西方蜜蜂m 6A甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式.pdf

【目的】本研究旨在克隆西方蜜蜂 甲基转移酶 ()基因 分析 的理化性质和分子特性以及 在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式并制备 多克隆抗体为持续深入开展 的功能研究提供参考和基础【方法】通过 扩增西方蜜蜂 的 并进行 测序验证 使用相关生物信息学软件对 进行生物信息学分析并构建系统进化树 通过原核表达系统诱导表达 融合蛋白免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体利用 和 分别检测抗体的效价及特异性 采用 检测 在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮 种组织中的相对表达量【结果】成功克隆到西方蜜蜂 的 的分子式为 分子量约为.脂溶系数为.理论等电点为.平均亲水系数为 不含典型的跨膜结构域和信号肽可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质西方蜜蜂、中华蜜蜂.、黑大蜜蜂.、东方蜜蜂.、大蜜蜂.、小蜜蜂.、欧洲熊蜂 、金环胡蜂 、美洲东部熊蜂.和黑腹果蝇 的 均含有 结构 域 和 个 相 同 的 保 守 基 序 与黑大蜜蜂的 的氨基酸序列一致性最高(.)且亲缘关系最近 制备的 多克隆抗体效价较高(大于)且特异性较强 在 和 日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在 日龄幼虫中的表达量在 日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量在 和 日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于 日龄工蜂成虫体内的表达量 在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量【结论】研究结果表明 可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白 在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用制备得到的 的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强为进一步探究 的功能及其参与的表观调控机制打下了基础关键词:西方蜜蜂 甲基腺苷 甲基化转移酶 时空表达模式 抗体 昆虫学报 卷中图分类号:文献标识码:文章编号:()(:)(.().):【】().【】.【】.().().【】.:期吴 鹰等:西方蜜蜂 甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式 甲基腺苷()是真核生物中最常见、含量最丰富的一类 修饰不仅参与调节 的剪接、翻译和稳定性而且在细胞生长、增殖和分化等众多生命活动中发挥关键作用(.)修 饰 是 由 甲 基 转 移 酶()、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白共同决定的动态可逆过程()甲基转移酶 和 组成复杂的蛋白复合物进而发挥作 用(.)其 中 甲 基 转 移 酶()作为催化 形成的重要组分与 一起形成稳定的 异二聚体核心复合物(.)目前 甲基转移酶的结构和功能仅在智人 等极少数模式生物被研究得较为深入(.)但昆虫中的相关研究十分滞后 蜜蜂的 研究迄今仅有 例报道(.)