毛细管电泳紫外检测法测定莲须中的槲皮素木犀草素山萘酚.pdf

毛细管电泳紫外检测法测定莲须中的槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙荆瑞俊31,2 姜小莹1,2 侯书荣2 李向军2 袁倬斌21(河南科技学院化学化工学院,新乡453003)2(中国科学院研究生院化学与化学工程学院,北京100049)摘 要 采用毛细管区带电泳紫外检测法(CZE2UV)同时测定中药莲须中槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙4种有效成分。研究了缓冲溶液的离子浓度、pH值和电压对分离度和迁移时间的影响,得到了最佳分离实验条件。在离子浓度为40 mmol/L Na2B4O7缓冲溶液(pH 9.0)中,分离电压为16 kV,波长为254 nm时,槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙4种物质在10 min内得到了良好的分离测定,其检出限分别为5.0、6.7、4.5和6.0 mg/L。本方法应用于实际样品的测定,结果令人满意。关键词 莲须,槲皮素,木犀草素,山萘酚,异槲皮甙,毛细管电泳2006209220收稿;2007203207接受本文系国家自然科学基金(No.20175025,29875027)、国家自然科学基金分析化学重点基金(No.20235010)资助项目3E2mail:1 引 言高效毛细管电泳以高压直流电场为驱动力,以毛细管作分离通道,依据样品之间电离度和分配行为上的差异而实现分离,具有高效、快速、样品用量少等优点,与传统的高效液相色谱分析法相比,它进样体积小(150L)1,2、用时短,而且不会污染柱。在中药有效成分分析中已得到了广泛应用。莲须为睡莲科植物莲的干燥雄蕊,用于治疗遗精滑精、带下和尿频。莲须、荷叶、莲子心和莲子均为莲的不同药用部位。化学成分和含量测定方法集中在莲子上,对莲须中的有效成分分析还不多见,孟宪生3 等使用高效液相色谱分析了莲须中的槲皮素和山萘酚。王月伶等4 采用离子液体修饰毛细管胶束电动色谱法测定了槲皮素和异槲皮甙。本实验采用毛细管电泳紫外检测同时分离测定了莲须中的槲皮素、木犀草素、异槲皮甙和山萘酚。在优化的实验条件下,上述4种组分能被完全分离测定。本实验方法简便、快速,为莲须的质量分析提供了新的指标性成分的分析方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司、中科院研究生院应化所),检测波长范围为190700 nm;未涂层弹性石英毛细管柱(50m i.d,总长50 cm,有效长度40 cm,(河北永年光导纤维厂),pHS23B酸度计(上海雷磁仪器厂),H6605型超声清洗机(无锡电子设备厂)。标准对照品:槲皮素、木犀草素、异槲皮甙、山萘酚(Sigma公司)、莲须(北京同仁堂药店),其它试剂均为分析纯。实验用水为三次蒸馏水。1.0 g/L标准溶液的制备:准确称取槲皮素、木犀草素、异槲皮甙和山萘酚对照品,分别用乙醇溶解,以0.45m醋酸纤维滤膜过滤后备用。2.2 实验方法以40 mmol/L Na2B407(NaOH调节至pH 9.0)缓冲溶液为电泳介质。未涂层弹性石英毛细管(50m i.d,总长50 cm,有效长度为40 cm)。所有溶液使用前均用0.45m滤膜过滤。毛细管使用前用0.1 mol/L NaOH、水、电泳缓冲溶液各冲洗10 min,然后在每次电泳后分别用0.1 mol/L NaOH、水、缓冲溶液冲洗5、5和2 min,可保持迁移时间和峰高良好的重现性,然后进行分离测定。采用重力进样,进样高度10 cm,进样时间6 s,分离电压16 kV,检测波长254 nm。所有实验均在室温下进行。第35卷2007年8月 分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报Chinese Journal ofAnalytical Chemistry 第8期118711902.3 样品溶液的制备莲须样品粉碎,过筛(20m)后,准确称取4.6101 g,加人50 mL乙醇,水浴加热回流4 h,趁热过滤,滤液蒸发至15 mL,然后再稀释定容至50 mL,样品溶液以0.45m滤膜过滤后备用。3 结果与讨论3.1 缓冲溶液pH及其浓度的影响本方法分别以Na2B4O7溶液、Na2HPO42NaH2PO4混合溶液和Na2HPO42Na2B4O7混合溶液、NaH2PO42Na2B4O7混合溶液为缓冲溶液进行电泳分析实验,结果发现,以Na2B4O7溶液作为电泳缓冲溶液分离效果最好。缓冲溶液的pH值是影响组分分离的主要因素,它可以影响Zeta电势()、电渗流(FOF)和分析物的带电情况,进而影响分析物的迁移时间57。在实验过程中得知,随着pH值的增大,迁移时间延长,但增大程度不同,图1pH值对4种物质迁移时间和出峰顺序的电泳图Fig.1Effect of buffer pH on the migration time and order ofapex1.异槲皮甙(isoquercitrin);2.山萘酚(kaempferol);3.木犀草素(luteolin);4.槲皮素(quercetin)。上述4种物质具有不同的迁移时间和出峰顺序,如图1所示。pH对4种分析物迁移时间的影响如图2a所示。其迁移时间随pH的增大而延长。4种物质的出峰顺序也有变化。