微生物学实验教案-新乡医学院理论课教案首页.docx

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：丰慧根 教授
一、授课题目
实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、学习微生物涂片、染色的操作技术；
2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
3、初步掌握无菌操作技术；
4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
3课时
四、授课重点
1、微生物涂片、染色的基本技术；
2、无菌操作技术
五、授课难点
1、微生物涂片、染色的基本技术；
2、无菌操作技术
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
十、教研室主任
及课程负责人签字
教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称： 微生物学 任课教师：丰慧根 教授
基本内容
教学手段和教学
组织
细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
1、学习微生物涂片、染色的操作技术；
2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
3、初步掌握无菌操作技术；
4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
二、实验内容和原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等，本实验主要做前面两种。
（一）简单染色法原理：
这是最基本的染色法，由于细菌在中性环境下一般带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫进行染色。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
（二）革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用：
1、碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
4、复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。
近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰氏染色阳性反应。
三、实验器材
1、活材料：培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）
2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水
3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。
四、实验方法
1、简单染色：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴无菌水，按无菌操作法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，并涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌。注意取菌不要太多，图片要均匀。
（2）干燥：让涂片自然晾干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。（染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。）
（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加草酸铵结晶紫染液1-2min。
（5）水洗：倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染色：
（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
（2）晾干：与简单染色法相同。
（3）固定：与简单染色法相同。
（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染2min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（13）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；b.用擦镜纸沾少许乙醚酒精溶液将镜头擦2-3次；c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。
五、注意事项
1.载玻片要洁净无油迹，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。
2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
3.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
4.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
六、实验作业
(一)绘图
绘出Bacillus subtilis和Escherichia coli革兰氏染色视野图。
(二)问题和思考
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？

强调实验课的要求和规则
简单复习理论知识过渡到本实验目的

结合理论知识讲解实验原理

简单介绍本次实验所用器材

重点介绍制片方法，强调无菌操作

边讲解边演示,并强调实验注意事项

通过提出问题加强学生对实验原理的理解

强调实验后处理的重要性

通过正反两方面再次强调实验注意事项

布置本次实验报告和思考题

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：丰慧根 教授
一、授课题目
实验二 细菌的芽孢和荚膜染色
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;
3、巩固无菌操作技术。
3课时
四、授课重点
1、微生物标本的制作方法；
2、芽孢、荚膜染色的方法及注意事项
五、授课难点
1、微生物标本的制作方法；
2、芽孢、荚膜染色的方法及注意事项
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
1．若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因?
2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?
十、教研室主任
及课程负责人签字
教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：丰慧根 教授
基本内容
教学手段和教学组织
细菌的芽孢和荚膜染色法
一、实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;
3、巩固无菌操作技术。
二、实验内容和原理
芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。
（一）芽孢染色法：
芽孢又称内生孢子（endospore），是某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构。
芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。
芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内， 进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。
（二）荚膜染色法
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。
荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。
由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。通常用负染色法染色，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。
三、实验器材
1、菌种：蜡样芽孢杆菌约2 d营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌(Azotobacter chroococcus)约2 d无氮营养基琼脂斜面培养物。
2、染色液和试剂： 5％孔雀绿水溶液、0.5％蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等
3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜纸等。
四、实验方法
1、芽孢染色：
（1）制片：按常规涂片、干燥、固定；
（2）染色：用试管夹夹住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀绿3－4滴，维持5min；
（3）水洗：待玻片冷却、用细水流冲洗至流出的水为无色；
（4）复染：蕃红溶液复染2-3min，水洗；
（5）镜检：干后，先低倍镜观察，再高倍镜观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察。
2、荚膜染色（湿墨水法）：
（1）制备菌和墨水混合液：加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之充分混合均匀；
（2）加盖玻片：将一洁净盖波片盖在混合液上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液；
（3）镜检：用低倍镜和高倍镜观察。
五、注意事项
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。
2、染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
3、荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。
4、涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形。
六、实验作业
(一)绘图
1．绘出表示芽孢杆菌的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征。
2 ．绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。
(二)问题和思考
1．若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？
2．组成荚膜的成分是什么？涂片一般用什么固定方法，为什么?

