细菌Ⅲ型分泌系统及其抑制剂研究进展.pdf

.192.World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5细菌III型分泌系统及其抑制剂研究进展陈栋梁，班曼曼，朱梦晗，王霄旸，王春梅，周文，张可煜1*(1中国农业科学院上海兽医研究所农业农村部兽用化学药物与制剂学重点实验室，上海2 0 0 2 41;2河南省动物检疫总站，郑州450 0 0 8)摘要：随着耐药性的发展，抗生素的应用面临着严峻挑战，通过抑制剂来抑制细菌生长而不寻求直接杀灭细菌成为一种新的抗细菌感染策略。细菌分泌系统是效应蛋白转运的通道，在效应蛋白分泌过程中发挥重要作用，在抗细菌感染策略中被作为优先选择对象。其中细菌II型分泌系统(T3SS)结构复杂，功能却相对保守，是众多重要效应分子转运的必经路径，已成为抑制剂选择的热点靶标。本文就细菌II型分泌系统的结构、功能研究进展及其抑制剂的发展进行阐述，为其通过抑制T3SS的抗细菌感染，新型抑制剂开发以及减缓细菌耐药的研究提供理论依据。关键词：细菌分泌系统；T3SS；抑制剂；耐药性；细菌；化合物中图分类号：R978.1文献标志码：A文章编号：10 0 1-8 7 51(2 0 2 3)0 3-0 192-10Research Progress of Bacterial Type III Secretion System and its InhibitorsChen Dong-liang,Ban Man-man,Zhu Meng-han,Wang Xiao-yang,Wang Chun-meil,Zhou Wen,Zhang Ke-yul(1 Key Laboratory of veterinary chemicals and preparations,Ministry of agriculture and rural areas,Shanghai Institute of veterinary medicine,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200241;2 Henan Animal Quarantine Station,Zhengzhou 450008)Abstract:With the development of drug resistance,the application of antibiotics is facing challenges.Instead ofseeking to kill bacteria,inhibiting the growth of bacteria through inhibitors has become a new anti-infection strategy.The bacterial secretion system is the channel of effector protein transport,which plays an important role in the processof effector protein secretion,and has become the preferred target of bacteriostatic strategy.The type III secretionsystem,which is a necessary pathway for the transport of many important effector molecules,has become a hot targetfor inhibitor selection.In this paper,the structure and function of the type III secretion system of bacteria and thedevelopment of inhibitors are