微生物学试验教程(1).docx

内容提要微生物学实验是配合武汉大学、复旦大学编的微生物学一书的实验教材。第二版做了较大修改，增添了许多新技术和方法，实验由原来的40个增至63个，并按类规纳成15个部分。每一部分冠以综合性说明，简单介绍该部分内容及其在微生物学工作中的作用。第二版仍着重微生物学实验的基本操作和技能训练。为方便教学，每一实验基本上仍按照目的要求、基本原理、器材、操作步骤及实验报告（包括实验结果和思考题）五部分。书后附有染色液、培养基、试剂和溶液的配制方法、本书使用的菌种名称，微生物学中常用的计量单位及主要参考书目。第二版实验内容较多，各校可根据具体条件酌情选做。第一版前言微生物学实验一书是根据1977年10月成都综合性大学生物类教材会议制定的大纲编写的。在编写过程中，为配合武汉大学、复旦大学编的微生物学教材，在内容上有所增加和修改。本书共有实验40个，内容较多，其中包括与微生物学相配合、印证理论以及进行微生物实验所需的基本操作和技能的训练两大部分。各校可根据具体条件酌情选做。本书为方便教学，每一实验基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步骤及结果与思考题等五个部分来编写的，各实验所用染料、培养基、溶液与悬液等的配制均列在附录内。由于编者水平所限，在取材、实验方法和编排等方面肯定有不少缺点与错误，希望读者批评指正。在编写过程中承武汉大学生物系微生物教研室基础微生物学教学小组的大力支持，武汉大学生物系陈宝联同志绘制插图，在此一并表示感谢。范秀容 沈萍第二版前言微生物学实验第一版自1980年出版以来已有七八年了，在此期间，经过多次印刷，印数已达十余万册。它在微生物学的教学和稳定教学秩序方面起了积极的作用，但是也存在不少缺点，加上近年来微生物学技术发展迅速，因此我们进行了出版第二版的修订工作。修订内容和特点如下：1将繁多的实验按类归纳成15个部分，以求条理清楚，概念分明。每一部分冠以综合性说明，主要简单介绍该部分的内容，阐述其在整个微生物学工作中的作用等。再在每一部分选择有代表性的重点，列出实验，进行操作。2继续着重微生物学实验的基本操作和技能的训练。3实验内容做如下调整：(1)为了加强学生对微生物及其应用和无菌概念重要性的认识，以及对实验工具的质量要求和洗涤方法的了解，增加了“微生物学实验室常用的器皿”、“环境中的微生物”和“食品微生物学”等部分。(2)使一些领域的内容更加全面，例如在“显微镜的结构、性能和使用方法”部分增加了相差显微镜和电子显微镜；“微生物的纯培养”部分增加了厌氧培养；微生物的遗传方面增加了药物抗性菌的分离和细菌的接合作用等实验。(3)适当增加新技术的介绍，例如生化反应中的微量简易诊检系统；菌种保藏中的液氮冷冻保藏法；水的微生物学检查中增加了滤膜法等。(4)此外，在基本操作训练方面集中介绍了动物的几种不同途径的注射方法。(5)由于“环境中的微生物”包括了空气中微生物的检查，故没有再单独设实验，此外还删去了“巴斯德效应”实验。第二版的实验内容较多，有些内容由于实验条件和学时的限制，可作为学生日后进一步工作的参考。因此各校可根据具体条件酌情选做。4第二版将实验报告分为实验结果与思考题两部分。实验结果尽量采用绘图和表格形式，并要求在表格内用简单符号和数字填写，以使作业规范化，便于学生记录与教师批改。5增加了部分插图。第二版主要由范秀容、李广武、沈萍同志编写，彭珍荣同志参加编写了部分实验。插图除沿用第一版由陈宝联同志绘制的以外，其余大部分插图由熊定荣同志绘制，个别插图由刘启融同志绘制，在此一并致谢。由于编者的水平有限，本版的缺点和错误在所难免，尚请各位同仁和读者提出宝贵意见。编者19886实验须知普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：1每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。4实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。5实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。6使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。7每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3来苏尔液或5石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡在3来苏尔液中进行消毒。8每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。9每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅。10离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。、微生物学实验室常用的器皿微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。一、器皿的种类、要求与应用1试管（test tube）微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。（1）大试管（约18180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。（2）中试管（约1315100150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。（3）小试管（1012100mm）一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材料的试验2德汉氏试管（Durham tube） 观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约636mm）（图I-2），此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。3吸管（又称移液管，pipette）（1）玻璃吸管（glass pipette）微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管（图I-3，A）。与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。市售细菌学用吸管，有的在吸管上端刻有“吹”字。除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图-3，B），来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。（2）活塞吸管（piston pipette）主要用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或微量加样器。其外形和结构如图-4，除塑料外壳外，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的吸嘴。按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进和放出液体。其特点是容量固定，使用时不用观察刻度，操作方便、迅速。国内产品一般每个活塞吸管固定一种容量，分别有5、10、20、25、50、100、200、500、1000l等不同容量。而精制的活塞吸管每个在一定的范围内可调节几个容积，例如在525l的范围内，可调节5、10、15、20、25l五个不同的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用毕只需调换吸嘴或将吸嘴洗净，消毒后再行使用。活塞吸管是国外70年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免疫学和使用同位素等的科学实验中。4培养皿（petridish）常用的培养皿（图-5），皿底直径90mm，高15mm。培养皿一般均为玻璃皿盖，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。5三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发酵等。常用的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基与药品。6注射器（injector）一般有1、2、5、10、20、50ml等不同容量的注射器。注射抗原于动物体内可根据需要使用1、2和5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。微量注射器有10、20、50、100l等不同的大小。一般在免疫学或纸层析等实验中滴加微量样品时应用。7载玻片（slide）与盖玻片（cover slip）普通载玻片大小为7525mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为1818mm。凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝（图-6），作悬滴观察活细菌以及微室培养用。8双层瓶（double bottle）由内外两个玻璃瓶组成（图-7），内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。9滴瓶（dropper bottle）用来装各种染料、生理盐水等（图-8）。10接种工具接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inocula-ting needle）、接种钩（inoculating hook）、接种铲（inocula-ting shovel）、玻璃涂布器（glass spreader）等（图-9）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝的直径以05mm为适当，环的内径约2mm，环面应平整。接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌，有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要求粗一些，约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或将玻棒一端烧红后压扁而成。二、玻璃器皿的清洗方法清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。现分述如下：1新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2的盐酸或洗涤液（见本小节“3”）。浸泡后用自来水冲洗干净。2使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架（图-10）上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2煤酚皂溶液（来苏尔）或025新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。(2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2煤酚皂溶液或025新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸510分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡052小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2煤酚皂溶液或025新洁尔灭溶液中浸泡24小时，然后按上法洗涤与保存。3洗涤液的配制与使用（1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：浓溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g自来水 150ml浓硫酸（工业用） 800ml稀溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g自来水 850ml浓硫酸（工业用） 100ml配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。贮存于有盖容器内。（2）原理 重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸（chro-mic acid），酪酸的氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。（3）使用注意事项 （a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨液洗。如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；（b）玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。三、空玻璃器皿的包装1培养皿的包装培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以58套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行于热灭菌。