先点评上次实验作业

结合理论知识讲解实验原理

简单介绍本次实验所用器材

再次介绍制片方法，强调无菌操作

边讲解边演示,并强调实验注意事项

再次强调实验注意事项

布置本次实验报告和思考题

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：郭伟云 讲师
一、授课题目
实验三 放线菌的形态观察
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；
2、初步了解放线菌带形态特征。
3课时
四、授课重点
1、放线菌的制片方法及其注意事项
五、授课难点
1、放线菌的制片方法及其注意事项
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
1．试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。
2．镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
十、教研室主任
及课程负责人签字
教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称：微生物学实验 授课教师姓名及职称：郭伟云 讲师
基本内容
一、实验目的
1、学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；
2、初步了解放线菌带形态特征。
二、实验内容和原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体带一类革兰氏阳性细菌。
常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长带叫基内菌丝（简称“基丝”），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（简称“气丝”），并进一步分化产生孢子丝及孢子。
放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片染色法和胶带纸粘菌染色法进行制片观察。
为了观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长条件下的形态特征，本实验介绍其中几种常用的方法。
（1）扦片法
将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上，观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可以观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于不同生长期的形态。
（2）玻璃纸法
玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面，然后将放线菌接种于玻璃纸上，经培养，放线菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持放线菌的自然生长，也便于观察不同生长期的形态特征。
（3）印片法
将要观察带放线菌带菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察。这种方法主要用于观察孢子丝带形态、孢子带排列及其形状等。该方法简便、但形态特征可能有所改变。
我们本次实验主要采用印片法来观察放线菌的基本形态。
三、实验器材
1.菌种：细黄链霉菌(streptomycs micuoflavus)又称5406或青色链霉菌（S. glaucus），弗氏链霉菌（S. fradiae）；
2.染色液：石炭酸复红染色液；
3.器材：载玻片，玻璃纸，小刀，接种环，吸水纸，擦镜纸，酒精灯，香柏油，乙醚-乙醇混合液，显微镜。
四、实验方法
（1）印片：用解剖刀取放线菌培养体一块，将菌面朝上放在一载玻片上，另取一洁净载玻片置于火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）粘附（“印”）在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰2-3次固定；
（2）染色：用碳酸复红覆盖印迹，染色约1min后水洗；
（3）镜检：干后先用低倍镜后用高倍镜，最后用油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。
五、注意事项
1、铲菌苔时注意不要将琼脂铲得太厚，以免影响压片；
2、玻片不要太热，以免琼脂融化，干扰放线菌的附着；
3、制片过程中切不可涂片，以免破坏菌丝形态；
4、印片完毕后注意将印有放线菌的一面朝上进行固定，印片不要用力过大压坏琼脂培养基，也不要挪动，以免改变放线菌的自然形态；
5、观察时宜采用略暗的光线。
六、实验作业
(一)绘图
绘出说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。
(二)问题和思考
1．试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。
2．镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
教学手段和教学组织
先点评上次实验作业

结合理论知识和图片讲解实验原理

简单介绍本次实验所用器材

边讲解边演示印片方法,并强调实验注意事项

再次强调实验注意事项

布置本次实验报告和思考题

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：郭伟云 讲师
一、授课题目
实验四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；
3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
3课时
四、授课重点
1、酵母菌的形态特征
2、酵母菌死活细胞鉴别的原理
五、授课难点
1、酵母菌的形态特征
2、酵母菌死活细胞鉴别的原理
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。
2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
十、教研室主任
及课程负责人签字
教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称：微生物学实验 授课教师姓名及职称：郭伟云 讲师
基本内容
一、实验目的
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；
3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
二、实验内容和原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。
由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
三、实验器材
1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物；
2、染色液和试剂：0.05％和0.1%吕氏碱性美蓝染液；
3、器材：废液缸、载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。
四、实验方法
（1）在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；
（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；
（3）将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。
（4）染色30min后再次观察，注意死活细胞数量的变化；
（5）用0.05％的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。
五、注意事项
1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；
2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
六、实验作业
(一)绘图
绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及出芽生殖方式。
(二)问题和思考
1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。
2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？