reviewed,so as to provide a theoretical basis for the study of anti-bacterial infectionby inhibiting the type II secretion system,the development of new inhibitors and the mitigation of bacterial drugresistance.Key words:bacterial secretion system;T3SS;inhibitor;antibiotic resistance;bacteria;antibiotic1前言当前细菌耐药性愈发严重，已经成为人类迫切需要解决的全球公共卫生问题。以新型抗菌靶点研发新的抗菌药物的耐药性应对策略不仅需要耗费大量成本和时间，也会带来诱发新的耐药表型和机制的潜在威胁1-2 。老药新用的策略也存在筛选库容量收稿日期：2 0 2 2-10-2 1基金项目：国家自然科学基金(318 7 2 516)；国家重点研发计划(2 0 18 YFE0192600)。作者简介：陈栋梁，硕士研究生，主要从事抗菌药物研究。*通讯作者：张可煜，研究员，主要从事兽医药理学与新兽药研究有限，命中率低以及老药本身所具有的副作用可能危害机体等问题3。近年来，随着研究的深入，不寻求直接杀灭病原菌，而是通过抑制病原菌的致病力，减轻或缓解病原菌对机体造成的直接危害，并依靠自身防御系统恢复机体健康，已经逐步成为一种新型抗耐药细菌感染的策略4。这是因为病原菌国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期对抗生素产生耐药性的根本驱动力可归因于抗生素对其生长的胁迫作用巨大，而抑制病原菌的致病力作为一种选择压力较小，不直接影响细菌生长的抗感染方式，理论上细菌对其产生耐药抵抗的驱动力很小。病原菌的致病力主要依赖于毒力因子，常见的毒力因子包括毒素、细胞溶素、蛋白酶等毒性分子以及分泌系统、菌毛、鞭毛等细菌特有的毒性装置5。其中细菌分泌系统(Bacterial secretion system)是细菌重要的毒力因子，承担着胞内效应分子转运至宿主的重要功能，是一种选择压力较小，理论上不易产生耐药性的优良抗感染途径。因此，细菌分泌系统及其抑制药物研究越来越受重视，成为当前抗菌感染药物研究的重点。细菌分泌系统是一类存在于细菌细胞膜上由大分子复合物组成的分子机器，承担各种致病相关效应蛋白和遗传物质的分泌和转运，为多种细菌的效应物提供分泌途径6 。分泌系统的有些结构对于细菌病原体来说是独一无二的，对细菌毒力乃至至关重要，并影响着细菌的生存及致病能力。这些重要的作用促进了人们对细菌分泌系统的研究不断深入。目前已经发现了9种细菌分泌系统(即T1SST9SS)7，其中III型分泌系统(Type III secretory system，T 3SS)主要存在于革兰阴性菌中8 ，因其复杂的结构与功能，成为近年来分泌系统研究的重点，相应地也出现了许多能抑制T3SS组成和功能的抑制剂。本文从T3SS结构特点、分泌过程、潜在作用靶点、抑制剂等方面进行综述，为新型T3SS抑制剂的进一步探索和发现提供理论依据。2T3SS的结构T3SS是形状类似于小注射器，由多种蛋白组成的分子机器，在进化和结构上与细菌鞭毛有关9，其功能与细菌定植、存活和复制有关10 。革兰阴性菌通常可表达两类T3SSs，一类被注入复合体或针状复合物，简称iT3SS，可将细菌胞质中的效应蛋白或毒力因子转运至宿主细胞，从而调控宿主细胞的代谢过程及细菌与宿主细胞的相互作用8 ；另一类是编码细菌的鞭毛，简称fT3SS，可调控细菌的运动能力。本文主要介绍的是iT3SS。形似于小注射器的T3SS含有许多高度保守的结构成分，主要由针状复合物、转运孔、内杆蛋白、胞质环与分选平台、底物输出装置、基底等装置组成12 ，是9种分泌系统中最为复杂的一种7 。