淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达.pdf

第10卷 第4期中 华 男 科 学Vol.10No.42004年4月National Journal of AndrologyApr.2004 论著淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达潘 静,毛旭虎,张卫军,鲁东水,罗 萍,王 宁(第三军医大学医学检验系,重庆400038)摘要:目的:在大肠埃希菌(E.coli)中表达淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜免疫佐剂的融合蛋白。方法:PCR扩增淋病奈瑟菌保守抗原表位porin loop (PL678)基因,并与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合,转化E.coli,ELISA、SDS2PAGE及Western印迹分析其表达。结果:融合蛋白获得表达,具有结合G M1神经节苷酯的能力和与抗淋病奈瑟菌多克隆抗体的反应性。结论:融合蛋白的表达为研究淋病奈瑟菌分子内佐剂疫苗奠定了基础。关键词:淋病奈瑟菌;不耐热肠毒素B亚单位;融合表达中图分类号:R339.2+1 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)0420269204Fusion Expression ofNeisseria gonorrhoeaeOutmembrane Protein with a Mucosal AdjuvantPan Jing,Mao Xuhu,Zhang Weijun,Lu Dongshui,Luo Ping,Wang NingCollege of Medical Laboratory,Third Military Medical University,Chongqing400038,China(Pan J,Mao XH,Zhang WJ,Lu DS,Luo P,Wang N)Correspondence to:Mao Xuhu,E2mail:Abstract:Objective:T o express a fusion protein ofNeisseria gonorrhoeaewith a mucosal adjuvant.Methods:The gene coding Loop 2(PL678)of porin,an out2membrane protein ofNeisseria gonorrhoeae,wasobtained by PCR.It was inserted into a plasmidfused with subunitB of heat labile enterotoxin.The recombinant was transformated inE.coli.The expression of fusion protein was analysed by ELISA,SDS2PAGE and Western2blot.Result:Fusion protein withLTB was successfully expressed,and displayed both the abilityof binding G M1and thereactogenicity with polyclonal antibodies againstNeisseria gonorrhoeae.Conclusion:The expression of fusion protein laid a foundation forthe study of the intramolecular vaccine againstNeisseria gonorrhoeae.Natl J Androl,2004,10(4):2692271,274Key words:Neisseria gonorrhoeae;subunit B of heat labile enterotoxin;fusion expression 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,Ng)是淋病的致病菌,疫苗对于预防控制淋病的流行传播具有十分重要的意义1。本研究拟应用分子设计的理论和基因重组技术通过分析Ng具有保护作用的抗原表位porin loop (PL678)的分子结构,克隆其基因,并与强力、无毒的粘膜免疫佐剂不耐热肠毒素B亚单位(subunit B of heat labile enterotoxin,LTB)按适当空间结构在大肠埃希菌(E.coli)中融合表达呈免疫优势/显性,为研制和开发淋病分子内佐剂基因工程疫苗奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 E.coliDH5、JM109菌株为本室保存菌种,LTB羧基末端融合表达载体pLV2.0由本室构建。