稀土离子荧光及其在免疫分析和核酸探针中的应用_陈泮藻.pdf

免疫学 杂志?年 第?卷第?期?稀土离子荧光及其在免疫分析和核酸探针中的应用陈伴藻史华红李振甲?解放 军 总医院 基础所生化室北京?稀 土离子特别是 衫?铺?械?摘?能发出强的荧光。由于激光技术的发展,自六十年代起,人们对稀 土离子的 荧光 进行了深入的研究,弄清 了稀 土 离 子荧光机理、荧光特点和影响因素。近年来,国内外学者把稀土离子的荧光应用到生物学和医学的研究上,为稀土的应 用提供了广 阔的前景。一、稀土离子的荧光特点游离的稀土离子 的荧光是相当微弱的。当稀土离子与有机配位体?如?一二酮类,芳香拨酸 类?形 成 配合物时,产生分子 内能量传递?,使 稀土离子的荧 光强度显著增强。当加入斓、乍?、馆、或忆等离子 时,产生分子间能量传递,使?”离子和?离子 的荧光增强?一?个数量级。荧光光谱分为两部分?激发光谱和发射光谱。普通物质的荧光光谱?位移较小。如荧光素的?位移为?。通常,激发 光谱和发 射 光谱有部分重 叠,互相 影 响严 重,而且 干 扰因素多,荧光 寿命短?小于?,易碎灭。稀土离子的荧光光谱具有较大的?位移,发射光谱和激发 光谱不会相互 重叠,例如,?甲一?的最大激发波长 为?,最大 发 射波长 为?,其?位移达?发射光谱峰范围 相 当窄?小于?,特 异性很 强?荧光寿命为?一?。娜,甚至更 长,比普通 的荧光 寿命高几个 数 量级。检测 时,采用适 当的时 间延 缓,可非常显著地降低来 自散射光、样品的本底荧光的 干扰。此外,不同 的稀土离子,最大发射光波长不 同?,荧光寿命也 不同。可根据这两 个特点,选 择适当的 延缓测量时间,配以不 同的滤 光片,能很精确 地测量混合物 中 不 同稀 土离子 的含量。二、在免疫分析 中的应用放射免疫分析法是 目前最常用的方法。其 灵敏 度高,特异性强,但有放 射性危害,受半衰期限制,所以 人们致力于研究非同位素标记法。酶标记法较为安全,但酶不稳 定,致使检测灵敏 度低,可检测的标准 曲线范 围窄。普通荧光标记法受本底荧光干扰大,荧光 易碎灭。稀土 离子荧 光具有独特的优点,用它作为 标记示 踪物,再配以时 间分辨荧光测 量仪,能显著提 高分析灵敏度,标准 曲线范 围宽,而且 无放射性危害,标记技术容易掌握,标记物稳 定性好。?解 离增强法用 双功能试剂 把?十离子 鳌合到免疫样品上?抗原、抗体或亲 和素?,当免疫反应完成 后,用 增 强溶液把?离 子 解 离 下来,组成新的鳌合物并增 强其荧光强度。为了提高检测的灵敏度,常常利用 生 物素一链 亲 和 素?一?的放大作用?此法的最大特点 是双功能试剂只起 赘合作用,不能使?离子的荧光增强。因需外加增强溶液,若操 作不 当,易 污染样 品,影 响测 定结果。但这 个 方法 应 用相 当 普遍,灵敏度也 较 高?丫?一?,重复性好。?直接浏量荧光度法鉴于解离增强 法样品 易受污染,人们设法避 免加入增强 溶液。广州中山大学化学系博士生?免疫学杂志?年 第?卷第?期?十离 子的 标记法?通过双功能鳌合剂?,?卜双?氯化苯酚磺酸盐?一?,?仆菲锣琳?标记到 抗原或抗体上,当抗原与抗体产生特异性的免疫 反 应,达 到动态平衡以后,再加入适 当 的?离子,与免疫 复合物中的?!形成新的荧光鳌合物,直接测量其荧光。引入生物素一链亲和素体系能提高检测灵敏度?。整个过 程不 用外加增强溶液,操作非常方便,目前国外已制成药摧圣?离子标记 法?用双功能 鳌合剂二乙三胺五乙酸一对氨基水杨酸?!?标记到 抗原、抗体。当免疫反 应后,再加入适 当的?,?离子,测量其荧 光,而无须 预先制备?标记物,简化了操作步骤,但灵敏度 有待提高。上述两种 方 法的主 要特 点 是?双功能试剂既 起鳌和作用,又起传递能量作用。