由于组成T3SS各结构成分在不同物种间命名不同，其中在耶尔森菌系统中编码分泌装置的基因被命名为Ysc，研究人员在此基础上使用其后缀，将III型分泌系统.193.分泌装置基因称为Sct，用于分泌和细胞易位，本文则采用标准化的“Sct”进行描述。2.1针状复合物T3SS的核心结构为针复合物(Needlecomplex，NC)，是一种低聚膜包埋复合物，它是一种大型的圆柱形大分子复合物，嵌入细菌的内膜和外膜中，跨越质周空间，并通过针丝延伸到细胞外环境13。这些丝状结构允许这些病原体通过宿主细胞黏液屏障，在与靶细胞接触时，在宿主膜中组装一个易位孔12 ，通过该易位孔注入效应蛋白14。2.2转运孔转运孔是由T3SS转运子SctB和SctE在宿主细胞膜脂质双分子层中形成的异源低聚复合体。SctB和SctE是亲水性的，能够插入宿主质膜上，然后它们寡聚形成易位子孔15。研究发现，转运孔的组装和对接需要借助宿主细胞的趋化因子受体、表面硫酸化和岩藻糖化、波形中间丝蛋白等。2.3内杆蛋白内杆蛋白由SctI亚基螺旋组装而成，通过“插座”结构连接到内膜环上，可将针状复合物锚定到基体16 。研究表明，SctR和SctT的周质结构域与内杆蛋白SctI有一定联系。SctR、Sc tT 和SctI的密切相互作用可能会为底物易位创建连续的导管，其中SctI可以作为适配器将内膜的扁平易位孔与螺旋针丝连接起来，从而为底物从细菌细胞质易位到宿主细胞创造了连续的管道17 。2.4胞质环与分选平台胞质环(SctQ)也称C环15，位于底物输出装置下方，与ATPase复合体(SctN、Sc t O 和SctL)一起组成底物的装载和分选平台18 ，是一种对于T3SS至关重要的外周膜相关蛋白15。其中，胞质环负责底物的装载与卸载，ATPase复合体为整个T3SS的运行提供能量。在分选平台中，ATPase复合体中的SctN由连接蛋白SctO锚定在SctV的异构环上，从而连接ATPase复合体与底物输出装置19。而SctQ和SctK位于SctL的辐条末端，为SctN提供对接位点，将SctN锚定在胞质环上，并调节其活性15,2 0 。2.5输出装置底物输出装置位于基底下方，嵌入在内膜中，充当底物的入口，由SctR、Sc t S、Sc t T、Sc t U 和SctV等5种膜蛋白组装而成17 。SctV及其同系物的大细胞质结构域形成一个非化环，在底物的切换和易位中发挥重要作用2 1；SctU及其同系物在早期分泌到.194.中晚期底物分泌的特异性转换中起作用；基本输出装置组分SctR、Sc t S和SctT在针复合物的组装和分泌过程中起着重要作用，组分中五个SctR和一个SctT组成一个环状结构。另外，实验证实SctR、Sc t S、SctT、Sc t U 的复合物在掺入针复合物基质之前在体内组装，并且这四个输出装置组件在SctR五聚体能够形成具有多种相互作用的紧组件9,17 。实验研究还表明，SctS，Sc t T 和SctU不缠绕在SctR五聚体周围，而是在SctR的一侧形成一个紧凑的组件，其中SctS是与所有其他组件接触的中心组件。SctS，Sc t T和SctU形成的组装还可以促进SctR孔的门控，这对于防止营养和离子泄漏穿过细菌内膜产生有害影响具有重要作用17 。2.6基底T3SS基底是嵌在细菌内外膜上的一系列环状结构，主要由SctC(InvG)、Sc t D(Pr g H)和SctJ(PrgK)构成，其中SctC形成外膜环，SctJ和SctD在内膜上形成同心环。三者都含有1个结构保守的楔形折叠，这是内膜环和外膜环共同的成环基序，有助于环的组装7,2 2 。SctC的N端结构域深入周质，与SctD直接接触，实现内外膜的连接。SctC位于细菌外膜内，是细菌分泌系统中不可缺少的细胞外环境的大门户。SctC结构是一个巨大的双层管状结构，其结构域形成一个八链夹，在细胞外末端分开。外层片构成外壁，内层片形成一个纽结的反平行桶，即支撑外壁又形成内部的“周质门”2 3。同源性区域由N端周质区域和高度保守的蛋白酶耐药C端区域组成。