等()通过对西方蜜蜂 蜂王和工蜂幼虫进行 转录组测序和比较发现幼虫发育过程伴随着 峰的明显升高 甲基化与基因表达间存在负相关性一些与级型分化相关的转录本发生差异 甲基化西方蜜蜂具有性情温顺、易于驯化及采集力强等优点因而在世界各国的养蜂生产中广泛使用(曾志将)此外西方蜜蜂也是自然界中不可替代的授粉昆虫和社会行为学模式昆虫具有重要的生态与研究价值(曾志将)目前西方蜜蜂 ()的研究滞后相关信息匮乏 本研究对 进行分子克隆通过生物信息学解析 蛋白的理化性质和分子特性并对西方蜜蜂和其他昆虫的 进行 系 统 进 化 分 析 制 备 多 克 隆 抗 体 检 测 在西方蜜蜂工蜂不同发育阶段及刚出房工蜂成虫不同组织中的时空表达谱以期丰富 的 相 关 信 息 为 进 一 步 开 展 的功能研究提供参考并为深入探究 甲基化介导的表观调控机制打下基础 材料与方法.供试生物材料西方蜜蜂工蜂取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)教学蜂场的饲养蜂群 选取群势较强的西方蜜蜂蜂群提取一张卵虫巢至实验室在显微镜下用干净的移虫针将卵()收集至干净的离心管中 同时按照本实验室已建立的方法(陈大福等)进行幼虫饲养和取样:将 日龄幼虫移至预 置 饲 料 的 孔 培 养 板 置 于 温 度(.)、相对湿度 的恒温恒湿箱(精科 上海)饲养每 更换新鲜饲料分别收集 日龄幼虫()、和 日龄预蛹()和 日龄蛹()另选取一张将要出房的成熟封盖子脾放入恒温恒湿培养箱(.)待其羽化出房后参照杜亚丽等()的方法用无味无毒的油漆在背部进行标记(记为 )后放回原蜂群(约 头)分别在 和 日龄时进行收集工蜂成虫样品()参照张莉等()报道的方法收集刚出房的工蜂成虫并置于冰上麻醉在超净工作台中用干净的眼科镊和眼科剪小心剖取触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺整个过程均在冰上完成以最大限度防止组织 降解剖取的组织放入干净的无 酶离心管经液氮速冻后转移至 超低温冰箱保存备用 上述实验均进行 次生物学重复.扩增 的 和 测序验证参照 等()从 数 据 库(:./)中查询和下载西方蜜蜂(登录号:)的核苷酸序列利用诺唯赞单片段克隆在 线 软 件(:./.)设计上下游引物/(表)并分别在上下游引物的 端引入和 的酶切位点委托上海生工生物工程有限公司合成 利用 抽提试剂盒(美国)提取西方蜜蜂 日龄工蜂中肠样品()的总 作为模板再利用 ()引物进行反转录得到的 作为模板进行 扩增 反应体系():上下游引物(./)各 无菌水 反应程序:预变性 变性 退火 延伸 共 个循环 产物经.的琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪(培清上海)下进行观察和拍照并回收目的片段(吴鹰等)与 和 酶切的 载体(索莱宝 北京)进行连接反应构建重组质粒 昆虫学报 卷表 引物信息 引物引物序列()用途小写字母表示 启动子序列 .继而将重组质粒转化大肠杆菌 感受态细胞(全式金 北京)挑取为阳性的菌液送至上海生工进行 测序.生物信息学分析参照范元婵等()的方法利用 网站上的 工具(:./)预测 的氨基酸序列 通过 网站(:./)上的 和 软件分析 的理化性质、亲水性和三级结构利用.和 等软件预测信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构 使用 (:./.)软件(.)进行亚细胞定位预测 参照邢晋祎等()报道的方法利用 的 工具(:./.)分析预测 的结构域 从 数据库(:./)中查询和下载西方蜜蜂、中华蜜蜂.、黑大蜜蜂.、东方蜜蜂.、大蜜蜂.、小蜜蜂.、欧洲熊蜂 、金环胡蜂 、美洲东部 熊 蜂.和 黑 腹 果 蝇 的 氨基酸序列 然后通过 软件(.)预测上述 个物种 中的结构域采用默认参数 使用 软件()预测上述 个物种的 的保守基序采用默认参数.系统进化分析使用 工具将 的氨基酸序列比对到 数据库(:./.)以 搜 索 序 列 相 似 性 较 高 的 蛋白并下载氨基酸序列 通过.软件(加拿大)对西方蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、熊蜂、金环胡蜂、美洲东部熊蜂、黑腹果蝇、智人和小白鼠 的 进行氨基酸序列多重比对并利用 .