当 免疫反应完成后才加入 稀土离子,避免样品的污染 间题。?共发光 法一些不发光的稀土离子?如?、?,?、?、?等?能使?、?离子的 荧光大 大增 强。例如?“?离子 能使?离子荧光增 强?倍,使?离子荧光增 强?倍。有人称之 为“共发 光们?。起初,“共发光,仅用于矿 物质中稀 土 含量的分析,后来将它 引入免疫分析中,并取得 了令人满意的结果。“共发光”在?值为?。?时,它们的荧光强度 最大。因此,在免疫分析中,只要使测量体系的?值保持在?一?之间,就能达到增强荧 光的目的。表?测釜?、?离子劳光的条件?双 标记法?离子 和?离子的双标记汇?用?“十离子 和?离子分别标记人血清中?和?两种激素的单克隆抗体。当免疫反应 后,加入增强 液?内含?,?,?一?,?一?的 醋 酸 缓冲液?,使?离子、?,?离子洗脱下来,在不 同的条件下分别 测 量?十离子、?离子 的荧光。测量结果见表?。表?、?,?双标记和?灵敏度对 比?小、?,?、?,?离子共发光 双 标记?用?,?、?,?离 子 分 别 标 记?和?的 单克隆 抗体,因为共发光对?值要求严格,所以把 增 强液分成两部分?件二 酮体、?,?离子、?一?,?一?一醋酸缓 冲液,这部分主要使?、?离子解离并形成新的鳌合物?由协同剂邻菲锣 琳?和缓冲能 力较强的?溶液组成,主要 作用是将?、?离子周 围的水分子 排 出第一 配位层,使?值保持在?之 间。当 免疫反应后,用 上述增 强液使?、?离子 解离,分别测?、?离子的荧光 强度。测量条件见表?,测量结果见表?。由此可见,共发光能提高免疫分析的检测 灵敏度。利用?,?、?、?、?,?离子的荧光 寿命和最 大 发射 波 长的不 同,可作 多标记。?中寿命?中寿命周期 时间延缓时间?拜?产?拜?产?测量时间?拌?波长?,?!?#?#?%BTA:苯 甲酞三氟丙酮;T T A:噬吩甲酸三氟丙酮免疫学杂志19 93年第9卷第3期209表3Eu,十、Sms+离子双标记检浏灵敏度 比较B T A一PhenY3+(I U/L)TTA一PhenYs(IU/L)卜N T A一TOPO(IU/L)LHFSH0,0450.0450140.0430.0290.49卜N T A:件蔡甲酞三氟丙酮三、在核酸探针中的应用核酸探针技术是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种新技术。已广泛应用 于分子生物学,遗传学,基因工程和医学等多 学科领域。3午标记的核酸探 针特异性强、灵敏度高。但3 2P衰变快,致使探针使用 寿命短,价格昂贵,自显影时间冗长,且对人体有一定的危害。因此,非放射性标记核 酸探针技术便应运 而生。人们利用 稀土的荧光作为免 疫分析的示 踪物,取 得比R IA还要好的结果。在此基 础 上,也开始了用稀土离子标记核酸探针的研究。稀土离子标记核酸探针的主要方法如 下:1.把半抗原先标记在特定的D N A探针上,杂 交后,加入第一抗体;然 后 进行免疫反应,再加入Eu3+标记的第二抗体;最后 加入增强液,测量Eu3+离子的荧光强度。灵敏度为20pg“。2.将D N A探针先生物素化,杂交 后,直接加入Eu3+标记的链亲和素。由于链亲和 素有放大作用,故检测 灵敏 度有所提高,可达10pgf了。3.引入多聚赖氨酸(PLL)能使D N A探针带上更多的Eu“十离子。把含琉基的补骨脂素(Psoralen)标 记 在D N A探 针上.将D T PA一Eu+接到PL L分子 上,然 后 用 异 双功 能试剂(heterobifunetionalagent)把 标 记的D N A探针和P LL一DTPA一Eu+联接起来。这就能进一步提高检测 灵敏度(S Pg)。其后,经过改进 某些 步骤,灵 敏度可 达0.5pglll。4.