不仅为细菌蛋白在内膜的挤出提供了通道，而且还在其周围质面上与各种输出装置的其他组分提供了关键的结构界面2 2 。在这些结构的出现对“注射体”的整体组装和稳定产生了巨大作用。3T3SS的调节分泌细菌分泌系统的重要功能就是将效应蛋白的特定子集分泌到宿主细胞中，分泌过程中所分泌的效应蛋白不在胞浆间隙中停留，也不被切割，而是直接从胞质运输到宿主细胞中。对分泌过程和机制的研究认为，整个分泌过程可进一步细分为一步分泌机制和两步分泌机制2 4。一步分泌是效应蛋白在分泌过程中不依赖一般(Secretion，Se c)分泌或双精氨酸易位(Twin-arginine translocation，T a t)途径，可直接将底物从细菌细胞质靶向宿主；两步分泌则需要Sec的传输，在分泌过程中首先在细胞内膜上依靠转World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5运体发生易位，一旦进入周质外，底物就会被靶向其中一个分泌系统，然后通过某个分泌系统介导穿过外膜将底物运输释放到细菌细胞外6 。T3SS分泌体系由跨越内膜和外膜的复杂蛋白质结构组成，不依赖于Sec途径，可以将分泌蛋白直接注入宿主细胞，属于一步分泌。当细菌与真核宿主细胞接触后，外界环境因子首先刺激产生分泌信号。II型分泌底物的N端携带Sec-非依赖性信号序列，在分子伴侣的协助下定向结合到分泌通道的入口。转位器在真核宿主细胞膜中形成孔道，使“针头结构”经由孔道刺入宿主细胞，然后效应蛋白通过“针头结构”进入宿主细胞内发挥作用，分泌过程见图1。3.1识别定位T3SS分泌蛋白在其N端含有不可清除的信号序列，出口设备组件SctU和SctV，胞质环，ATP酶复合物和SctW负责介导分泌途径中的分泌顺序，膜靶向和导出2 5。3.2通道开放通过注射体的蛋白质分泌以连续的步骤进行，不同的切换机制确保了分泌层次结构。有两种分泌模型：第一种是内杆SctI在输出装置的周质与SctU相互作用，导致其易位到基底体并与分泌素SctC结合15。之后，SctI以某种方式调节针的长度并促进SctU的自体蛋白水解；第二种是，一旦针或细丝结构达到正确的长度，完全扩展的SctP锚定在其上的SctU的自体蛋白发生溶解2 5。而守门的SctW在中后期底物分泌过程中起着重要作用，没有SctW，易位子(中间底物)不分泌，效应子(晚期底物)过度分泌。并且它与易位子相互作用，能够促进分泌，促进易位子孔打开。一旦宿主质膜中的易位子孔形成，离子流到细菌细胞质可效应分子SctlBctU基体所示分泌过程：细菌分泌的效应分子通过细菌I型分泌系统与宿主分子结合的过程。在这过程中效应分子携带信号序列，在分子伴侣的协助下定向结合到分泌通道的入口，易位子在宿主细胞膜中形成孔道，使“针头结构”经由孔道刺入宿主细胞，然后效应分子进入宿主细胞内发挥作用。周质门开放SctC效应分子宿针尖蛋白膜宿主分子图1分泌过程SctF组装形成针易位子SctPOH国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期能改变局部电位，也因电位改变导致SctW从膜上分泌，SctW从膜上脱落驱动了晚期底物的分泌15。3.3靶向受体在靶向受体过程中，主要是输出装置SctV的主要成分与伴侣一分泌蛋白复合物之间的相互作用。研究表明，SctU和SctW的构象改变及膜电位的局部变化可能改变SctV与伴侣一分泌蛋白复合物的亲和力，从而对分泌步骤有一定的调节作用15。4抑制T3SS功能可能的靶点干扰T3SS发挥分泌功能进程的每个阶段都可能减少或阻断细菌的毒力效应因子的释放。现有研究资料表明，T3SS的针尖结构、基底组装的过程调控以及效应蛋白是最主要的抑制T3SS功能可能的靶点。4.1作用于针尖蛋白主要由于针尖蛋白的特殊结构，小分子抑制剂能够与针尖蛋白结合。抑制剂在结合过程中会以不同的形式阻塞效应分子通过针尖孔道，主要形式有：小分子抑制剂直接阻塞针孔道2 6 ；抑制剂在不阻塞孔隙的情况下与针尖结合，使效应分子不能够顺利到达宿主膜上；还有一种是小分子抑制剂与针尖结合，使针尖蛋白的构象发生改变2 7 ，造成其效应分子不能通过孔道。