进行性肌营养不良患者视网膜眼电图表型与临床分型及基因型的关系1879060977.pdf

论著进行性肌营养不良患者视网膜眼电图表型与临床分型及基因型的关系杨渝张成盛文利潘速跃吴德正江福钿【摘要】目的研究进行性肌营养不良(Duchenne?Becker muscular dystrophy,DMD?BMD)患者视网膜眼电图(electroretinogram,ERG)表型与临床分型以及基因型的关系,进一步探讨不同基因型的DMD患者抗肌营养不良蛋白(dystrophin)及其同源蛋白在视网膜上的表达及功能,揭示DMD出现ERG异常的分子机理。方法用11对引物对22例临床确诊的DMD?BMD患者作三步多重PCR进行基因缺失分析,并行ERG检查。结果DMD?BMD患者ERG改变与临床分型及病情严重程度无关,与DMD?BMD的基因型有关,基因中央区缺失型的ERG异常率明显高于基因非缺失型。结论DMD?BMD的ERG改变与DMD基因突变位点有关,可能DP260转录启动子与视网膜电信号的传导关系最密切。【关键词】视网膜眼电图;进行性肌营养不良;抗肌营养不良蛋白Correlation between electroretinographic f indings,clin ical phenotypic and genotypic analysis in Duchenneand Becker muscular dystrophy3YA N G Yu1,ZH A N G Cheng1,SH EN G W enli1,PA NS uyue1,W UD ezheng2,J IA N G Futian2.1(D epartm ent of N eurology,the F irst A ff iliated H osp ital,S un Yat2S enU niversity of M ed ical S ciences,Guangzhou,Guangdong,510080P.R.China.E2m ail:YuY);2(Zhongshan Ophthalm ic Center,S un Yat2S en U niversity of M ed ical S ciences,Guangzhou,Guangdong,510060P.R.China)【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between electrophysiological changes,clinicalphenotype and genotype in Duchenne and Becker muscular dystrophy(DMD?BMD),to address theexpression and roles of dystrophin and its isoform s on the retina,and to inquire into the molecularmechanism of the abnormal electroretinogram(ERG)on DMD?BMD patients w ith different genotype.M ethodsGene deletions were screened by multiplex DNA amplification w ith eleven pri mers on twenty2two consecutive patients w ith DMD and BMD,and then,the ERG was tested according to internationalERG standard.ResultsERG phenotypewas associated w ith the site of DMD gene defects rather than theseverity of the phenotype.Patientsw ith deletion in the central region of the gene hadmore severe changesin the scotopic ERG as compared to those w ith gene non2deletion.ConclusionThe ERG genotype2phenotypecorrelationsuggeststhat DP260 mayplaythe mosti mportantroleintheretinalneurotransm ission.【Key words】electroretinogram;Duchenne?Becker muscular dystrophy;dystrophin3Supported by theNationalNatural Science Foundation of China(Proj.No.39870804),GuangdongNatural ScienceFoundation(Proj.No.970061),and Research Funds of ClinicalDepartment ofM inistry of Health(Proj.No.97040229)进行性肌营养不良(Duchenne?Becker musculardystrophy,DMD?BMD)是一种X连锁隐性遗传的致死性肌病。