随pH值的增大4种物质之间的分离度增大,而电流也随着增大,本实验选择缓冲溶液为pH 9.0。图2b是缓冲溶液浓度对分析物迁移时间的影响,随着缓冲溶液浓度的增加,4种分析物的迁移时间延长,分离度提高。考虑到增加缓冲溶液浓度会增加焦耳热效应,造成基线噪音增加,影响分离度,本实验选择40 mmol/LNa2B4O7缓冲溶液。3.2 工作电压的影响图3是工作电压对迁移时间的影响。实验中得出各组分的迁移率随分离电压的降低而减小,迁移时间延长,分离度提高,但谱带展宽且峰高降低。随着电压的升高,电流升高,基线噪声增加,使分离度降低。综合考虑分离度、焦耳热效应和分离时间等因素,本实验选择工作电压为16 kV。图2 缓冲溶液的酸度(a)和缓冲溶液浓度(b)对迁移时间的影响Fig.2Effect of buffer acidity(a)and buffer concentration(b)on migration time of the analytes1.异槲皮甙(isoquercitrin);2.山萘酚(kaempferol);3.木犀草素(luteolin);4.槲皮素(quercetin)。3.3 标准曲线、重现性及检出限在上述优化实验条件下,4种物质在10min内能够良好分离,标准混合物的分离电泳图谱如图4所示。对一系列异槲皮甙、山萘酚、木犀草素、槲皮素的标准混合样品进行分析测定,测定其峰面积与浓度8811分 析 化 学第35卷的关系,所得异槲皮甙、山萘酚、木犀草素、槲皮素的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(S/N=3)如表1所示。图3 电压对迁移时间的影响Fig.3Effect of voltage on the migration time of the ana2lytes1.异槲皮甙(isoquercitrin);2.山萘酚(kaempferol);3.木犀草素(luteolin);4.槲皮素(quercetin)。图4 标准溶液(a)与样品溶液(b)的毛细管电泳图谱Fig.4Capillary electropherograms of standard mixture(a)and sample sulution(b)1.异槲皮甙(isoquercitrin);2.山萘酚(kaempferol);3.木犀草素(luteolin);4.槲皮素(quercetin)。表1 异槲皮甙、山萘酚、木犀草素、槲皮素的线性范围、线性方程、相关系数Table 1linear concentration,linear equation,relative coefficient and detection limit of isoquercitrin,kaempferol,luteolin andquercetin组分Component线性范围Linear range(mg/L)线性方程Linear equation相关系数Correlationcoefficient(r)检出限Detection limits(mg/L)异槲皮甙Isoquercitrin201000Y=41558X+999.850.99820.0050山萘酚Kaempferol181000Y=53346X+671.540.99910.0067木犀草素Luteolin2001000Y=107964X-254.500.99920.0045槲皮素Quercetin201000Y=72715X+919.560.99740.0060 通过连续进样含有4种物质的0.200 g/L的标准溶液,连续进样6次,计算重现性,测得4种物质的峰高和迁移时间的RSD分别为:异槲皮甙峰高为1.5%、迁移时间为1.8%;山萘酚峰高为3.5%、迁移时间为1.4%;木犀草素峰高为1.3%、迁移时间为1.9%;槲皮素峰高为2.9%、迁移时间为1.9%。3.4 样品测定利用所建立的方法分析了莲须样品中的异槲皮素、山萘酚、木犀草素和槲皮素,样品电泳图谱如图5所示,4种组分的含量分别为0.279、0.368、0.362和0.240 g/L。根据标准加入法进行定性,向样品中准确加入一定量的异槲皮甙、山萘酚、木犀草素、槲皮素,做加入回收实验。样品的加入回收实验结果如表2所示。表2 加入回收实验结果(n=6,g/L)Table 2Result of recovery of standard addition(n=6,g/L)化合物Component原有值Original(g/L)加入值Added(g/L)加入后测得值Found(g/L)回收率Recovery(%)槲皮素Quercetin0.24040.10000.30000.60000.33880.53900.838599.410299.610199.7105木犀草素Luteolin0.36220.10000.40000.60000.45880.77000.948599.310098.810398.6101山萘酚Kaempferol0.36830.10000.40000.60000.45350.75780.963896.899.797.010299.5106异槲皮甙Isoquercitrin0.27880.10000.30000.60000.36540.58130.875696.599.097.610199.61049811第8期荆瑞俊等:毛细管电泳紫外检测法测定莲须中的槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙References1Chen