发现澳大利亚硬直黑麦草 Lolium rigidum 对该类除草剂产生抗药性以来，截至 2022 年 5 月，全球已有 50种杂草对 ACCase 类除草剂产生了抗药性7-8。现关于杂草抗 ACCase 类除草剂机理的研究多集中在靶标抗性（TSR）和非靶标抗性（NTSR）两方面9-11。靶标抗性主要是杂草体内 ACCase 酶基因发生突变而产生。目前已证实有 7 个 ACCase 基因突变位点氨基酸可以发生改变，分别为第 1781、1999、2027、2041、2078、2088 和第 2096 位，且同一位点发生不同的氨基酸突变类型可导致对不同除草剂产生抗药性12-13。非靶标抗性主要是杂草代谢解毒机制通过增强GSTs和P450等代谢酶系的活动完成，使得杂草体内到达靶标酶的除草剂分子数量减少，从而减轻对杂草的伤害14。唑啉草酯（pinoxaden）是先正达公司研发的一种新苯基吡唑啉（phenylpyrazoline,PPZ）类除草剂，因其作用靶标既不同于 ALS 类除草剂，虽同为ACCase 抑制剂类除草剂，但作用位点不同于芳氧苯氧基丙酸酯类（aryloxyphenoxypropionates,APP）和环己烯酮类（cyclohexanediones,CHD）除草剂，被广泛用于小麦田中防除已产生抗药性的禾本科杂草15-16。但近年来，本课题组于田间杂草调查时发现，江淮部分地区唑啉草酯已不能对日本看麦娘进行有效防除，可能与其对唑啉草酯产生抗药性有关。目前，毕亚玲17、李蓉荣18 等曾有关于对日本看麦娘对唑啉草酯产生交互抗性的报道，而其具体产生抗药性的机制还未见阐述。为此，本研究在江淮地区日本看麦娘发生严重的小麦田采集部分日本看麦娘种群，明确其对唑啉草酯的抗药性水平、比较抗药性与敏感种群的基因序列和GSTs酶活性差异，同时测定了其对不同类型除草剂的抗药性情况，旨在为小麦田抗药性日本看麦娘综合治理及除草剂科学合理施用提供理论依据。1 材料与方法 1.1 供试材料 日本看麦娘种子：2019 年在江淮不同区域小麦田采集 19 个日本看麦娘种群；敏感种群 AH-7 为实验室已知的日本看麦娘种群17，采集自安徽省滁州市凤阳县非耕地，该地块从未使用过除草剂。ACCase 抑制剂用药背景等具体信息详见表 1，供试除草剂及剂型见表 2。表 1 日本看麦娘各种群种子采集地点 Table 1 Collection sites information of A.japonicus 种群编号 采集地点 用药历史 种群编号 采集地点 用药历史 AH-7 安徽省滁州市凤阳县非耕地 未用药 AH-35 安徽省淮南市寿县保义镇 约 7 年 AH-26 安徽省淮南市寿县戈店镇 约 9 年 AH-36 安徽省淮南市寿县堰口镇 约 8 年 AH-27 安徽省淮南市寿县安丰塘镇 不详 AH-37 安徽省淮南市寿县堰口镇 约 6 年 AH-28 安徽省滁州市天长市桐城镇 约 8 年 AH-38 安徽省淮南市寿县小甸镇 约 8 年 AH-29 安徽省滁州市定远县炉桥镇 约 9 年 AH-39 安徽省滁州市定远县永康镇 约 6 年 AH-30 安徽省淮南市凤台县夏集镇 不详 JS-13 江苏省泰州市姜堰区姜堰镇 约 5 年 AH-31 安徽省滁州市定远县炉桥镇 不详 JS-14 江苏省南京市溧水区明觉镇 约 6 年 AH-32 安徽省蚌埠市五河县小圩镇 约 5 年 JS-15 江苏省淮安市盱眙县黄花镇 约 8 年 AH-33 安徽省蚌埠市淮上区梅桥镇 约 6 年 JS-16 江苏省淮安市盱眙县马坝镇 约 8 年 AH-34 安徽省蚌埠市怀远县双沟镇 约 8 年 JS-17 江苏省扬州市江都区郭村镇 约 7 年 试剂和仪器：Tris-HCl，上海麦克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine-tetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na）和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,CTAB），国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone,PVP），上海418 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 晶纯试剂有限公司；还原型谷胱甘肽（GSH），上海蓝季试剂有限公司；2,4-二硝基氯苯（CDNB），上海浩然生物技术有限公司；SHP-150 生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；HCL-2000 行走式喷雾塔，昆山恒创力科技有限公司；TP-96G PCR 扩增仪，德国耶拿分析仪器股份公司；GTR10-2 高速冷冻离心机，日立（中国）有限公司；JY600E 电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。