4.2影响基底的组装过程T3SS结构形式“注射器”样，但细致划分出来是由许多亚基组装而成，各个亚基之间相互协同，相互作用，共同调节着效应分子的分泌。对于基底的抑制，一种是抑制基底的组装。研究发现，抑制组装的任何一个步骤都可能阻止针的形成，从而阻止效应分子分泌到宿主细胞中2 8 。另一种是抑制周质门，在基体的SctC内，有一个周质门，它参与针的形成，它通常有闭合、半开放、开放等三种构象。当处于闭合状态时，针不能伸出，效应分子也就不能够与宿主分子结合；当处于开放状态则能够顺利分泌到宿主2 9。因此，对于周质门的调节主要由于SctC构象的改变。典型的噻唑烷酮类抑制剂则是通过影响SctC构象的改变，阻止周质门的开放，抑制针的形成，进而有效阻止效应分子分泌到宿主细胞。4.3阻断效应分子靶向宿主细菌分泌的毒力或效应分子蛋白等通过分泌系统针状孔道进入宿主，并与宿主结合，发挥作用。可以抑制效应分子的黏附、内化和干扰效应分子的伴侣蛋白等途径来抑制效应分子与宿主的结合30 ,.195.从而达到抑制分泌效应功能的目的。对于黏附过程的抑制，主要是效应分子易位的黏附素受体(Tir)的N端与黏附素的结合，C端则会与多个宿主因子相互作用，最终调节效应分子的分泌31；对于内化的抑制过程，主要是效应分子与宿主因子的结合，导致肌动蛋白重排和聚合，肌动蛋白重排导致膜褶皱的形成32 ，之后则会吞噬细菌细胞，发生内化。效应分子能否顺利通过针孔通道进入宿主，还需要有一个关键蛋白，即分子伴侣蛋白33。在伴侣蛋白存在的情况下，效应分子会与伴侣蛋白结合，进而使效应分子通过T3SS进行分泌34。对效应分子伴侣蛋白的抑制也能有效抑制效应分子顺利通过针孔通道。5T3SS抑制剂T3SS分泌系统抑制剂根据其作用机制大致可分为3类35：(1)转录抑制剂。菌体与宿主结合后，系统的相关转录被激活，而在转录过程中起重要作用的是ExsA转录因子。Marsden等发现N-羟基苯并咪唑能够结合ExsA，并抑制它的转录激活活性，从而降低细胞毒性作用36 。(2)外毒素抑制剂。T3SS分泌毒性最大的外毒素为ExoU，它作用于宿主的磷脂酶A2可引起宿主的死亡，研究发现磺胺类药物能够高强度抑制ExoU酶活性。(3)针管状结构蛋白抑制剂。在细菌的外表面，存在一种针管状的复合物37 ，其能够将外毒素转运至细胞。位于针管状结构尖端的一种转运蛋白PcrV可以控制菌体通过T3SS分泌外毒素。针对PcrV抑制剂的研究多数集中在单克隆抗体上35。5.1水杨基酰肼类水杨酰肼类及其衍生物(主要包括磺酰氨基苯甲酰苯胺、水杨酰亚胺和水杨酰肼等三种化合物，图2)是研究较早的一类小分子T3SS抑制剂38 。不同化合物对转录和运动性有着不同的影响，进而产生不同的靶标和作用机制。磺酰氨基苯甲酰苯胺不影响T3SS的运动性和一般的转录调控2 9；水杨酰亚胺对运动没有影响，可能通过影响双组分信号传导，从而间接影响T3SS分泌，同时对转录激活也有一定影响，抑制T3SS基因的转录39；而水杨酰耕能够影响其分泌和运动，但不会影响转录40 。在大肠埃希菌中，该类抑制剂可以靶向WrbA，T p x 和Flox等T3SS0图2 水杨基酰肼类结构通式38 H.196.调节蛋白，通过直接结合和干扰T3SS基础装置相关的蛋白来发挥作用39。5.2噻唑烷酮类噻唑烷酮是一种饱和杂环噻唑，含有羰基官能团（图3），主要有噻唑烷-2-酮、噻唑烷-4-酮和噻唑烷-5-酮41。在对沙门菌研究过程中，鉴定出2-亚氨基-5-芳基噻唑烷酮是T3SS的广谱抑制剂，其杂环在一系列连接子末端显示为二聚体，一些二聚体则对于毒力蛋白的分泌起到抑制作用42 。通过纯化沙门菌的针状复合物，研究人员发现化合物处理的样品具有较低水平的针状成分，但全细胞水平不变40 。由此可见，该化合物通过破坏分泌素之间的相互作用起作用，从而影响针状复合物的组装和稳定性，但对纤毛系统没有影响40 。