Yi(陈 义).Technique and Application of Capillary Electrophoresis(毛细管电泳技术与应用)(第一版).Beijing(北京).Chemical Industry Press(化学工业出版社),2000:562Cao Rui2Min(曹瑞敏),Su Wei(苏 玮),Su Qing(苏 庆).Journal of Traditional ChineseM edicine(中华中医杂志),2005,20(4):2372393Meng Xian2Sheng(孟宪生),ShaMing(沙 明),Cao Ai2Min(曹爱民),Jiang Li(姜 丽),Deng Tie2Hong(邓铁宏).Chinese Traditional PatentM edicine(中成药),2003,25(12):100410064Wang Yue2Ling(王月伶),Hu Zhong2Bo(胡中波),Yuan Zhuo2Bin(袁倬斌).Chinese J.Anal.Chem.(分析化学),2006,34(12):174117445LYuan2Qi(吕元琦),Wang Yue2Ling(王月伶),Yuan Zhuo2Bin(袁倬斌).Physical Testing and Chem icalAnalysis:PartB:Chem ical Analysis,(理化检验 化学分册),2005,41(7):64666LYuan2Qi(吕元琦),Wu Chun2Hua(邬春华),Yuan Zhuo2Bin(袁倬斌).Journal of Instrumental Analysts(分析测试学报),2004,23(4):981007Wang Yue2Ling(王月伶),LYuan2Qi(吕元琦),Yuan Zhuo2Bin(袁倬斌).Chinese Journal of AnalysisLaboratory(分析试验室),2005,24(Sup):110111Determ ination of Quercetin,Luteolin,Kaempferol andIsoquercitrin in Stamen Nelumbinis by CapillaryZone Electrophoresis2UltravioletDetectionJing Rui2Jun31,2,Jiang Xiao2Ying1,2,Hou Shu2Rong2,Li Xiang2Jun2,Yuan Zhuo2Bin21(Chem ical Engineering,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang453003)2(College of Chem istry and Chem ical Engineering,Graduate University of the Chinese Academ y of Sciences,Beijing100049)AbstractThe determination of quercetin,luteolin,kaempferol and isoquercitrin in the Chinese herbal2stamennelumbinis by capillary zone electrophoresis(CZE)with ultraviolet detection(UV)is reported.The analyticalconditionswere optimized through investigation of the effects of buffer pH,buffer concentration and appliedvoltage.The optimized conditions are as following:40 mmol/L Na2B4O7solution(pH=9.0),working volt2age of 16 kV and detection wavelength of 254 nm,the detection limits were 5.0,6.7,4.5 and 6.0 mg/L,respectively.These four analytes can be well2separated in 10 min.KeywordsStamen nelumbinis,quercetin,luteolin,kaempferol,isoquercitrin capillary electrophoresis(Received 20 September 2006;accepted 7 March 2007)电分析化学与生物传感技术 电分析化学利用物质的电学和电化学性质进行表征与测量。它不仅能进行组成和形态分析,而且对电极过程的理论研究和生命科学、信息科学、环境科学的发展具有重要的作用。该书从电分析化学研究涉及的电化学基础知识出发,总结了现代电分析化学研究常用方法的基本原理,概括和吸收了国内外近年来在电分析化学与生物传感器领域的新成就和相关文献,阐述了当代电分析化学及其在生命分析化学特别是生物电化学研究中的应用,对电分析化学与生物传感器新技术的原理和方法作了深入浅出的论述,并对各领域的应用作了详细的介绍。该该书作者南京大学鞠 先教授,由科学出版社出版。电分析化学与生物传感技术 是分析化学新方法、新技术丛书之一。0911分 析 化 学第35卷