教学手段和教学组织
先点评上次实验作业

结合理论知识和图片讲解实验原理

简单介绍本次实验所用器材

边讲解边演示实验方法,并强调实验注意事项

再次强调实验注意事项

布置本次实验报告和思考题

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：刘涌涛 副教授
一、授课题目
实验八 培养基的制备与灭菌
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、明确培养基的配制原则；
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；
4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。
6课时
四、授课重点
1、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
2、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；
五、授课难点
掌握配制培养基的一般方法和步骤
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
为什么微生物培养需要不同的培养基？
十、教研室主任
及课程负责人签字

教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称：微生物学实验 授课教师姓名及职称：刘涌涛 副教授
基本内容
一、实验目的
1、明确培养基的配制原则；
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；
4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。
二、实验原理
培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。
培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。
灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。
常用加热灭菌法：
1、干热灭菌：
这种灭菌法是利用热空气使物体升温，而导致物体上所带的微生物由于干热脱水而死亡。常用于空玻璃器皿、金属用具等的灭菌，对于带胶皮的物品、液体及固体培养基等不能使用此法灭菌。
2、高压蒸汽灭菌法
此种灭菌方法的原理是在一密闭容器中，煮沸时形成的蒸汽不能扩散到容器外面去，而堆积在密闭的容器内，使蒸汽压力升高；随着水的煮沸，温度也就相应增高。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。
高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15—30分钟进行灭菌，就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。进行高压蒸汽灭菌的仪器叫高压蒸汽灭菌锅。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对一些不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。
三、器材和用品
1．1000ml刻度分装搪瓷缸、200ml烧杯、角匙、天平、称量纸或小烧杯、pH试纸、500ml三角瓶，18mm×180mm试管、纱布、棉花、10ml移液管等。
2．牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％NaOH溶液、10％盐酸溶液。
四、方法和步骤
1．培养基配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。
2．操作步骤
（1）用称量纸分别称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，把牛肉膏连同称量纸与蛋白胨一起放入200ml的烧杯中，然后加入100ml水，置电炉上加热搅拌至其完全溶解。用玻璃棒把称量纸挑出冲净（用洗瓶洗，冲洗液流入烧杯）。
（2）将溶解的混合液倒入1000 ml搪瓷缸中，称取5.0gNaCl加入，洗涤烧杯2～3次，洗液倒入缸中，补足自来水到1000ml（液体培养基制成，即可分装），搅拌加热煮沸。
（3）称取20g琼脂，放入煮沸的溶解液中，继续加热至琼脂完全溶解，加热过程中要不断搅拌以防琼脂沉淀糊底或溢出杯外。
（4）待琼脂完全融化后，再补足自来水，趁热用玻璃棒蘸少许液体点在pH试纸上测定酸碱度并用NaOH或HCl溶液调整pH值至7.2～7.4。
（5）趁热分装入15mm×150mm试管中，每管5ml（斜面用）。18mm×180mm试管，每管分装15ml（平板用）。
（6）将余下的分装在500ml三角瓶中（每瓶约 300ml）。
（7）将上述分装在各种容器中的培养基，塞好棉塞，捆扎好。
（8）0.1MPa高压蒸汽灭菌30分钟。
（9）摆斜面灭菌后，需做斜面的试管，应待培养基冷却至50～60℃（温度不能过高，以防斜面上冷凝水太多）后，摆成斜面。斜面的斜度要适当，斜面的长度不超过试管长度的二分之一。摆放时注意不要使培养基沾污棉塞，冷凝过程中不要移动试管，待斜面完全凝固后，再收起使用或贮藏。
五、注意事项
1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；
2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；
3、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；
4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2；
5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。

