淡水养殖罗非鱼中病原菌和腐败菌的 分离与鉴定初探.pdf

327生物工程食品科学2008,Vol.29,No.05淡水养殖罗非鱼中病原菌和腐败菌的分离与鉴定初探刘寿春1，周 康1，钟赛意1，李平兰1，马长伟1,*，彭朝辉2(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京北水食品工业有限公司，北京 101108)摘 要：本实验分析了刚捕获淡水养殖罗非鱼的体表黏液、腮、肠道、腐败肉和养殖池水的细菌菌相，结果表明，以上样品的菌落总数分别为 1.0 103CFU/cm2、2.2 103CFU/g、1.4 105CFU/g、5.4 107CFU/g 和 2.6 104CFU/ml；共分离出 353 株菌，以革兰氏阴性菌为主。池水和新鲜鱼体的优势菌为芽孢杆菌、肠杆菌科、弧菌科，其主导地位随样品不同而有所差异，还有少量假单胞菌属、肠球菌属、葡萄球菌属等。腐败肉中的菌相较单一，优势菌为洋葱假单胞菌、嗜水气单胞菌和短芽孢杆菌，迟钝爱德华菌和克吕沃尔菌属少量。同时参照 GB和 SN 标准对刚捕获罗非鱼的体表黏液、腮、肠道中病原菌进行分析，结果表明，在鱼体中检出大肠埃希氏菌、粪链球菌和铜绿假单胞菌，未检出单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和溶血性链球菌等病原菌。关键词：罗非鱼；菌相；病原菌；腐败菌Isolation and Identification of Pathogens and Spoilage Bacteria on Cultured Hybrid TilapiaLIU Shou-chun1，ZHOU Kang1，ZHONG Sai-yi1，LI Ping-lan1，MA Chang-wei1,*，PENG Zhao-hui2(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；2.Beijing Beishui Food Industry Co.Ltd.,Beijing 101108,China)AbstractAbstract：The bacterial flora occurring in pond water,surface mucus,gills,intestine and putrid meat of healthy tilapia culturedin freshwater,were estimated both quantitatively and qualitatively.The results showed that total viable count of bacteria in abovesamples respectively were 2.6104 CFU/ml,1.0103 CFU/cm2,2.2103 CFU/g,1.4105 CFU/g and 5.4107 CFU/g.Total 353 isolates were dominated by Gram-negative bacteria.Bacillus sp.,Enterobacteriaceae sp.and Vibrionaceae sp.werepredominant in pond water and fresh fish,with a small number of Pseudomonas sp,Enterococcus sp.,Staphylococcus sp.andso on;but the dominant position were changed with different samples.The bacterial flora were simple in putrid meat,Pseudomonascepacie,Aeromonas hydrophila and Bacillus brevis were dominant spoilage organism,with a small number of Edwardsiella tardaand Kluyvera spp.In addition,GB and SN standard methods were used in detecting the pathogens on surface mucus,gills andintestine of newly-harvested tilapia,Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus faecalis were