表 2 供试除草剂及施药剂量 Table 2 Test herbicides and dose 药剂 生产厂家 剂量/g(a.i.)hm-2 抗药性种群 敏感种群 5%唑啉草酯乳油 瑞士先正达作物保护有限公司 0、22.5、45、90、180、360 0、5.63、11.25、22.5、45、90 15%炔草酯可湿性粉剂 瑞士先正达作物保护有限公司 0、45、90、180、360、720 0、5.63、11.25、22.5、45、90 240 g/L 烯草酮乳油 山东奥坤作物科学股份有限公司 0、72、144、288、576、1 152 0、9、18、36、72、144 40%三甲苯草酮水分散粒剂 江苏省农用激素工程技术研究中 心有限公司 0、120、240、480、960、1 920 0、30、60、120、240、480 100 g/L 双草醚悬浮剂 浙江中山化工集团股份有限公司 0、7.5、15、30、60、120 0、3.75、7.5、15、30、60 7.5%啶磺草胺水分散粒剂 科迪华农业科技有限责任公司 0、3、6、12、24、48 0、1.5、3、6、12、24 30 g/L 甲基二磺隆油悬浮剂 拜耳作物科学（中国）有限公司 0、13.5、27、54、108、216 0、1.69、3.38、6.75、13.5、27 70%氟唑磺隆水分散粒剂 浙江天一生物科技有限公司 0、31.5、63、126、252、504 0、3.94、7.86、15.75、31.5、63 50%异丙隆可湿性粉剂 安徽省圣丹生物化工有限公司 0、93.75、187.5、375、750、1 500 0、93.75、187.5、375、750、1 500 注：加下划线的数字表示该药剂的田间推荐剂量。1.2 试验方法 1.2.1 抗药性水平测定 采用整株水平生物测定法，参照农药室内生物测定试验准则GB NY/T 1155.42006 进行19。分别选取足量、饱满度相对一致的日本看麦娘种子，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于生化培养箱内（光照（L/D）=12 h/12 h；温度：25/15）催芽，待多数试材露白后，每盆固定 15 粒播种到装有 4/5 体积基质的塑料盆中（直径 12 cm，高 10 cm），覆土 0.5 1.0 cm。在温室内（温度 10 22、相对湿度 55%70%）进行培养，采用盆底渗吸的方式使土壤保持湿润。待日本看麦娘一叶一心期，每盆间苗至 10 株。供试剂量参照预试验结果，按等比比例设计浓度，具体剂量见表 2。药剂配制根据浓度设定，用清水定容配制成高浓度母液，使用母液稀释梯度法稀释至所需浓度，各种群均单独设置空白对照，喷施等量清水，每处理设 4 次重复。待日本看麦娘长至三叶一心，使用 HCL-2000 型号行走式喷雾塔均匀喷雾，扇形喷头距叶片最高点 50 cm，喷液压力275 kPa，喷雾量 450 L hm-2，喷药后继续将幼苗放于温室培养。药后 21 d，剪取植株地上部分置于80 烘箱中烘至重量不再变化，称取干重并计算干重抑制率，干重抑制率/%=（对照干草重处理干草重）/对照干草重 100。1.2.2 抗药性、敏感日本看麦娘种群 ACCase 基因检测 依据抗药性水平测定结果，选取 6 个高抗种群（AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15 和 JS-16）和 1 个敏感种群（AH-7）进行 ACCase 基因检测。日本看麦娘培养和施药方法同 1.2.1。待日本看麦娘长至三叶一心时，采用 CTAB 法20对各种群幼嫩叶片进行 DNA 提取。由已知的日本看麦娘 ACCase基因序列（JQ068820.1）设计引物（ACC-F:5-TTTC CCAGCGGCAGACAGAT-3，ACC-R:5-TCCCTGG AGTCTTGCTTTCA-3）进行 PCR 扩增。反应体系共 25 L，包括：9.5 L 的 ddH2O，12.5 L 2 Es Taq MasterMix，1 L 基因组 DNA，10 molL-1的前引物和后引物各 1 L。PCR 反应条件：94 预变性 5 min；94 变性 1 min，55 退火 50 s，72 延伸 2 min，34 个循环；72 终延伸 10 min。