对DN A中的胞 嗜 吮进行化学修饰,然 后 引 入Eu十离子(见附 图)。控制修饰程度,使其占总 核 昔酸 数的48%。DNA中1 00对碱基掺入 一 个Eu3+鳌合物,使D N A的熔化温度降低0.7。杂交程度 也随着Eu+鳌合物的引入 而降低,但通过适当增加探针的浓 度 加以弥补。灵敏度为 S Pg“么。N H.职C H,c H,N H,N RC H:C H,皿C朋一L1 gaod一Eu.十飞1 1才IRC沪!目l才I R污掣些丝巡了一污七H.HS O,pH一6.00,七亡/目/s姗一L应 gaod一Eu3+pH1 00O=C注scH一L1gand一En十s。”一一H:cH,一dH-,c H:Co o-灰以,co o-、C盯:一月c H:Co o一EuCH,C(X)-附图核酸探针中胞啼吮的化学修饰以上四种 标 记技术,均 需加入增 强 液才探针的5一末端或3一末端上,把D TPA一pAS-能测量Eu3+离子的荧光,这 就限制了对其应T b,+连接到探针上,DTPA一pAS能使T b s+用。有些学者在此基 础上,进行了如 下改进:离子发出长寿命(t一158 0娜)的荧光。可 用5.把含氨基的补骨脂素标记在寡核普酸于原位杂交分析L3。免疫学杂志1 993年 第9卷第3期6.合成一 个既能鳌合Eu3十离子,又能使之 发 强 荧 光 的 穴 状 鳌合剂 二氨三联毗 咤(TB D)。Eu+离子 能进入TBD分子的空穴中,因此,这 个Eu3+鳌合物特 别稳定。先把D NA探针生物素化,Eu a十的T BD鳌 合物标记在链 亲和素上,杂交后,直接测量Eu3十离子的荧光。灵敏度可达spg妇.稀 土离子标记的核酸探针保存期长(冻干 品能保存一年),性能稳定,灵敏度也比酶标 记 和普通荧光标记高。此外,PCR技术的广泛应用,必使稀 土离子标记的核酸探针技术日臻 完善。综上所述,稀土离子的荧光有其独特的优点。因此,目前国 内外一些学者,已把稀 土离子 的荧光 引入到 生物学 和医学研究领域中,将稀土离子荧光检测高灵 敏性和 生 物抗原 抗体反 应的高特异性相结合,以及将稀土离子荧光检测高灵敏性和分子生物学核酸 探针高度专一性有机结合起来,创建新的超微量检测 生物活性物质分析技术。这有力地促进 了生命科学和医学的发 展,相信在不久将来,在我国会得到更 广泛的应用。参考文献1.DiamandisEP,etal.AnalCher n1 990;62:1149A2.Bu ono一Cor eGE,etal.CoordCl、emRe v1990;99:5 53.朱贵云,杨景和.中国稀土学报1 989;7(2):7 34.Mort onRC,e tal.AnalChem1 990;62:18415.B aileyMP,etal.Analyst1984;109:14496.Hemmi lal,etal.Cl ir lChem1987书3 3:22 817.XuYo ngyu a n,etal.Analyst1991;116:11558.SyvanenAC,etal.NueleieAei dsReseareh1986;16:10179.DahlenP.AnalBioellem1987;164:7810.oserA,etal.Nu eleieAeidsRese areh1 98 8:16:118111.oserA,ValetG.NueleieAeidsResearch1988;16:81 7812.Hurskaine幻P,e tal.NueleieAei dsRese areh1 991;19:1 0571 3.oserA,etal.An a!Bioehem1 990;191:29514.Prato,e tal.AnalBio chem1991;1 95:283(19,2年5月8日收稿;1992年7月l一日修回)