各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA962收稿日期:2003202219;修回日期:2003212210基金项目:重庆市应用基础研究课题(200026321)作者简介:潘 静(19682),重庆市人,实验师,硕士研究生,从事临床检验专业。通信作者:毛旭虎,E2mail:clinimmu 连接酶均购自华美生物工程公司;IPTG、G M1神经节苷脂为Sigma产品,其他化学试剂均为分析纯。兔抗LT多抗血清购自上海市卫生防疫站,抗Ng阳性血清采自临床Ng感染患者。1.2 方法1.2.1 基因组DNA、质粒提取、DNA片段回收纯化采用Sangon公司UNIQ10小量质粒抽提试剂盒和Silver Beads胶回收试剂盒。1.2.2DNA酶切反应、连接、转化 按文献2进行。1.2.3SDS2PAGE和Western印迹 采用Bio2Rad电泳系统,5%样品胶,12%分离胶,TAE电泳缓冲液。电泳完后,一部分考马斯亮蓝染色,UVP扫描;另一部分电转移(40 mA,2 h)至硝酸纤维膜上,TBST封闭,4 过夜;加入一抗(Ng感染患者阳性血清),37 温育1 h,TBST洗涤3次,每次10 min;再加入酶标二抗,3730 min,TBST洗3遍,最后加入DAB显色。1.2.4PCR 用临床分离培养的淋病奈瑟菌基因组DNA作为模板,按常规PCR条件进行扩增。上游引物5 2AG AGGCAG ATATTTTCAG ACTATCAG23,下游引物5 2CAG AT ATCGGTG CGT AGTTTTCAT ACTG23。反应条件:94 预变性5 min,加入TaqDNA聚合酶,然后按如下参数循环:941 min,551 min,721 min,最后1个循环结束后72 反应10 min。1.2.5DNA序列分析 采用双脱氧法,由北京赛百盛生物公司完成。1.2.6G M12ELISA 以G M1神经节苷脂包被聚乙烯塑料板,4 过夜,加入细菌沉淀超声上清,3730min;TBST洗3次,10 min/次;加入抗LT多抗血清,3730 min;洗3次,加OPD显色。2 结果2.1PCR扩增PL678基因 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到了一条长约470 bp的DNA扩增产物,如图1。2.2融合表达质粒的构建 PCR产物经EcoR I、EcoR V双酶切并纯化后与同样EcoR I、EcoR V双酶切的pLV 2.0载体相连接,构建LTB融合表达质粒pLV 2.2,转化E.coliDH5,氨苄青霉素抗性LB平板筛选,酶切鉴定阳性重组子,结果见图2、3。取阳性克隆测序,结果扩增的PL678基因序列与GenBank公布的完全一致。2.3 融合蛋白的表达 pLV 2.2转化E.coliJM109,经IPTG诱导,收集细菌沉淀,超声上清经G M12ELISA图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物M:DNA相对分子质量(Mr)标准(DL 2 000);1:PCR产物Figure 1.Analysis of the PCR product ofPL678gene by agarose gelelectrophoresisM:DNA marker(DL 2 000);1:PCR product图2 重组质粒的构建示意图Figure 2.Scheme of the construction of the recombinant plasmid图3 重组质粒的酶切鉴定1:PCR产物;2:重组质粒EcoR I和EcoR V酶切;3:重组质粒EcoRV酶切;4:pLV 2.0EcoR I和EcoR V酶切;5:DNA/HindMr标准;M:DNAMr标准Figure 3.Determination of the recombinant1:PCRproduct;2:recombinant digested byEcoR I andEcoR V;3:recombi2nant digested byEcoR V;4:pLV 2.0 digested byEcoR I andEcoR V;5:DNA/Hindmarker;M:DNA marker072中 华 男 科 学2004年4月 第10卷检测结果表明重组菌表达了能与G M1结合的蛋白,超声上清SDS2PAGE后转移至硝酸纤维膜上,分别以兔抗LT多抗血清及Ng感染患者阳性血清作免疫印迹亦证实了融合蛋白在JM109中的表达,如图4,LTBMr约为12 800,PL678Mr预测值为14 000,融合蛋白Mr为27 000。