回收 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的条带的凝胶送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。参照大穗看麦娘 Alopecurus myosuroides 的 ACCase氨基酸序列全长(AJ310767)，使用 DNAMAN 5.2.2软件比对测序结果的碱基差异。1.2.3 GSTs 活性测定 为进一步明确唑啉草酯对日本看麦娘体内 GSTs 活性的影响，供试种群同1.2.2，试验方法同 1.2.1。唑啉草酯施药量为 45 g(a.i.)hm-2，空白对照喷施等量清水，设 4 次重复。分别于药后 0、1、3、5、7、9 和 12 d 剪取各种群地上部分幼嫩组织，并放入80 冰箱保存备用。GSTs 粗酶液提取：切取 0.5 g 叶片并加入液氮进行研磨，待叶片组织成粉状后加入 8 mL 提取液50 卷 3 期 万永乐等:小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究 419 继续研磨，提取液主要成分有 0.1 mol L-1 Tris-HCl、5%PVP（W/V）和 25 mmol L-1还原型 GSH，pH 值为 8.0。研磨完成后，1 690 g 离心 10 min，取上清液。GSTs 活性测定：根据毕亚玲21等方法，取 0.1 mL 粗酶液和 3 mL 0.1 mol L-1 Tris-HCl 缓冲液至具塞管中水浴保温 10 min，温度为 25，再加入 0.1 mL 13 mmol L-1的 CDNB 测定液反应 10 min，测量340 nm 处的吸光度值，计算 GSTs 活性。GSTs 活性nmol（min-1 mg-1）=吸光度值1 000/（粗酶液蛋白质浓度9.5）。通过处理组 GSTs 活性与同日对照组 GSTs 活性的比值得出 GSTs 相对活性。1.2.4 日本看麦娘对其他除草剂的敏感性测定 依据抗药性水平测定结果，选取抗药性最高种群AH-29，按照 1.2.1 所述方法，分别测定其与敏感种群 AH-7 对 8 种除草剂的敏感性，具体施药剂量见表 2。1.3 数据处理 使用 Origin 2018 对日本看麦娘 GSTs 相对活性进行比较，DPS 7.05 软件进行数据分析，以日本看麦娘干重抑制率几率值（y）与施药量对数值（x）建立回归方程（y=a+b x），并计算各药剂对各种群的有效中量（GR50）和 95%置信限。抗性指数（resistance index，RI）=抗药性种群 GR50/敏感种群 GR50。分级标准如下，敏感，RI2；低水平抗性，2RI5；中水平抗性，5RI10；高水平抗性，RI10.0022。2 结果与分析 2.1 不同日本看麦娘种群对唑啉草酯抗药性水平 供试 20 个日本看麦娘种群中，除已知敏感种群AH-7外，9个种群对唑啉草酯表现出高水平抗性，占种群总数的47.37%，GR50在100.24 305.88 g(a.i.)hm-2之间，与敏感种群相比，抗性指数在 12.70 38.77 之间。剩余中抗种群为 4 个，低抗种群为 1 个，5 个种群仍对唑啉草酯表现敏感（表 3）。M：DNA Marker DL2000。图 1 质体型 ACCase 基因 CT 区域扩增结果 Figure 1 Amplification of fragments of ACCase genes 表 3 不同日本看麦娘种群对唑啉草酯的抗药性水平 Table 3 Resistant level of different populations of A.japonicus to pinoxaden 种群编号 回归方程 相关系数(r)GR50(g(a.i.)hm-2)(95%CL)抗性指数 AH-7 y=3.343 4+1.847 0 x 0.982 6 7.89（6.31 9.86）1.00 AH-26 y=1.315 5+2.777 6x 0.951 8 187.81（120.10 293.69）23.80 AH-27 y=3.739 3+1.170 5x 0.994 9 11.93（9.22 15.44）1.51 AH-28 y=1.168 6+2.681 5x 0.944 3 199.72（121.34 328.72）25.31 AH-29 y=0.285 9+0.186 7x 0.985 8 305.88（226.04 413.93）38.77 AH-30 y=3.834 9+1.107 4x 0.983 5 11.27（6.99 