软件(.)的邻接法()构建基于 氨基酸序列的系统进化树设置 次重复其他参数均为软件默认.原核表达与纯化将.节构建好的 质粒转化 ()感受态细胞(全式金 北京)转化产物复苏后涂板到含卡那霉素的 固体培养基挑取白色单菌落至 液体培养基(含卡那霉素)摇床震荡培养过夜 取 菌液转接至 含卡那霉素的 液体培养基放入 /的摇床震荡培养待菌液的 值达到约.时加入 /(索莱宝 北京)进行诱导表达继续培养 后将菌液转移至干净的离心管 /离心 弃上清后加入 蛋白上样缓冲液(雅酶 上海)和 缓冲液重悬沉淀将上述悬液转移至干净的离心管 加热 后 /离心 取上清进行 检测 由于诱导表达的蛋白 端带有 标签使用 对融合蛋白进行验证采用 ()(博奥森 北京)作为一抗使用 标记的 /(博奥森 北京)作为二抗经 显色后在 凝胶成像系统(美国)下进行观察和拍照将上述蛋白表达产物 /离心 收集沉淀用裂解液(/.)重悬沉淀后加入 /然 期吴 鹰等:西方蜜蜂 甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式 后使用超声波细胞破碎仪(小美超声 昆山)进行处理 /离心 收集沉淀后进行称重每克沉淀加入 洗涤液(/尿素 /.)后震荡洗涤 离心收集包涵体沉淀再加入 溶解液(/尿素 /.)处理 离心收集上清液经.滤膜过滤后按照 ()试剂盒(生工生物工程股份有限公司 上海)说明书进行蛋白梯度纯化 将纯化过程中的洗涤液上样液、流穿液、不同浓度咪唑(和 /)下的洗脱液进行 以检测蛋白纯化效果 收集纯化好的蛋白使用透析膜进行梯度透析经 浓缩后使用 蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝 北京)进行蛋白浓度测定使用酶标仪(美国 美国)在 波长下进行检测根据标准曲线计算蛋白浓度.多克隆抗体制备及特异性检测将.节浓度达标的纯化蛋白作为抗原与等体积弗氏完全佐剂和不完全佐剂(美国)混匀乳化免疫两只新西兰大白兔第/和 天连续免疫 次第 天耳静脉采血利用 试剂盒(谷研 上海)进行检测次日颈动脉采全血离心后收集血清再利用 试剂盒对血清进行抗体效价检测从蜂群中收集西方蜜蜂工蜂 日龄幼虫(总重量约 )液氮速冻后充分研磨成粉末然后在粉末中加入 蛋白提取液冰上静置 /离心 后吸取上清即获得幼虫总蛋白用于 检测抗体特异性 分别取 上述蛋白提取液并加入 蛋白上样缓冲液 加热 后 /离心 取 上清进行 然后转膜到.的 膜上置于 的脱脂奶粉封闭液(雅酶 上海)中封闭 加入 抗体(稀释/)孵育 洗膜液洗膜 次每次 再加入 标记的羊抗兔 ()(稀释/)室温孵育 后洗膜 次每次 吸干 膜表面液体放入 显色液 后在 多功能成像仪(美国)下进行观察和拍照.时空表达谱检测基于.节克隆的 的 使用 软件设计引物/(表)以(登录号:)作为内参基因引物序列见表 使用 抽提试剂盒(美国)分别提取.节不同发育阶段和不同组织样品的总 反转录合成 通过 荧光定量 系统(公司美国)检测 在不同发育阶段和不同组织中的相对表达量 反应体系和条件参照郭意龙等()的报道进行设置 每个反应均进行 次技术重复.数据分析采用 法()计算 的相对表达量 并利用 软件进行数据分析并绘图 利用 软件()对 在各发育阶段和不同组织中的相对表达量进行单因素方差分析()并利用 氏检验分析实验数据 结果.的理化性质和分子特征成功克隆到西方蜜蜂 的 长 可编码 个氨基酸其中含量最高和最低的氨基酸分别是异亮氨酸()和尿蛋氨酸()的分子式为 分子量约为.脂溶系数为.等电点为.含 个负电荷氨基酸(个 和 个)与 个正电荷氨基酸(个 和 个)平均亲水系数为.亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸说明该蛋白可能为亲水性蛋白不含典型的跨膜结构域和信号肽说明其可能为非跨膜蛋白和胞内蛋白含 个丝氨酸磷酸化位点、个酪氨酸磷酸化位点及 个苏氨酸磷酸化位点可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质 占比分别 为 .