detected,butListeria monocytogenes,Salmonella sp.,Staphylococcus aureus,Vibrio parahaemolyticus and hemolytic streptococcus were notdetected.Key wordsKey words：tilapia；bacterial flora；pathogens；spoilage bacteria中图分类号：S965.125 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)05-0327-05收稿日期：2007-11-30基金项目：欧盟第六框架科技计划项目(FP6-016333-2)作者简介：刘寿春(1980-)，女，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：*通讯作者：马长伟(1965-)，男，教授，博士，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：罗非鱼是我国重要的养殖鱼类之一，具有重要的经济价值，在出口创汇方面发挥了重要作用，其食用安全性也越来越受到关注1。对罗非鱼的养殖环境、产品本身的主要腐败菌和病原菌进行检测和有效控制是实现罗非鱼产品质量安全，保障该养殖产业健康发展的关键2。谢骏等3探讨了罗非鱼养殖环境和自身体表黏液细 2008,Vol.29,No.05食品科学生物工程328菌菌相的相互关系；也有研究报道从罗非鱼体中分离出了致病性的链球菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等4；而许钟等5-6建立了罗非鱼在015恒温和波动温度储藏下特定腐败菌的生长曲线和货架期预测模型。罗非鱼在捕获后处理、加工、储运和销售过程中极易受到微生物的污染，导致肉质腐败，影响食用安全性。这方面的研究极少见于报道。本实验初步探讨罗非鱼的养殖池水、刚捕获的新鲜鱼体、货价期终点腐败肉样的菌落总数和菌群组成，同时参照 GB 和 SN 标准对刚捕获新鲜罗非鱼鱼体的病原菌进行检测与计数；从而了解罗非鱼的养殖环境和原料自身的细菌学特征，为后续加工有效控制微生物腐败和潜在危害提供依据。1材料与方法1.1样品采集鲜活奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticusO.aureus)取自广东省某淡水罗非鱼养殖场，选择健康活鱼 15 尾，每尾重 400500g，立即放入冰水中冷休克，层冰层鱼层冰放置于隔热泡沫箱中，保持鱼体温度在 04，并于 3 h 内运往实验室分析检验。1.2微生物取样1.2.1新鲜鱼体取样1.2.1.1体表黏液采用棉试法，共取鱼体两侧 25cm2黏液于 225ml 无菌生理盐水中。1.2.1.2肠道用含 75%酒精棉球拭擦鱼体表，无菌取出 13 尾鱼的肠道，置于无菌广口瓶中，混匀，取 5g 于 45ml 无菌生理盐水中。1.2.1.3腮取样方法同肠道。1.2.2货价期终点的腐败肉样冷休克致死后的鱼随机抽取 2 尾，去鳞、内脏和鳃，洗净沥干，置洁净托盘中，用保鲜膜密封，于3 7 培养箱中有氧储藏至感官判定腐败。沿脊骨剖切，取一侧带皮鱼肉，放入组织捣碎机搅碎，取25g 于225ml无菌生理盐水中。1.2.3养殖池的水样分别取罗非鱼养殖池四边形的四个点，采用无菌水样瓶取距离水面以下 1520cm 的水样，灌注并密封，于 04下保存至实验室分析。分析前，4 瓶水混匀，取 25ml 于 225ml 无菌生理盐水中。以上所有样品，充分混匀后按需要做稀释倍数，取 3 个合适浓度倾注平板，每个浓度 2 个平板。按以下不同的测定方法进行培养和分析。1.3微生物分析方法分别以鱼的体表黏液、肠道、腮、腐败肉和池水为样品，采用含 0.5%NaCl 的平板计数琼脂(PCA)30有氧培养 48h。选取菌落总数在 30100 的平板，分离整个平板一半的菌株或整个平板的所有菌株。肉眼观察菌落特征完全相同的菌落，并计数,数量最多的 34 种菌株作为优势菌，采用营养琼脂划线纯化，革兰氏染色，观察细胞形态，最后参照文献7结合 API 系统(法国生物梅里埃公司)进行细菌鉴定和分类。为进一步确认罗非鱼的微生物安全性，本实验还采用 GB 和 SN 标准针对新鲜鱼体检测以下可能存在的病原菌，并对检出的病原菌进行计数。具体方法见表 1。1.4理化指标测定在取样前后 27d 内，每天早中晚分别测定水温、溶氧、pH、盐度、亚硝酸氮(NO2-N)和氨氮(NH4-N)。