教学手段和教学组织
先点评上次实验作业

结合理论知识讲解实验原理

简单介绍本次实验所用器材

边讲解边演示,并强调实验注意事项

强调注意事项

新乡医学院实验课教案首页
课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师
一、授课题目
实验六 微生物的分离与纯化
二、授课对象
2005级生物技术专业本科生
三、实验教学目标与课时分配
1、了解微生物分离和纯化的原理
2、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作技术。
6课时
四、授课重点
微生物分离和纯化的基本原理
五、授课难点
微生物分离和纯化的基本原理
六、授课形式
实验课讲授
七、授课方法与课前准备
授课方法：启发式教学，讨论式教学；
课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案
八、教材与参考文献
沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。
九、思考题
1．在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。
2．稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内？
3．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？
十、教研室主任
及课程负责人签字

教研室主任（签字） 课程负责人（签字）

年 月 日 年 月 日

新乡医学院实验课教案
课程名称：微生物学实验 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师
基本内容
一、实验目的
1、了解微生物分离和纯化的原理
2、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作技术。
二、实验原理
在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物数量和种类都极其丰富，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要来源，可以从其中分离纯化到许多有用的菌株。
三、器材和用品
1．样品 土样
2．培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、豆芽汁培养基。
3．其它 盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。
四、方法和步骤
（一）、稀释混合平板法
1．细菌的分离
（1）土壤稀释液的制备 ① 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振荡15～20分钟，使微生物细胞分散，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。② 另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7，用
无菌吸管吸取10-1土壤悬液lml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一支吸管吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml，加入编号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一支无菌吸管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-4、10-5和10-6等一系列稀释度菌悬液（见图1）。
图1 从土壤中分离微生物操作过程
（2）平板制作 将无菌培养皿编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设三个重复，用1ml无菌吸管按无菌操作要求吸10-6稀释液各1ml，分别放入编号10-6的三个培养皿中。同法吸取10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-5的三个培养皿中。再吸取10-4稀释液各1ml，分别放入编号10-4的三个培养皿中。然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整个操作过程应严格按照无菌操作（见实验1）。
（3）培养与移植 待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于37℃恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。
2．放线菌的分离 由于放线菌在培养基上蔓延生长不如真菌快，其繁殖速度又比细菌慢，故分离这类微生物时要特别注意防止细菌和霉菌的蔓延，以免妨碍放线菌的生长。为了保证放线菌的优势生长，可对样品做如下处理：（1）为了除去部分细菌，可先将土壤进行风干。因为细菌营养体遇干燥环境容易死亡，而放线菌比细菌的抗干燥能力强。风干的土壤与少量CaCO3混合，于28℃培养数天，更能进一步减少细菌和增加放线菌的数量。（2）选用的土壤稀释度要根据放线菌的多少来决定，可用10-3、10-4或其它稀释度。在所选用的稀释液中加入100g/L酚10滴，充分混匀，可进一步减少细菌和霉菌的生长。
一般放线菌生长的适宜温度为25～28℃，培养5～7天，培养基为高氏一号培养基。具体操作过程见“细菌的分离”。
3．霉菌的分离 大多数霉菌为好氧微生物，必须有充足的氧气才能很好地生长。霉菌能耐受较酸性环境，所以一般分离霉菌时取偏酸性、含有机质较丰富的接近表层的土壤，特别是森林土壤中含有较多霉菌。如果用特定的材料为培养基分离霉菌，经培养后，长出的菌种可能较为单一。比如用新鲜的桔皮保温培养，容易长出青霉。
分离方法 具体操作过程见“细菌分离”，只是将稀释度向前移2位数。采用马丁氏（Martin）琼脂培养基，在培养基中加1/3000的孟加拉红水溶液，使用时每10ml培养基再加0.03%链霉素溶液1ml（含链霉素30μg/ml），用28～30