近年来国外部分作者相继报道了DMD?BMD患 者 有 特 征 性 负 向 视 网 膜 眼 电 图(electroretinogram s,ERGs)的改变,即暗适应b波波幅降低或消失,潜伏期延长;b?a波波幅比小于1;另有基金项目:国家自然科学基金(39870804)、广东省自然科学基金(970061)、卫生部临床学科重点项目基金(97040229)作者单位:510080广州,中山医科大学附属第一医院神经科(杨渝、张成、盛文利、潘速跃),附属眼科中心(吴德正、江福钿)通信作者:杨渝(现在510630广州,中山医科大学附属第三医院神经科,E2mail:YuY)暗适应振荡电位异常。因此,目前认为ERG对DMD?BMD具有诊断意义123。DMD出现ERG异常的分子基础与表达于视网膜上的DMD基因蛋白产物抗肌营养不良蛋白的功能缺陷有关4,但并非全部DMD患者都有ERG的异常,可能与抗肌营养不良蛋白在视网膜上的表达程度不同有关。我们通过探讨DMD?BMD患者ERG表型与临床分型及基因型的关系,进一步研究抗肌营养不良蛋白及其同源蛋白的功能及DMD产生的分子机理。1对象与方法111对象门诊收集22例无血缘关系的DMD?23中华医学遗传学杂志2001年2月第18卷第1期Chin J M ed Genet,February 2001,Vol.18,No.1 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.BMD患者,经临床检查、血清酶学、肌电图或(和)肌活检检查确诊。其中DMD 16例,年龄1岁6个月 13岁;BMD 5例,年龄1115岁;1例尚不能分型。除1例患者因年龄太小不能检查外,其余患儿均行视力、视野、色觉、眼球运动、裂隙灯及眼底等眼科检查,发现视力在112115之间,余眼科检查无明显异常。正常对照组为15名健康男性,年龄515岁,眼科检查无任何异常。112方法11211DNA抽提及多重PCR的DMD基因缺失分析取22例患者新鲜外周血300l,抽提DNA,溶于40l 1TE溶液中,4保存。按Chamberlain和Beggs等5的设计合成11对引物,并分成5对、4对、3对3组:5对为第12、17、45、48、51外显子扩增产物;4对为第4、8、19、44外显子扩增产物;3对为第50、51、52外显子扩增产物。按以下条件扩增作多重PCR:总反应体积为30l,含3l 10缓冲液,3l Taq酶216U,2 mmol?L dN TP,引物10 pmol?L,DNA 100300ng。预变性952m in,热循环:94变性30 s,56复性30 s,72延伸2 m in,共30个循环,最后72延伸7 m in。取扩增产物6l在2%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察结果,判断DMD基因缺失类型。11212ERG检测(1)仪器、设备:2503型全视野(Ganzfeld)ERG刺激器(美国L KC公司),Grass PS22型闪光控制器提供闪光。N europack型诱发反应记录仪(日本光电公司),通频带221000 Hz,扫描时间100m s。色光刺激用Kodak 47B号滤光片(波长 470nm)的蓝色刺激光。单次闪光ERG,暗适应?1蓝光(016440 cd.s.m-2)引起视杆反应,?16白光(410632cd.s.m-2)引起混合反应,明适应?8白光(017207cd.s.m-2)引起视锥反应。(2)检查方法:被检者用5%新福林和1%托品酰胺散瞳,暗适应40 m in。用5%的卡因表面麻醉,用角膜接触镜电极作为记录电极,前额正中放置参考电极,耳垂接地。在绝对暗室中依次给予?1蓝光、?16白光及振荡白光刺激。然后在10 cd?m2背景下明适应10 m in,再予以?8白光刺激。每次闪光间隔60 s。最后予以30 Hz闪烁光刺激。(3)测量方法:按ERG国际标准,a波波幅为从基线至a波波谷,潜伏期为从闪光刺激开始至波谷的时间。b波振幅是从a波波谷至b波波峰,潜伏期为从闪光刺激开始至波峰的时间6。2结果211DMD?BMD基因型的确定将11对引物进行三步多重PCR,发现22例DMD?BMD患者基因中央缺失型有12例,缺失范围从第4452外显子;基因5端缺失1例,为第8外显子缺失;其余9例为基因非缺失型。212ERG与临床分型结果比较(表1)DMD 16例,其中14例出现ERG异常(8715%)。BMD 5例,其中2例出现ERG异常(40%)。其异常表现为暗适应b波波幅下降,b?a比值 0105)。213ERG与DMD?BMD病情严重程度的关系经统计学分析,DMD的ERG b波波幅与患者丧失步行能力的年龄及肌力损害程度无相关关系(P 0105)。214ERG表现型与DMD?BMD基因型的关系12例基因中央缺失型患者(第4452外显子缺失),其中11例ERG明显异常(9117%)。1例第8外显子缺失的患者出现ERG的异常。非缺失型9例,4例有ERG异常(4414%)。经统计学分析,中央缺失型ERG异常率与非缺失型比较差异有显著性(P 0110 0120 010533中华医学遗传学杂志2001年2月第18卷第1期Chin J M ed Genet,February 2001,Vol.18,No.1 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.