18.20）1.43 AH-31 y=3.769 9+1.283 8x 0.987 1 9.08（5.75 14.35）1.15 AH-32 y=3.189 6+1.599 9x 0.964 9 13.54（7.02 26.10）1.72 AH-33 y=0.265 0+2.818 2x 0.986 4 47.88（38.44 59.64）6.07 AH-34 y=0.096 2+2.253 2x 0.947 0 182.72（114.87 290.65）23.16 AH-35 y=1.357 2+2.953 7x 0.970 7 141.99（104.88 192.23）18.00 AH-36 y=1.651 6+2.997 2x 0.967 6 165.69（117.79 233.07）21.00 AH-37 y=3.454 0+1.277 5x 0.946 7 16.22（7.58 34.71）2.06 AH-38 y=0.037 8+2.259 4x 0.912 9 157.12（88.80 278.02）19.91 AH-39 y=1.054 4+2.093 1x 0.992 8 76.74（67.04 87.85）9.73 JS-13 y=3.820 0+1.266 8x 0.979 2 8.54（4.70 15.52）1.08 JS-14 y=0.060 4+2.862 8x 0.987 5 53.15（43.16 64.99）6.74 JS-15 y=0.227 0+2.385 3x 0.968 1 100.24（75.08 133.83）12.70 JS-16 y=1.489 3+2.973 0 x 0.977 8 152.31（116.32 199.44）19.30 JS-17 y=0.158 5+2.554 9x 0.989 2 78.52（66.49 92.72）9.95 2.2 抗药性、敏感日本看麦娘种群 ACCase 基因差异 引物扩增区域包含已证实的 7 个氨基酸碱基突变位点，ACCase 基因扩增序列长度为 1 437 bp，序列比对结果显示种群 AH-7、AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15 和 JS-16 的 ACCase 基因扩增片段与GenBank 登录的质体型 ACCase 基因（JQ068820.1）420 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 的同源性分别为 99.83%、99.71%、99.65%、99.70%、99.85%、99.61%、99.78%和 99.89%，表明扩增序列为目标序列（图 1）。图 2 唑啉草酯对抗药性和敏感日本看麦娘种群 GSTs相对活性的影响 Figure 2 Effects of pinoxaden on relative GSTs activities of the resistant and susceptible populations of A.japonicus 目标序列与大穗看麦娘对应序列分析结果表明，种群 AH-28、AH-29 和 JS-15 第 1781 位碱基由ATA 突变为 TTA，导致异亮氨酸突变为亮氨酸；种群 AH-36 和 JS-16 第 2027 位碱基由 TGG 突变为TGT，导致色氨酸突变为半胱氨酸；种群 AH-34 未发现突变（表 4）。2.3 唑啉草酯对日本看麦娘 GSTs 活性的影响 供试抗药性种群经唑啉草酯药剂处理后体内的GSTs 活性迅速上升，均高于敏感种群 AH-7。药后5 7 d，抗药性种群体内的 GSTs 活性上升至最大值，表明此时各种群体内对唑啉草酯的代谢反应水平最高；然后 GSTs 活性逐渐降低，分析可能是其对唑啉草酯代谢趋于完成。而敏感种群 AH-7 在活性下降期间伴随着药效症状的显现，最终植株死亡，表明抗药性种群体内 GSTs 对唑啉草酯具有更强的代谢能力（图 2）。2.4 抗唑啉草酯日本看麦娘种群对其他除草剂的敏感性 测定结果显示，相较于敏感种群 AH-7，AH-29对 ACCase 抑制剂炔草酯、烯草酮，ALS 抑制剂甲基二磺隆和氟唑磺隆产生了高水平抗性，抗性指数分别为 45.32、29.54、37.53 和 23.04；并对三甲苯草酮、双草醚和啶磺草胺产生了中水平或低水平抗性，抗性水平分别为 6.47、3.10 和 4.08，但对 PSII抑制剂异丙隆依旧敏感（1.86），仍可使用该药剂对日本看麦娘进行防除（表 5）。