培养基的制备和灭菌.doc

环工综合实验
培养基的制备和灭菌实验

实验报告

环境科学与工程学院实验中心

实验题目
培养基的制备和灭菌实验
实验类别
综合
实 验 室

实 验 时 间

实验环境
温度:
湿度:
同组人数

一、 实验目的
1、了解培养基的配制原理；
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
3、了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；
4、掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、 实验仪器及设备
仪器：高压灭菌锅，1个1000mL烧杯，10套固体培养基，2个250mL锥形瓶，1根5mL、4根1mL移液管，8支小试管等玻璃器皿，报纸，绳子，棉花，三角架，石棉网，煤气灯
试剂：牛肉汤琼脂培养基固体粉末，自来水

三、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料一般为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
对细菌分离纯化，需要做到相关玻璃器皿和培养基无菌，以避免杂菌干扰。干热灭菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

实验原理问答题：
1、 培养基的类型有哪些？琼脂和硅胶均可作为固化剂使用，应用上有何区别？
答：⑴根据培养液物理状态分为固体培养基、半固体培养基、液体培养基；根据用途分为增殖培养基和鉴定培养基；根据微生物种类分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、霉菌培养基；根据培养基成分分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基。
⑵硅胶用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲,以琼脂最为合适。

2、灭菌和消毒的区别是什么？灭菌的方法有哪些？什么是巴氏消毒，有何应用？
答：⑴区别：第一，两者要求达到的处理水平不同。消毒只要求杀灭或/和清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病。灭菌则要求将所有微生物（包括细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等）全部杀灭或/和清除掉，包括非致病微生物以及抵抗力极强的细菌芽孢在内。因此，消毒只要求场所与物品达到无害化水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。第二，两者选用的处理方法不同。灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。灭菌必须选用能杀灭抵抗力最强的微生物（细菌芽孢）的物理方法或化学灭菌剂，而消毒只需选用具有一定杀菌效力的物理方法、化学消毒剂或生物消毒剂。第三，应用的场所与处理的物品也不同。灭菌主要用于处理医院中进入人体无菌组织器官的诊疗用品和需要灭菌的工业产品，消毒用于处理日常生活和工作场所的物品，也用于医院中一般场所与物品的处理。
⑵灭菌方法：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线灭菌、微孔滤膜过滤除菌等。
⑶巴氏消毒：不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保存小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢。常用方法有两种：加热对象到62-65℃，保持30分钟或者加热到75-90℃，保温15-16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。目前常应用于消毒牛奶、啤酒、白酒、血清蛋白等。

3、高压蒸汽灭菌的原理是什么?
答：密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸汽, 由于蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质在高温下凝固变性而达到灭菌的目的。可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。

四、实验步骤
1、将400ml水烧开，迅速放入12.4g牛肉汤琼脂培养基，搅拌至溶解。
2、取200mL溶解沸腾后的培养基液趁热装入1个锥形瓶中，取一只250ml锥形瓶，内装200ml自来水，锥形瓶瓶口加棉塞后用报纸包扎。
3、对5根1ml移液管、一根5ml移液管、8个小试管加棉塞后用报纸包扎，10套培养皿用报纸包扎
4、所有包扎物放入高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌。维持高压锅内压强在0.7～0.8MPa之间约15分钟，拔掉电源结束加压。
5、收拾试验台，归整仪器用具。

五、实验注意事项
1、所有玻璃器皿应该洗净后适当甩干，再包扎。
2、小试管管口、锥形瓶瓶口和移液管后端均用棉花堵塞，不过紧或过松，防止微生物侵入。
3、高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。

六、思考题
1.现有血清培养基需要灭菌，请思考确定除菌方法和过程。
答：0.22um微孔滤膜过滤除菌，在温水中恒温15min，现用现除。一般血清培养基中还可加入抗生素。

2、75%的酒精和95%酒精哪种消毒效果更好？为什么？
答：75%的好。酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌.

3. 如果高压灭菌锅内空气没有排尽，对灭菌效果有何影响？
答：如果空气不排净则锅内有残留，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度，温度不够杀菌效果就不理想。

4.对异养型微生物（光能、化能）和自养型微生物（光能、化能）进行增殖培养，其培养基的组成有何不同？试举例说明。
答：自养型微生物利用的碳源是二氧化碳，碳酸盐等，异养微生物的碳源是含碳有机物，所以培养两种微生物的培养基的主要差别是碳源。如培养蓝藻（光能自养型）需提供CO2和光照，培养硝化细菌（化能自养型）需提供CO2和化学能，培养细菌（化能异养型）需提供糖类等含碳有机物。