研究还发现，该化合物能够通过靶向多蛋白系统的外膜环蛋白来阻止毒力蛋白的分泌43。OH:CO图3噻唑烷酮类结构通式42 5.3苯氧乙酰胺苯氧乙酰胺衍生物（图4）能够特异性地影响某些T3SS效应因子的分泌和转运，从降低T3SS介导的细胞毒作用，并促进细胞中细菌的内化44。该抑制剂与靶蛋白结合后，能够干扰影响感染持久性、扩散性的效应蛋白ExoS或ExoU的分泌或转运。2014年，Bowlin等发现苯氧乙酰胺等衍生物对突变株T3SS针状复合物PscF基因有一定影响，能够影响T3SS的分泌和易位45。该研究表明，苯氧乙酰胺抑制剂与组装的PscF针状复合物结合34.46 ，一方面通过影响亚基之间的相互作用来抑制针状复合物的组装和稳定性；另一方面通过与针腔结合来改变其亲水性来抑制其功能，从而阻断T3SS功能45。5.4喹啉类VirF是一种AraC家族转录激活剂，能够直接激活icsA和virB毒力基因的表达，是T3SS表达所必需的。喹啉是一种AraC家族抑制剂（图5），它选择地抑制两个AraC家族激活剂RhaS和RhaR。在对于喹Cl图4苯氧乙酰胺类结构通式44World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5R1OH图5喹啉类结构通式47 啉类T3SS抑制剂的研究发现，该化合物有效地抑制了VirF与DNA的结合，从而抑制AraC家族在体内激活转录的能力。一种类似物8-羟基喹啉类抑制剂在发挥作用过程中能够阻断负调控因子ExsE经T3SS向胞外分泌，不利于胞内ExsC-ExsD复合物的形成，使得ExsA无法激活T3SS基因的转录47 。研究还发现其化合物能够作用于鞭毛和T3SS的注射体中的ATP酶，能够抑制ExoS和FliC的分泌以及鞭毛的运动。此外，羟基喹啉保护真核细胞免受T3SS介导的细胞毒性，并抑制半胱天冬酶的活性和在吞噬细胞中的IL-1释放44。5.5N-羟基苯并咪唑类通过计算机筛选与属于AraC家族的大肠埃希菌OCH3中基因表达调节因子的DNA结合结构域相互作用的小分子，发现N-羟基苯并咪唑类药物是以多重适应OH反应(MAR)蛋白(如E.coli的MarA、So x S和Rob等)为靶标的小分子抑制剂。MAP蛋白的特征是两个高度保守的双螺旋DNA结合结构域，能够控制细菌引起的感染，抵抗抗生素和适应外部环境的能力。AraC家族的蛋白质可以通过调控对抗生素和氧化应激的抗性、T3SS的表达、毒素产生以及感染期间相关重要过程来调节毒力48 。N-羟基苯并咪唑及其衍生物（图6）可以结合一些转录因子(LcrF、Ex s A 等)的DNA结合域后49，如能够与ExsA的羧基末端结构域相互作用。另外还存在变构机制，如N-羟基苯并咪唑结合诱导DNA结合结构域的结构改变50 ，阻止其与DNA上的启动子位点结合44，从而抑制ExsA-DNA复合物的形成51。5.6酚酸类除亚水杨基酰肼和羟基苯并咪唑衍生物能够抑制T3SS基因表达外，某些天然来源的酚酸类成分（图7）也有类似的活性47 。研究发现，P-香豆酸、O-香豆酸、反式肉桂酸等能够抑制植物病原体的T3SS基因的表达52 ，通过操纵T3SS的表达来防御细OHRR1图6 N-羟基苯并咪唑类结构通式47-LinkerN国外医药抗生素分册2 0 2 3年5月第44卷第3期R2图7 酚酸类结构通式52 菌病原体53。对于许多细菌能够使用调控系统GacS/A和由T3SS基因簇中心的基因HrpX/Y编码的双组分系统(TCS)来感知其环境并调节基因以响应环境变化；对于香豆素则通过T3SS的核心调节器HrpX/Y双组分系统抑制了T3SS调控基因的表达54，而不是通过调节剂GacS/A来间接调节T3SS。5.74-甲基苯酚T3SS的基质由称为Ysc(Yop分泌)的蛋白组成，从基部延伸出来的是一个空心针状结构，由YscF的重复亚基组成。针末端的孔由LcrV、Yo p B、Yo p D 三种蛋白组成。4-甲基苯酚化合物（图8）能够与YopD相互作用从而有效抑制Yop的分泌55。