如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图-11），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2吸管的包装准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约05cm处，塞一小段约15cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角（图I-12），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。如果有装吸管的铜筒（图-13），亦可将分别包好的吸管一起装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。3试管和三角烧瓶等的包装试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十九），然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。环境中的微生物因为微生物是肉眼看不见的，所以初学微生物学的学生常不知道外界环境和所有与外界接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身体的皮肤、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉头等的粘膜）等处，因此，可以说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，因为这样才能体会到无菌技术和环境卫生的必要性，才能防止外界微生物对培养物的污染，才能防止病原性细菌或病毒通过手或衣服进入人体而引起传染。从周围环境和体表各部取样生长出来的微生物，虽然大多数属正常菌群，但当进入破损的皮肤或传入口内或眼睛等处也会引起传染，这一方面是因为通过培养，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称为条件致病菌），因此必须详细阅读操作步骤和听从指导者的说明，特别是用过的棉签和工作完毕后的培养物等均要放在指定的容器内，接种环不仅在用前必须烧灼灭菌，而且用后也应立即烧灼。这是整个微生物学实验课程和今后进行微生物学实验时均需注意的。下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或把手）和人的头发、皮肤、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养12天后，观察并比较不同来源的微生物生长的数量和类型。实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查一、目的要求1证明实验室环境与体表存在微生物。2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3体会无菌操作的重要性。二、基本原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37温度下培养，12天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。三、器材肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。四、操作步骤每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。1写标签任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。2实验室细菌检查（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。（2）实验台和门的旋钮（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图-1。（b）取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出（图-2，B），将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出（图-2，C）。放回棉塞（或试管帽）（图-2，D），并将空试管放在试管架上。（c）弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。（d）取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。（e）接种 按图-3，A在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图-3，B），立即闭合皿盖。并按图-2，E和F，将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。（f）划线 另取接种环在火焰上灭菌，如图-4，先将环端烧热（图-4，1），然后将接种环提起垂直放在火焰上（图-4，2），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次（图-4，3）。左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处（图-3，C）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图-3，D从上向下来回划线至12处。烧灼接种环，转动平板，按图-3，E，划最后14，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。3人体细菌的检查（1）手指（洗手前与洗手后）（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。（3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约68cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。（4）鼻腔（a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。（c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。4将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37培养箱，培养12天。5结果记录方法（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。菌落特征描写方法如下：（a）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。（b）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。（c）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。（d）形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度 透明、半透明、不透明。（g）边缘 整齐、不整齐。五、实验报告1结果（1）将你自己的平板结果记录于下表中。（2）与其他同学所做的结果进行比较。2思考题（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？显微镜的构造、性能和使用方法由于微生物个体细小，因此我们必须用显微镜来研究它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。现代显微镜一般可以分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型，现列表如下：本部分包括普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜四个实验。目的在于使同学们通过这四个实验，对两种类型的显微镜有较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜的使用。对于电子显微镜则着重了解其工作原理，并要求掌握制作电子显微镜标本的基本技术。实验二 普通光学显微镜一、目的要求1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、显微镜的基本构造显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图-1）。1机械装置镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装34个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2光学系统物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA030；10；160/017；16mm。其中“NA030”表示数值孔径（numerical aperture，简写为NA），“10”表示放大倍数，“160/017”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7、10、15等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到10。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。3成像原理普通光学显微镜的成像原理如图-2所示。三、油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，4045）和油镜（18 mm，95100）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大10002 000多倍。从图-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=152，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图-4）。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin式中 NA=数值孔径； n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为90，sin90=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120，其半数的正弦为sin60=087，则：以空气为介质时：NA=1087=087以水为介质时：NA=133087=115以香柏油为介质时：NA=152087=132显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。式中=光波波长。我们肉眼所能感受的光波平均长度为055m，假如数值孔径为065的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为042m。而在042m以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为125的油镜时，能辨别两点之间的因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=065），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有042m。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=125），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出022m间的距离。四、器材显微镜，显微镜灯，香柏油，二甲苯；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）染色玻片标本，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）染色玻片标本。五、操作步骤1观察前的准备（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约34cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。（2）调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。2低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 05cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。3高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。4油镜观察（1）用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