和.含 个(.)无规 则 卷 曲 个()螺 旋 个()延长链和 个()转角三级结构显示 是一个复杂的空立体结构.的保守性及系统进化预测结果显示 含 个 结构域属于 超家族成员 结构域位于第 位氨基酸之间在中华蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、金环胡蜂、美 昆虫学报 卷洲东部熊蜂和黑腹果蝇的 中同样预测出 个 结构域说明 在这些物种中高度保守 此外在 中鉴定到 个保守基序:和 在上述其他 个物种的 中也鉴定到这 个保守基序进一步说明 在这些昆虫物种中具有高度保守性序列比对结果显示西方蜜蜂 与个膜翅目昆虫中华蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、金环胡蜂和美洲东部熊蜂的 氨基酸序列一致性较高介于.与 黑 大 蜜 蜂(登录号:)的氨基酸序列一致性最高(.)与智人 (登录号分别为.和.)的氨基 酸 序 列 一 致 性 最 低(分 别 为 和)(图)系统进化分析结果显示西方蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、小蜜蜂、大蜜蜂、金环胡蜂、欧洲熊蜂、美洲东部熊蜂和黑腹果蝇的 聚为一支智人与小鼠的 聚为一支(图)西方蜜蜂与黑大蜜蜂的 进化距离最近与东方蜜蜂的 的进化距离次之(图)以上结果进一步说明上述不同蜂的 具有高度保守性西方蜜蜂与黑大蜜蜂的 亲缘关系最近.的原核表达和多克隆抗体 结果显示 诱导表达的融合蛋白大小约为 (图:)符合理论分子量 检测到大小约 的条带(图:)以上结果说明成功诱导表达出 融合蛋白 通过 琼脂糖纯化树脂纯化大量诱导表达的蛋白 检测结果显示 和/咪唑洗脱液均能洗脱纯化目的蛋白其中 /的咪唑洗脱液洗脱效果最好(图:)收集洗脱液后进一步透析和浓缩 蛋白测定结果显示浓缩液中蛋白浓度达到./检测结果显示 多克隆抗体效价均大于 表明制备的抗体效价和灵敏度较高 检测结果显示检测到大小约 的 融合蛋白(图:)表明制 备 的 抗体具有较强的特异性.西 方 蜜 蜂 工 蜂 不 同 发 育 阶 段 和 组 织 中 的相对表达量 结果显示 在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在显著差异 在 和 日龄预蛹中的表达量与卵中的相近且均显著高于 日龄幼虫中的表达量(.)在 日龄蛹中的表达量最高且显著高于卵、幼虫、预蛹和蛹中的表达量(.)(图:)在不同日龄工蜂成虫体内均有表达但表达量存在显著差异 在 和 日龄成虫体内的表达量显著高于 日龄成虫体内的表达量(.)在 日龄工蜂成虫体内达到最高(图:)在西方蜜蜂工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在显著差异 在脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量(.)在中肠中的表达量最低在咽下腺中的表达量最高(图:)讨论此前 等()利用 检测了 在西方蜜蜂蜂王幼虫和工蜂幼虫发育过程的表达谱但 序列来源于生物信息学预测 本研究中 和 测序结果显示成功克隆到 的 为进一步开展 的相关研究提供了序列基础 生物信息学分析结果显示 可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体体现出 功能的潜在广泛性和重要性也符合甲基转移酶机制主要位于核斑点这一事实(.)以上结果丰富了 的理化性质和分子特性信息为深入开展 的功能研究提供了参考和依据 是(腺苷)甲基转移酶的关键亚基(.)具有甲基转移酶复合物的/亚 基 的 催 化 位 点()可使前体 中的腺嘌呤发生序列特异性甲基化(.)