HO图8 4-甲基苯酚结构式55.8AurodoxAurodox是最初于19 7 3年被发现的一种抗生素化合物，对革兰阳性菌具有抗菌作用。在新型T3SS抑制特性的研究表明，Aurodox能够下调肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EH EC)T3SS的表达56 ；转录组学分析表明，其作用于肠细胞消失位点(Locus of enterocyte effacement,LEE)基因主调控因子Ler的上游2 5，而不是直接作用于分泌系统本身。研究发现：（1)Aurodox能够抑制T3SS相关效应蛋白的易位；(2)抑制EHEC附着于上皮细胞和去除上皮细胞的能力；(3)抑制多种毒力基因的表达，如能够抑制LEE基因中包括主调节因子Ler和grlA在内的2 5个基因表达57 。对于Ler的调节机制，一方面可能直接抑制Ler的表达；另一方面可能与T3SS的组分结合导致Ler的负反馈，从而影响Ler的上游调节器。此外，还抑制了编码T3SS分泌的非编码效应蛋白的基因的表达，如NleB和EspG58。5.9Csn-BCsn-B(Cytosporone B，图9)通过 Hha-H-NS-HilD-HilC-RtsA-HilA调节途径影响鼠伤寒沙门菌染.197.色体插入物沙门菌毒力岛1(SPI-1)相关基因的转录59。Csn-B及其衍生物对SPI-1介导的HeLa细胞侵袭表现出NO2很强的抑制作用6 0 ，但未观察到对细菌有毒性。类核蛋白Hha和H-NS与SPI-1调节基因hilD，h i l C和rtsA的启动子结合以抑制其表达，从而调节SPI-1装置和效应基因的表达6 1。研究结果发现Csn-B上调了hha和hns的转录。另外，Csn-B及其类似物能够阻断沙门菌SPI-1相关效应蛋白的分泌，但不影响鞭毛蛋白FilC在体外的分泌6 2 。HO图9 Csn-B结构通式6 0 5.10黄酮类Guo等6 3 研究发现，异戊二烯化类黄酮及其类CH3似物对沙门菌SPI-1相关效应蛋白的分泌具有抑制作用，但不会影响鞭毛蛋白FilC的分泌和细菌的生长；另外黄酮类似物柠檬黄酮醇能够通过调节AicA/InvFOH基因的转录和效应蛋白SipC的转运，从而对SPI-1效应蛋白的分泌起到抑制作用6 4。CH35.11 盐酸血根碱研究发现天然化合物盐酸血根碱（图10）可以减少SPI-1编码的III型分泌系统主要毒力蛋白SipA和SipB的产生，并防止鼠伤寒沙门菌侵袭HeLa细胞的能力，而不会影响沙门菌的生长6 5。5.12Harmine研究发现，Harmine（图11）能够抑制T3SS调节基因HilA的转录和表达，降低鼠伤寒沙门菌T3SS效应蛋白Sipa、Si p B和SipC的表达，从而抑制T3SS效应蛋白的分泌和表达，最终减弱鼠伤寒沙门菌的侵袭力6 6 ，是T3SS靶向抑制剂。5.13SAHsSAHs首次发现在2 0 0 3年，该化合物及其衍生物N+=CI-图10盐酸血根碱结构式6 H图11 Harmine结构式6 OH.198.对结核杆菌、鼠伤寒沙门菌、链球菌T3SS具有抑制作用2 5，能够降低鼠伤寒沙门菌和链球菌感染期间的巨噬细胞毒性和上皮细胞侵袭6 7 。Hudson等6 8 研究发现能够抑制SPI-1编码的T3SS在鼠伤寒沙门菌中的分泌以及SPI-1介导的分泌和炎症反应。目前对于该化合物的具体作用机制尚不清楚，可能是通过多种细菌蛋白来抑制T3SS，对多种途径进行干扰。6总结与展望近年来，随着超级耐药菌的层出不穷，抗生素耐药性也急剧增加，已成为全球关注的重大公共卫生问题。鉴于新型抗菌药物研究周期长、成本高以及细菌极易对抗生素产生耐药等问题，研究人员逐渐由之前杀死细菌向抑制细菌毒力方向转变。细菌分泌系统恰是分泌毒力因子等效应蛋白所必需的通道，抑制效应蛋白的分泌，在分泌过程中阻断细菌毒力的传播，成为一个很不错的选择。革兰阴性菌在生产生活中危害极大，而T3SS是革兰阴性菌主要的毒力装置，在革兰阴性菌感染过程中发挥重要作用，自然成为抗毒力策略的重要选择目标。