录了5种反应,发现ERG的异常与临床分型、肌力损害程度、丧失步行能力的年龄无关,而与DMD基因型有密切的关系。在22例无血缘关系的患者中,基因非缺失型9例,4例(4414%)ERG异常;基因中央缺失型12例,11例(9117%)ERG异常,中央缺失型的ERG异常率明显高于非缺失型,两组差异有显著性,这与目前国外的报道相似。同时,我们发现1例基因5端缺失型患儿也出现了与中央缺失型相似的ERG改变,但因样本数太少未能进行统计学分析,故对基因5 端缺失型患者的ERG表现尚待进一步研究。最近Pillers等9在对DMD ERG表型与基因型的关系的研究中发现,94%的外显子30下游基因缺失的患者有ERG异常,而在外显子30上游基因缺失的患者中仅46%出现ERG异常。其研究结果表明大多数ERG正常的DMD患者系基因5 端缺失型。用针对缺失热区的11对引物的多重PCR可以检出绝大部分的基因缺失型DMD患者10,仅有极小部分缺失型患者不能被发现。所以我们考虑9例基因非缺失型患者中4例ERG出现异常的原因有:(1)在11对引物覆盖范围外的其它位点上的缺失,如位于启动子区域或某些未能检出的微小突变;(2)点突变引起编码抗肌营养不良蛋白的序列发生改变。大多作者认为在肌肉组织肌病严重程度与基因缺失大小、位置无关,而与抗肌营养不良蛋白是否有表达及表达的量有关。我们的研究结果表明,DMD的ERG表现与病情严重程度无关,而由其基因型决定。推测其原因与抗肌营养不良蛋白及其同源蛋白在视网膜上的表达程度不同有关,说明在视网膜上全长抗肌营养不良蛋白的作用不大,而一些小片段的抗肌营养不良蛋白在视网膜电信号传导上起着重要作用。DMD基因中央区尤其外显子4452对维持抗肌营养不良蛋白的正常视觉电信号传导功能是必需的,也说明抗肌营养不良蛋白的羧基末端功能尤其重要。视网膜上DP260的转录启动子位于第30外显子上游11。DP71的转录启动子位于第62和63外显子之间12。DP116的转录启动子位于第56外显子上游。三者在视网膜上的定位及功能并不完全相同,DP260高度特异表达于视网膜上,而DP71主要位于脑内,DP116主要位于外周神经。L ederfein等13用免疫组化的方法也发现DP260位于视网膜外丛状层(OPL)。最近Rodius等14证实DP260与神经组织突触的成熟有关,并认为DP260与视网膜电信号传导关系最密切。结合近来国外的研究结果,大多数的DMD ERG异常患者系基因中央缺失型,缺失位点多位于第4452外显子之间,正好位于DP260转录启动子下游和DP71转录启动子上游,故应有DP260表达降低而无DP71的表达异常,支持DP260与视网膜电信号传导关系最密切这一观点。故推测中央区缺失型患者DP260的缺乏是ERG异常的主要原因。参考文献1Fitzgerald KM,Cibis GW,Giambrone SA,et al.Retinal signaltransm ission on Duchenne musculardystrophy:evidencefordysfunctioninthephotoreceptor?depolarizingbipolarcellpathway.J Clin Invest,1994,93242522430.2Sigesmund DA,W eleber RG,Pillers DM,et al.Characterizationofthe ocular phenotype of Duchenne and Becker musculardystrophy.Ophthalmology,1994,1018562865.3Tremblay F,Becker I D,Riddell DC,et al.Duchenne musculardystrophy:negative scotopic bright2flash electroretinogram andnormal dark adaptation.Can J Ophthamol,1994,292802283.4Cibis GW,Fitzgerald KM,Harris DJ,et al.The effects ofdystrophin gene mutations on the ERG in m ice and humans.Invest OphthalV is Sic,1993,34364623652.5Beggs AH,Koenig M,Boyce FM,et al.PCR pri mers for thedystrophin gene that complement existing ones to detect over 98%of DMD?BMD deletions.Hum Genet,1990,8645248.6International standardization comm ittee.Standard for clinicalelectroretinography.A rch Ophthalmol,1989,1078162817.7Nudel U,Zuk D,Einat P,et al.Duchenne muscular dystrophygene product is not identical in muscle and 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