图4 融合蛋白的表达A:SDS2PAGE;B:W estern2blot;1:JM109;2:pLV2.0/JM109;3:pLV2.2/JM109未诱导;4:pLV2.2/JM109诱导;M:蛋白质Mr标准Figure 4.Expression of the fusion proteinA:SDS2PAGE;B:W estern2blot;1:JM109;2:pLV2.0/JM109;3:pLV2.2/JM109non2induced with IPTG;4:pLV 2.2/JM109 induced with IPTG;M:proteinmolecular weight marker3 讨论近年来,我国淋病的患病率呈明显增长趋势,其传播对人类的健康造成极大的危害。研制淋病疫苗对预防和控制其感染具有重要的意义。由于Ng具有高度变异性,死菌苗不适于制备疫苗,而且不良反应大;另外,Ng本身生长能力差,培养条件要求苛刻,很难进行大规模生产性培养,极大限制了淋病疫苗的发展。随着Ng全基因组测序的完成及蛋白质组计划的进展,其许多保护性抗原逐渐被揭露,为成功研制淋病疫苗奠定了重要基础3。包括热修饰蛋白(Opa)、还原反应可修饰蛋白(Rmp)、菌毛蛋白(pilin)和脂多糖(LPS)等Ng抗原均能诱导相关的特异性体液免疫和细胞免疫,但抗体的保护性差、免疫力不持久、抗原的变异等不足以保护再感染。目前研制Ng疫苗主要集中在筛选有效保护性抗原和诱导有效粘膜免疫应答等方面4。porin(Por)是Ng的外膜蛋白(outer membrane pro2tein,OMP),是最有可能用于成功制备淋病疫苗的候选抗原。Por在Ng感染的病理过程中发挥重要作用:引起吞噬细胞的呼吸爆发5;通过胞质Ca2+内流激活Ca2+依赖的蛋白酶 Calpain介导靶细胞的细胞凋亡,以ATP封闭Por的通道,能阻断其导致凋亡的功能6。抗Por抗体具有杀菌作用。Virji等7报道Por的单克隆抗体SM24/SM101对94%的同源或异源Ng菌株具有免疫调理作用,通过介导C3和C9沉积于Ng并活化中性粒细胞,能保护上皮细胞免受Ng的侵犯。Arko等8采用Por的合成多肽致敏小白鼠,在受到Ng阴道攻击时,清除Ng较对照组明显加快,阴道冲洗样本中抗Ng的特异性IgA和IgG抗体水平明显增加。Simpson等9以Por与淋病患者的T细胞孵育检测到CD4+Th细胞分泌的IL24,以及抗Por抗体水平明显增加。以上研究表明,Por为Ng的有效保护性抗原。分析Por的分子结构,其暴露于膜外侧的表位loop 2(PL678)具有相对保守性10,GenBank公布的34株Ng中其核苷酸序列同源性高达95%以上。基础研究证实,Ng疫苗必须辅以能有效诱导粘膜免疫的佐剂才能激活Th2细胞免疫应答途径,产生大量的sIgA,阻止Ng入侵和定植11。E.coliLT是强有力的粘膜免疫佐剂,但天然全毒素分子具有潜在毒性,其B亚单位(LTB)无毒性且保留有LT的佐剂功能,是理想的粘膜免疫佐剂。Verweij等12用重组LTB(rLTB)与流感病毒表面抗原血凝素(hemag2glutinin,HA)亚单位共同免疫Balb/c小鼠,能显著增加血清抗HA亚单位IgG和IgA滴度,且鼻粘膜sIgA水平明显增高;更有意义的是粘膜免疫应答不仅发生于鼻腔,也发生于远距离的泌尿生殖道,符合共同粘膜免疫系统的理论。本研究运用分子设计的理论和基因重组技术,通过分析Ng具有保护作用的抗原表位PL678的分子结构,克隆其基因,并与强力、无毒的粘膜免疫佐剂LTB按适当的空间结构在E.coli中融合表达呈免疫优势/显性,为研制和开发淋病疫苗奠定了一定的基础。使用的融合表达载体pLV 2.0在LTB与被融合蛋白之间设计了4个氨基酸TAPI的接头,目的是干扰 2螺旋的形成以最大保持LTB与被融合蛋白两者的天然构象;带有LTB的信号肽序列,表达产物为分泌型蛋白。以构建的pLV 2.0为载体,构建了Ng的分子内佐剂疫苗,G M12ELISA及Western印迹证实了其表达。其刺激机体的免疫应答情况及免疫保护作用的研究还在实验中。参考文献1Day S,Ward H,Ison C,et al.Sexual networks:the intergration ofsocial and genetic dataJ.Soc Sci Med,1998,47(12):198121992.2J 萨姆布鲁克,EF 弗里奇,T 曼尼阿蒂斯主编.分子克隆实验指南M.第2版.北京:科学出版社,1992.