表 4 不同抗药性日本看麦娘种群 ACCase 基因序列比较 Table 4 Sequences alignment of ACCase genes from different resistant A.japonicus populations 种群 各氨基酸的位置和碱基及相应氨基酸序列 1777 1778 1779 1780 1781 1782 1783 1784 1785 1786 大穗看麦娘 GGT GTG GAG AAC ATA CAT GGA AGT GCT GCT Gly Val Glu Asn Ile His Gly Ser Ala Ala AH-7 GGT GTG GAG AAC ATA CAT GGA AGT GCT GCT Gly Val Glu Asn Ile His Gly Ser Ala Ala AH-28 GGT GTG GAG AAC TTA CAT GGA AGT GCT GCT Gly Val Glu Asn Leu His Gly Ser Ala Ala AH-29 GGT GTG GAG AAC TTA CAT GGA AGT GCT GCT Gly Val Glu Asn Leu His Gly Ser Ala Ala JS-15 GGT GTG GAG AAC TTA CAT GGA AGT GCT GCT Gly Val Glu Asn Leu His Gly Ser Ala Ala 种群 各氨基酸的位置和碱基及相应氨基酸序列 2021 2022 2023 2024 2025 2026 2027 2028 2029 2030 大穗看麦娘 CTG TTC ATA CTT GCT AAC TGG AGA GGC TTC Leu Phe Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe AH-7 CTG TTC ATA CTT GCT AAC TGG AGA GGC TTC Leu Phe Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe AH-36 CTG TTC ATA CTT GCT AAC TGT AGA GGC TTC Leu Phe Ile Leu Ala Asn Cys Arg Gly Phe JS-16 CTG TTC ATA CTT GCT AAC TGT AGA GGC TTC Leu Phe Ile Leu Ala Asn Cys Arg Gly Phe 注：下划线表示该位点发生氨基酸突变。50 卷 3 期 万永乐等:小麦田日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性机制研究 421 表 5 抗药性日本看麦娘种群对 8 种除草剂的敏感性 Table 5 Sensitivity of the resistance A.japonicus populations to other eight herbicides 供试药剂 种群编号 回归方程 相关系数 GR50(g(a.i.)hm-2)(95%CL)抗性指数 15%炔草酯可湿性粉剂 AH-7 y=2.992 3+1.893 3x 0.979 7 11.49（8.73 15.13）1.00 AH-29 y=0.769 6+1.557 2x 0.956 5 520.79（316.21 857.74）45.32 240 g L-1烯草酮乳油 AH-7 y=1.938 2+2.292 1x 0.983 2 21.67（17.18 27.33）1.00 AH-29 y=1.845 9+1.123 9x 0.970 4 640.18（448.25 914.30）29.54 40%三甲苯草酮水分散粒剂 AH-7 y=1.829 8+0.985 2x 0.985 2 69.22（55.46 86.39）1.00 AH-29 y=0.376 2+2.063 9x 0.991 6 402.55（347.57 466.36）6.47 100 g L-1双草醚悬浮剂 AH-7 y=3.316 7+1.506 0 x 0.983 8 13.11（10.70 16.08）1.00 AH-29 y=2.326 3+1.661 6x 0.984 5 40.65（33.06 50.00）3.10 7.5%啶磺草胺水分散粒剂 AH-7 y=3.876 2+1.709 4x 0.990 8 4.54（3.88 5.32）1.00 AH-29 y=2.651 9+1.852 4x 0.986 9 18.52（15.18 22.59）4.08 30 g L-1甲基二磺隆油悬浮剂 AH-7 y=4.202 1+0.081 3x 0.995 6 