2结果与分析2.1罗非鱼养殖池水的理化指标分析罗非鱼养殖池水的理化指标如表 2，采样前后的 27d内，池水温度较高，p H 中性，溶氧、亚硝酸氮和氨氮浓度适宜。本实验池为纯淡水，盐度几乎为零。2.2淡水养殖罗非鱼的池水、黏液、腮、肠及其腐病原菌参考标准培养基大肠埃希氏菌及计数GB/T 4789.62003乳糖胆盐发酵培养基、E M B 培养基、生化试验配套试剂单核增生李斯特氏菌SN 0184 93FRASER 增菌液、OXA 平板、TSA-TE、TSB-YE、生化试验配套试剂沙门氏菌GB/T 4789.42003B P 缓冲液、S C 增菌液、S S 琼脂、生化试验配套试剂金黄色葡萄球菌GB/T 4789.1020037.5%NaCl 肉汤、Baird-parker 琼脂、血平板、生化试验配套试剂副溶血弧菌GB/T 4789.72003氯化钠结晶紫增菌液、NaCl 蔗糖培养基、嗜盐琼脂培养基、生化试验配套试剂溶血性链球菌GB/T 4789.112003葡萄糖肉浸液、血平板、生化试验配套试剂粪链球菌及计数SN/T 0475 95叠氮化钠培养基、PSE 琼脂、生化试验配套试剂铜绿假单胞菌GB 7918.487SCDLP、十六烷三甲基溴化铵培养基、生化试验配套试剂假单胞菌属计数假单胞菌选择性培养基，25培养 48h表1 淡水养殖的罗非鱼体中不同病原菌的分析方法Table 1 Standard methods on different pathogens of freshwater cultured tilapia注：以上选择性培养基均购于广东环凯生物技术有限公司。329生物工程食品科学2008,Vol.29,No.05败肉的细菌菌相分析从罗非鱼的体表黏液、腮、肠道、腐败肉和池水中共分离出 353 株菌，革兰氏阴性菌(G菌)占 56.4%，革兰氏阳性菌(G+菌)占32.6%，未鉴定菌株占11%，隶属于7 个科13 个属21 个种。G菌中主要是肠杆菌科(22.1%)、弧菌科(17.0%)和假单胞菌属(10.2%)，还有部分根瘤菌和泛菌属。G+菌主要是芽孢杆菌(24.4%)、肠球菌和葡萄球菌(共 8.2%)。以上各样品，除了黏液的 G+菌(45.7%)稍多于 G菌(41.4%)以外，其余样品中 G菌均多于 G+菌，在肠道和腐败肉中尤为明显；表明淡水养殖罗非鱼的新鲜鱼体和池水以 G菌为主，肠杆菌、芽孢杆菌、弧菌科是优势菌(10%)，假单胞菌、葡萄球菌和肠球菌比例很低，但不同样品中各优势菌的主导地位有变化。其中黏液的菌相与其他样品明显不同，其 G+菌多 池水 黏液 腮 肠道 腐败肉菌名分离出分离出菌占总分离出分离出菌占总分离出分离出菌占总分离出分离出菌占总分离出分离出菌占总菌株数菌株比例(%)菌株数 菌株比例(%)菌株数 菌株比例(%)菌株数 菌株比例(%)菌株数 菌株比例(%)凝结芽孢杆菌 Bacillus firmus34.31217.1巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium710.01516.1环状芽孢杆菌 Bacillus circulans1015.9蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus34.3短芽孢杆菌Bacillus brevis1014.357.1812.755.4814.0粪肠球菌 Enterococcus faecalis57.134.855.4耐久肠球菌 Enterococcus durans45.7表皮葡萄球菌Staphylococcus eqidermidis811.446.3类志贺邻单胞菌Plesiomonas shigelloides34.3嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila1014.3710.069.52223.71221.1洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacie45.734.346.32238.6铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa33.2大肠埃希氏菌 Escherichia coli34.357.123.222.2阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacea57.145.746.31516.1产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes68.644.3迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda47.0液化沙雷氏菌 