(下转274页)172第4期 潘 静 等 淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达pH值无变化,精子活力下降、畸形精子明显增加;郭永和等6共收集89例男性不育患者的精液标本,发现阴道毛滴虫阳性率为15.73%,而正常对照组仅为3.13%。本文通过体外实验也证实了阴道毛滴虫感染者精子质量明显下降(表1)。Rendon2Maldonado等7实验证明阴道毛滴虫具有吞噬乳酸杆菌、上皮细胞、红、白细胞的能力。陈文列等8报告应用透射电镜观察到体外阴道毛滴虫吞噬、消化人精子全过程的超微结构变化。这说明阴道毛滴虫可通过吞噬作用杀伤精子。John等1研究发现,阴道毛滴虫与精子共同孵育,浓度在109/L以上时精子活力明显降低。本实验显示除去虫体的培养液仍能明显抑制精子活动,提高浓度和延长作用时间均可使损害作用增强,证明滴虫损害精子时,其代谢产物发挥了重要作用。蔡惠珍等9为此结论提供了理论依据,他们通过电镜观察到阴道毛滴虫向质膜外排放溶酶体酶的现象,证实了虫体活动时可释放大量溶酶体酶。本研究还发现明显降低精子运动的阴道毛滴虫浓度为6108/L以上,较John等1报道的低,可能是因为CASA较人工方法能够更客观、更准确地分析精子运动参数所致。阴道毛滴虫代谢产物损伤精子的作用非常明显和迅速。在本实验中,当把去除阴道毛滴虫之后的培养液与优化精子混合后,立即可观察到大量精子的运动受到不同程度的抑制,至6 h时,B组仅极少数精子有微弱的活动,C组情况类似,只是程度稍轻。本研究显示阴道毛滴虫代谢产物体外能显著抑制精子活率及活力,进一步证明了阴道毛滴虫感染是造成不孕不育的原因之一。在临床诊治不孕不育时,应重视男女双方阴道毛滴虫感染的检查和治疗,尤其对容易漏诊的症状轻微或无症状携带者,更应注意有无阴道毛滴虫感染的情况。参考文献1Tuttle JPJr,Holbrook TW,Derrick FC.Interference of human sper2matozoal motility byTrichomonas vaginalisJ.J Urol,1977,118(6):102421025.2 张丽芳,周丽萍,包其郁,等.温州地区4 990例女性生殖道感染STDs病原检测与分析J.温州医学院学报,1999,29(1):36238.3 桑 红,周文泉,倪容之,等.男性阴道毛滴虫病的研究进展J.中华男科学,2002,8(1):61263.4 谢 辉,黄慧聪,潘长旺,等.男性尿道炎患者阴道毛滴虫感染情况调查J.中国寄生虫病防治杂志,2002,15(3):1482150.5G opalkrishnan K,Hinduja IN,Kumar TC.Semen characteristics ofasymptomatic males affected byTrichomonas vaginalisJ.J In VitroFert Embryo Transf,1990,7(3):1652167.6 郭永和,刘永春,秦 剑.阴道毛滴虫感染与男性不育症关系的研究J.中国寄生虫病防治杂志,2000,13(2):160.7Rendon2Maldonado JG,Espinosa2Cantellano M,G onzalez2Robles A,et al.Trichomonas vaginalis:in vitrophagocytosis of lactobacilli,vaginal epithelial cells,leukocytes,and erythrocytesJ.Exp Para2sitol,1998,89(2):2412250.8 陈文列,钟秀容,陈金富,等.阴道毛滴虫吞噬精子过程的超微结构观察J.电子显微学报,1997,16(1):15220.9 蔡蕙珍,陈文列,钟秀容,等.阴道毛滴虫酶的定位与代谢的研究J.中国寄生虫病与防治杂志,1993,6(4):2562258.(商学军 编发)(上接271页)3 何 芳,赵连三.淋病疫苗研制的若干问题J.中华预防医学杂志,1998,32(4):2482250.4Russell MW,Hedges SR,Wu HY,et al.Mucosal immunity in thegenital tract:prospects for vaccines against sexually transmitted dis2eases a reviewJ.Am J Reprod Immunol,1999,42(1):58263.5Bauer FJ,Rudel T,Stein M,et al.Mutagenesis of theNeisseriagonorrhoeaeporin reduces invasion in epithelial cells and 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