等()通过 实验证实 广泛分布在人体的多种组织中 等()发现 可通过提高 的 修饰水平促进成熟 的加工进而加强动脉粥样硬化血管内皮细胞的增殖和侵袭 等()研究发现 与小鼠的精子发生具有关联性 本 期吴 鹰等:西方蜜蜂 甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式 图 西方蜜蜂与其他 个物种 氨基酸序列多重比对.蛋白来源物种 :西方蜜蜂 :黑大蜜蜂 :东方蜜蜂 :大蜜蜂 :小蜜蜂 :欧洲熊蜂 :金环胡蜂 :美洲东部熊蜂 :黑腹果蝇 :智人 :家鼠 .图 同.不同颜色代表各物种间氨基酸序列的比对率 黑色示小于 重合绿色示 重合红色示大于 重合 .研究发现西方蜜蜂 含有 中华蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、金环胡蜂、美洲东部熊蜂和黑腹果蝇 的 中也都含有 表明 在上述昆虫中较为保守 推测 具有与人类和小鼠等哺乳动物的 类似的功能 哺乳动物 相关报道可为 的功能研究提供参考和借鉴 另外还发现上述 种昆虫的 均含有相同的 个保守基序(和 )此外西方蜜蜂的 与上述 种膜翅目昆虫的 氨基酸序列一致性较高(图)进一步表明 在这些昆虫中具有高度保守性 系统进化分析结果显示(图)西方蜜蜂、黑大蜜蜂、东方蜜蜂、小蜜蜂和大蜜蜂的 聚为一个大支其中西方蜜蜂与黑大蜜蜂 的 之 间 的 进 化 距 离 最 近 表 明 昆虫学报 卷图 邻接法构建的基于氨基酸序列的西方蜜蜂与其他 个物种 的系统进化树(次重复).()图 重组蛋白 的 ()和 ()检测以及纯化蛋白的 检测()和多克隆抗体的 检测().()()()():蛋白分子量标准 :/尿素洗涤液/:上样液 :流穿液 :分别用 和 /咪唑洗涤的洗脱缓冲液 /:分别用 和 /咪唑洗涤的洗脱液 /.在蜜蜂属的不同蜂种中保守性较高西方蜜蜂与黑大蜜蜂的 亲缘关系最近 从物种演化的角度来看黑大蜜蜂与大蜜蜂同属于大蜜蜂类群(曹联飞等)其亲缘关系应该最近而基于 序列的建树结果黑大蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系最近这可能是基因树与物种树不一 期吴 鹰等:西方蜜蜂 甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式 图 在西方蜜蜂工蜂不同发育阶段()和刚出房工蜂成虫不同组织中()的相对表达量.()()图中数据为平均值 标准误 柱上不同字母表示差异显著(氏检验).().致的情况 因此可参考 序列尝试克隆其他蜂种的 区进而开展相关功能研究本研究中 在卵、日龄幼虫、和 日龄预蛹、日龄蛹和不同日龄工蜂成虫中均有表达但表达水平同样存在差异(图:)表明西方蜜蜂工蜂的发育历程伴随着 修饰的动态变化暗示 修饰广泛参与调节工蜂生长和发育 蜜蜂是一种完全变态昆虫蛹期体内组织消解和重组(曾志将)本研究中的表达量在西方蜜蜂工蜂蛹中的表达量最高且显著高于卵中的表达量推测 在西方蜜蜂工蜂蛹期发育中发挥重要功能但仍需要进一步探究前人研究表明 表达具有组织特异性(马兰花等)本研究发现 在西方蜜蜂工蜂的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异(图:)符合 的表达特点 蜜蜂的触角是蜜蜂听觉和嗅觉的感受器主要作用是感知周围环境和接收化学信号()蜜蜂咽下腺又称王浆腺是蜜蜂合成和分泌蜂王浆的主要腺体(李兆英等)在咽下腺中的表达量最高接近于触角中的表达量表明 修饰可能参与调节西方蜜蜂工蜂的信号感知与王浆合成及分泌过程 表皮的蜜蜂抵御病原微生物入侵的第一道防线 蜜蜂中肠是食物消化、营养吸收和免疫防御的主要器官脂肪体既是脂肪、蛋白质和碳水化合物代谢的中心又是主要激素如蜕皮激素和保幼激素等作用的靶组织还具有贮存、解毒和免疫等重要功能(李兆英)本研究表明 在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中均有表达但表达量低于触角中的表达量表明 