Serratia liquefaciens22.934.357.966.5弗氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii34.3克吕沃尔菌属Kluyvera spp.58.8放射根瘤菌Rhizobium radiobacter1015.9泛菌属 Pantoea spp.710.088.6未鉴定912.9912.9711.188.6610.5菌株总数7070639357革兰氏阳性菌2535.73245.72539.72526.9814.0革兰氏阴性菌3651.42941.43149.26064.54375.4表 3 养殖罗非鱼的池水、体表黏液、腮、肠和腐败肉的微生物菌相组成Table 3 Microbial flora of isolates in pond water,surface mucus,gills,intestine and putrid sample of tilapia注：“”表 示 未 检 出。于 G菌，且葡萄球菌和泛菌属也是优势菌；而池水、腮和肠道的菌相比较相近。在腐败肉中，菌相比较单一，洋葱假单胞菌(38.6%)、嗜水气单胞菌(21.1%)和短芽孢杆菌(14.0%)是优势菌，还有少量克吕沃尔菌属和迟钝爱德华菌。由表 3 可知，肠杆菌科广泛存在于新鲜鱼体和池水中，但科内的种属较多，各种间比例不高。在腐败肉菌相中隶属于肠杆菌科的只有迟钝爱德华菌(7%)和克吕沃尔菌属(8.8%)。嗜水气单胞菌始终以较高的比例(9.5%23.7%)存在于各样品中，尤其在肠道和腐败肉中比例大于 20%。气单胞菌属对鱼类和人均致病，0仍能生长，是淡水鱼的典型菌株8。假单胞菌在刚捕获罗非鱼体和池水中比例较低(10%)，但在腐败肉中占绝对优势(38.6%)。测定天数(n=27)水温()pH溶氧(mg/L)NO2-N(mg/L)NH4+-N(mg/L)盐度()实测值28356.77.23.474.2800.100.1 02007/5/1406/0832.172.066.970.114.150.580.050.040.250.29纯淡水适宜范围25347.08.5370.3表2 罗非鱼养殖池水的理化指标(XSD)Table 2 Physicochemical parameters in pond culture water(X SD)-2008,Vol.29,No.05食品科学生物工程3302.3刚捕获的罗非鱼中肠道、腮、黏液中的病原菌的检出情况病原菌检测结果大肠埃希氏菌肠道、黏液、腮中检出粪链球菌同上铜绿假单胞菌肠道中检出；腮和黏液中未检出单核增生李斯特氏菌肠道、腮、黏液均未检出沙门氏菌同上金黄色葡萄球菌同上副溶血弧菌同上溶血性链球菌同上表 4 刚捕获罗非鱼肠道、腮、黏液中病原菌的检出情况Table 4 Detection results on different pathogens of newly-harvested tilapia如表 4 所示，鱼体中未检出单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、副溶血弧菌等致病菌；检出大肠埃希氏菌、粪链球菌(也叫粪肠球菌)和铜绿假单胞菌(假单胞菌属)，与表 3 菌相分析结果一致。同时测定刚捕获新鲜鱼体的黏液、腮和肠道中大肠埃希氏菌、粪链球菌和假单胞菌属的数量，但大肠埃希氏菌和粪链球菌的含量均很低(见表 5)，可能池水受粪便污染较小；也可能与鱼品种存在一定关系，罗非鱼较其他鱼种抗病性强，因其体表和体内存在非特异性抗菌因子，对致病菌有一定的抵抗性9，这可能是罗非鱼鱼体附着的致病菌较少、微生物数量较低的原因之一。许多研究从罗非鱼体中分离出致病性链球菌10，这与本实验结果一致。副溶血弧菌嗜盐是海水典型菌株11，也是海产品的主要致病菌，本实验中未检出弧菌，可能因为鱼池为纯淡水，盐度低，不适合弧菌生长。2.4刚捕获罗非鱼的池水、体表黏液、腮、肠道和腐败肉的微生物数量结果表明，与罗非鱼相关的各样品中微生物数量不同(见表 5)，其中有氧菌落总数(APC)：腐败肉(107CFU/g)肠道(105CFU/g)池水(104CFU/ml)腮(103CFU/g)黏液(103CFU/cm2)；在各样品中假单胞菌和 APC 的初始菌数极为相似；在刚捕获的鱼体和池水中假单胞菌含量较少，当罗非鱼至货价期终点时，肉中的假单胞菌和APC 均达到 107CFU/g；与表 3 实验结果吻合，此时腐测定指标池水(CFU/ml)黏液(CFU/cm2)腮(CFU/g)肠道(CFU/g)腐败肉(CFU/g)有氧菌落总数2.61041.01032.21031.41055.4107假单胞菌属3.81024.01021.21031.11054.8107大肠埃希氏菌N D 3 39.1N D粪链球菌N D0.32.32.3N D表 5 刚捕获罗非鱼的池水、黏液、腮、肠道及其腐败肉的微生物数量Table 5 Bacterial load in pond water,surface mucus,gills,intestine and putrid sample of tilapia注：N D 表示未测定。