3.40（3.00 3.84）1.00 AH-29 y=1.862 8+1.489 8x 0.988 9 127.61（102.27 159.23）37.53 70%氟唑磺隆水分散粒剂 AH-7 y=2.735 8+2.228 7x 0.957 7 10.37（7.22 14.90）1.00 AH-29 y=0.654 0+1.827 4x 0.969 3 238.94（170.79 334.28）23.04 50%异丙隆可湿性粉剂 AH-7 y=0.863 1+2.328 0 x 0.987 5 330.02（275.98 394.63）1.00 AH-29 y=0.730 6+2.055 6x 0.971 7 613.55（453.84 829.49）1.86 3 讨论与结论 日本看麦娘对唑啉草酯的抗药性产生可能与其用药历史有关。有研究表明，ACCase 类除草剂连续使用 6 10 年就能导致杂草对其产生抗药性23。目前，国内已报道有多种杂草对该类除草剂产生了抗药性，如看麦娘 Alopecurus aequalis24、耿氏硬草 Sclerochloa kengiana25等，其所在地块已连续多次使用 ACCase 抑制剂防除田间杂草，表明连续使用单一作用机制的除草剂是杂草抗药性产生的重要原因之一。自 2010 年唑啉草酯在我国正式获得登记后，其在田间的应用已超过 10 年，近年来，唑啉草酯对安徽、江苏等小麦主产区日本看麦娘的防治效果逐渐下降，本研究所测的 19 个日本看麦娘种群中，已有 9 个种群对唑啉草酯产生了高水平抗性，这一事态应引起重视。本研究中种群 AH-28、AH-29 和 JS-15 发生了Ile-1781-Leu 的氨基酸突变形式，种群 AH-36 和JS-16 发生了 Trp-2027-Cys 突变，该 2 种突变形式已在多种杂草中被发现，Yu 等26报道 Ile-1781-Leu突变是导致野燕麦Avena fatua对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要靶标分子机制。D lye 等27在抗ACCase 类除草剂的大穗看麦娘体内发现了 Trp-2027-Cys 突变。表明 ACCase 基因第 1781 与 2027位突变同样可能是导致上述日本看麦娘种群对唑啉草酯表现为抗药性的重要原因之一。代谢酶 GSTs 是能够催化谷胱甘肽与其他化合物相连接从而使植物体达到脱毒的一组同工酶，其介导的代谢活性增强是造成杂草产生抗药性的非靶标抗性机理方面的一种重要原因15。韩瑞娟等28报道，抗药性日本看麦娘种群体内 GSTs 代谢反应水平经高效氟吡甲禾灵处理后明显高于同处理敏感种群。本研究中，各抗药性种群经唑啉草酯药剂处理后体内的 GSTs 活性迅速上升，均高于敏感种群AH-7，其中，种群 AH-34 靶标位点并未发现突变，但抗药性水平达 AH-7 的 23.16 倍，表明抗药性与敏感种群之间 GSTs 对唑啉草酯解毒能力的差异也可能是导致其表现为抗药性的原因之一。然而本研究仅对抗药性与敏感种群体内的 GSTs 活性进行了测定与比较，对于非靶标抗性方面的研究还需进一步深入，如 P450 氧化酶活性的影响等。据报道，通常杂草体内 ACCase 基因第 1999、2027、2041 和第 2096 位氨基酸发生突变仅会导致其对 ACCase 类除草剂中的 APP 类抑制剂产生抗药性，而第 1781、2078 和第 2088 位氨基酸突变则会对不同的 ACCase 类抑制剂产生抗药性12,29。本研究中，ACCase 基因发生 Ile-1781-Leu 突变的日本看麦娘种群 AH-29 对 ACCase 抑制剂炔草酯、烯草酮和三甲苯草酮均产生了高水平或中水平的交互抗性，其中炔草酯属 APP 类抑制剂，烯草酮和三甲苯草酮属 CHD 类抑制剂，此结果与前人研究一致。此外，AH-29 对 ALS 抑制剂双草醚、啶磺草胺、甲基二磺隆和氟唑磺隆也均产生了不同水平的抗药性，其中对甲基二磺隆和氟唑磺隆表现高抗，但AH-29 对 PSII 抑制剂异丙隆仍较敏感。此结果可为日本看麦娘等禾本科杂草的抗性治理，指导科学合422 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 理使用除草剂提供理论依据，并在农业生产实践中结合深耕、轮作等农业措施，以延缓杂草抗药性的进一步发展。参考文献：1 孙丙耀,李扬汉,黄建中.麦田看麦娘属杂草种群消长的生物学基础研究J.植物保护学报,1999,26(1):74-78.2 黄红娟,黄兆峰,姜翠兰,等.长江中下游小麦田杂草发生组成及群落特征J.植物保护,2021,47(