在西方蜜蜂工蜂的上述不同组织中广泛分布和表达推测 修饰在西方蜜蜂工蜂的消化吸收、新陈代谢和免疫防御等过程发挥调控作用原核表达系统因具有表达量高、成本低和易于操作等优点而成为应用最为广泛的蛋白表达系统之一(张磊等)但在利用原核表达系统表达真核生物但时常由于细胞密码子偏好性导致基因无法正常表达或容易形成无活性的包涵体蛋白 目前由于缺乏特异性抗体西方蜜蜂 蛋白的研究滞后且不够深入 本研究首次将构建的 重组质粒转化()昆虫学报 卷感受态细胞成功诱导表达出 融合蛋白(图:)但上述 融合蛋白主要以包涵体形式存在(图:)推测这与 系统的高效表达有关(吉挺等)本研究中我们将包涵体沉淀经 柱纯化后免疫新西兰白兔 检测结果显示抗体特异性较好(图:)表明成功制备 的多克隆抗体 这为在蛋白水平深入研究西方蜜蜂生理学和病理学过程中 的生物学功能打下了坚实基础 鉴于西方蜜蜂与东方蜜蜂等其他蜂种之间具有较高的亲缘关系未来可尝试利用制备的 抗体进行其他蜂种 的 和免疫荧光等实验本研究成功克隆到 基因的 明确了 蛋白的理化性质和分子特性并揭示了西方蜜蜂 的高度保守性阐明了 在西方蜜蜂工蜂不同器官或组织及不同发育时期的动态表达模式实现了西方蜜蜂 的原核表达并制备了兔抗西方蜜蜂 的 多 克 隆 抗 体 为 进 一 步 探 究 的功能及其参与的表观调控机制打下了基础参考文献().:.():.().():.:().():.(:).()():.曹联飞 牛德芳 和绍禹 匡海鸥 胡福良.基于线粒体和核基因序列的蜜蜂属系统发育分析.遗传():.:.():.(:).():.陈大福 郭睿 熊翠玲 梁勤 郑燕珍 徐细建 黄枳腱 张曌楠 张璐 李汶东 童新宇 席伟军.胁迫意大利蜜蜂幼虫肠道的球囊菌的转录组分析.昆虫学报():.():.杜亚丽 张中印 潘建芳 王树杰 杨爽赵慧婷 姜玉锁.中华蜜蜂气味结合蛋白基因 的克隆及时空表达.中国农业科学():.():.范元婵 王杰孙明会 吴鹰 余岢骏 王心蕊 叶亚萍 钱加珺 张凯遥 王思懿 陈大福 郭睿.东方蜜蜂微孢子虫蓖麻毒素 凝集素基因的分子克隆及生物信息学分析.中国农业大学学报():.():.郭意龙 余岢骏 赵萧 钱加珺 赵浩东 张婕 张扬 赵红霞徐细建 骆群 陈大福 郭睿.意大利蜜蜂工蜂幼虫 基因的生物信息学分析及功能研究.微生物学报():.(:).():.吉挺 沈芳梁勤 吴黎明 刘振国 罗岳雄.中华蜜蜂 基因的克隆、原核表达及组织表达谱.昆虫学报():.:.():.():.().():.李兆英.意大利蜜蜂工蜂脂肪体胚后发育过程中细胞的增殖和凋亡.昆虫学报():.(:).():.李兆英 余红梅 孙艳 孙婧.中华蜜蜂工蜂咽下腺胚后发育过程中细胞的增殖和凋亡.昆虫学报():期吴 鹰等:西方蜜蜂 甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式 ./.():.():.().():.():.马兰花 顾亚荣 张永峰 潘和平 阎萍.牦牛 区克隆及表达谱分析.中国兽医学报():.:.():.:.:.:.():.():.:.():.:().():.().():.():.():.吴鹰 叶亚萍 张佳欣 钱加珺 张文德 余岢骏 吉挺 蔺哲广 赵红霞 陈大福 郭睿.东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中 及其靶基因的表达谱.菌物学报():.():.().():.邢晋祎 李佳莉 朱孟英 苏欣 王国茹.鸡甲基转移酶样蛋白()基因的克隆与表达分析.中国农业大学学报():.():.曾志将.蜜蜂分子生物学.北京:中国农业出版社.().曾志将.养蜂学(第三版).北京:中国农业出版社.():.():.():.张磊 唐永凯 李红霞李建林 徐逾鑫 李迎宾 俞菊华.促进原核表达蛋白可溶性的研究进展.中国生物工程杂志():.():.张莉 张楠 江虎强 吴帆 李红亮.中华蜜蜂 基因家族克隆及表达模式分析.中国农业科学():.():.(责任编辑:马丽萍)