败肉的菌相比较单一，假单胞菌占绝对优势(38.6%)，表明假单胞菌是引起有氧储藏罗非鱼肉的主要腐败菌；许钟等5-6研究表明假单胞菌是低温有氧储藏罗非鱼的特定腐败菌，其数量的多少直接影响罗非鱼的货价期，本实验结果与之一致。有学者认为在温带、亚热带或热带水域中，假单胞菌和希瓦氏菌是特定腐败菌，这对于所有鱼贝类和甲壳类都是适用的12。3讨 论3.1刚捕获罗非鱼的鱼体和池水的细菌菌相刚捕获的鱼类其身上的初始细菌组成与生活环境、季节、捕获方法等有关13。Al-Harbi 等14-16研究了海水养殖罗非鱼的池水、沉积物、肠道和腮的菌相；谢骏等3探讨了淡水罗非鱼体表黏液与养殖环境细菌菌相的相互关系。海水养殖的罗非鱼鱼体中主要优势菌为弧菌属、链球菌属、腐败希瓦氏菌等，本实验中未检出弧菌属和希瓦氏菌属，可能与池水的盐度和培养基的盐分太低有关。而在淡水养殖的罗非鱼体表黏液中，优势菌为芽孢杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、弧菌科和不动杆菌属，主要以葡萄球菌属和芽孢杆菌属占主导地位 3，这与本实验部分结果一致，即芽孢杆菌、葡萄球菌、肠杆菌和弧菌科是优势菌。罗非鱼鱼体和池水的细菌组成主要是 G菌。肠杆菌、芽孢杆菌、弧菌科为优势菌，但不同样品中各优势菌的主导地位有变化，可能与鱼体不同部位的营养组分和细菌具有选择性吸附能力有关3。温水域中的微生物主要是嗜冷的 G杆菌，包括假单胞菌、摩拉氏菌、不动杆菌、希瓦氏菌、黄杆菌属，在不同的地域发现G菌如芽孢杆菌、微球菌、梭菌属、乳杆菌、棒状杆菌，但主要还是G菌群17。Shewan 等18认为 G菌如芽孢杆菌和微球菌是热带水域的优势菌，也有许多学者认为热带水域的微生物菌群与温带水域的菌群相似8,19。其中 Liston 等20研究结果表明在热带鱼中会有稍高含量的 G菌和肠杆菌，但是菌群和温带水域相似。这与本实验结果一致，即在池水和鱼体中检出含量较高(21.5%28.6%)的 G菌(芽孢杆菌、葡萄球菌和肠球菌)和肠杆菌(17.1%29.0%)，但主要还是 G菌(56.4%)。张庆等21的研究结果表明，选用芽孢杆菌为主导菌的复合331生物工程食品科学2008,Vol.29,No.05微生物加入罗非鱼养殖池中，能有效改善水质，同时能起到促生长、降低饵料系数的作用，这反过来说明池塘中芽孢杆菌属等分解有机物能力很强的 G菌占据主导地位有可能是高产鱼池自身的选择。3.2刚捕获罗非鱼的鱼体和池水的微生物数量鱼体和水体的微生物数量与水温关系密切，夏秋季节水温高，中温菌数量多，冬春季节水温低，则菌数少16。谢骏等3研究结果表明，池水中好氧异养细菌波动区域为(0.269.20)105CFU/ml，罗非鱼体表黏液细菌的种类和数量来自于水环境，好氧菌为(0.021.00)104CFU/cm2，与大型浮游生物显著相关(p 0.01)，可能与鱼的食性及活动习性有关。本实验结果池水(2.6 104CFU/ml)和黏液(1.0103CFU/cm2)的菌落总数与谢骏研究结果一致。Al-Harbi 等16报道淡水养殖罗非鱼的肠道微生物数量为 6.8 1067.5 107CFU/g，本实验肠道菌含量(1.4 105CFU/g)稍偏低。鱼肠道中微生物数量高，可能与高温(28)水体中促进鱼的摄入量和代谢活动有关。本实验罗非鱼以自然水体为食，生长速度和摄入量受到控制，可能导致肠道微生物数量较低。微生物菌群组成和数量的变化与采样方法、微生物检测技术和环境的差异性有关。所用培养基不同对微生物计数有影响，如采用胰大豆蛋白胨琼脂(TSA)更适合培养嗜温菌 1 4。根据不同水域的含盐量和水温，调整培养基的组分、培养温度和时间，从而更有效的分离培养不同水域、不同微生物种类的菌落数，尤其是海洋水域中的嗜盐菌和低温菌。因此，由于采样地点、时间以及研究手段等差异，所得微生物的种类和数量也存在差异。参考文献：1张海明.罗非鱼的养殖及其发展前景J.饲料广角,2004(11):40-43.2刘俊荣,OAFSDOTTIR G 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