目前，尽管T3SS抑制剂取得了一定进展，已经涌现出一些具有前景的T3SS抑制剂（图12）。但是T3SS抑制剂的研究仍较为缓慢，多是在老药的基础上进行改造，研制其衍生物，由于其作用的机制研究不够深入，所以抑制机理也不是完全清楚。当前中药有效成分等天然产物是一个超级庞大的化合物库，有关T3SS抑制剂的筛选研究已逐渐转向从天然产物中开发可能的新型抑制剂，这又为T3SS等细菌分泌系统抑制剂的筛选和应用注入了新的源泉。总之，对于T3SS及其抑制剂的研究仍有广阔的空间和应用前景，需要进一步发掘其新的分泌机制与新亚水杨基酰肼类噻唑烷酮类莱氧之酰胺*作用于针针尖复合尖物SctBSCtECtE效应蛋白分泌*AurodoxSAHsHarmineCsn-B黄酮类盐酸血根碱注：所示为上述13种抑制剂作用的部位，主要作用于效应蛋白的分泌、针尖、针尖复合物、基体蛋白、影响基因表达等。图12 抑制剂作用机制World Notes on Antibiotics,2023,Vol.44,No 5的抑制手段，对未来新型抗生素的研发，药物“佐剂”的应用具有重要的作用，为抑制剂从研究走向运用奠定基础。参考文献1 MMiller B J,Wilensky G.New drugs,new ideas:Paymentpolicy innovations for high-cost pharmaceuticals J.Milbank,2019,97(4):922-925.2 黄祺，唐洪波，胡明冬，等.抗菌药物耐药性应对策略研究进展.实用医药杂志,2 0 19,36(0 4)：36 7-37 0.3 Huang B,Zhang Y.Teaching an old dog new tricks:Drugdiscovery by repositioning natural products and theirderivatives J.Drug Discov Today,2022,27(7):1936-1944.4 Chang R Y K,Nang S C,Chan H K,et al.Novelantimicrobial agents for combating antibiotic-resistantbacteria J.Advanced Drug Delivery Reviews,2022,187:114378.5 Hotinger J A,May A E.Antibodies inhibiting the typelIIsecretion system of Gram-negative pathogenic bacteria J.Antibodies,2020,9(3):35.6 Green E R,Mecsas J,Kudva I T.Bacterial secretionsystems:An overviewJ.Microbiol Spectr,2016,4(1):10.7刘静，张昭寰，吴倩，等.细菌分泌系统的结构及作用机制研究进展.生物化学与生物物理进展,2 0 2 2,1:2 8.8刘伟，庞建，刘占英，等.革兰氏阴性细菌蛋白分泌系统研究进展.微生物学通报,2 0 2 2,49(0 2)：7 8 1-7 93.9 Zilkenat S,Franz-Wachtel M,Stierhof Y D,et al.Determination of the stoichiometry of the completebacterial typellI secretion needle complex using a combinedquantitative proteomic approach J.Mol Cell Proteomics,2016,15(5):1598-1609.10 Horna G,Ruiz J.Type 3 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