刚果红法测定麦汁葡聚糖.pdf

第 16卷无 锡 轻 工 大 学 学 报Vol.16第 1期JOU RN AL OF WUX I UN IV ERSITY OF LIGHT INDU STRY1997 No.1收稿日期:1994-11-07刚果红法测定麦汁和啤酒中的-葡聚糖李永仙尹象胜顾国贤陆健(无锡轻工大学生物工程学院,无锡,214036)摘要研究了以刚果红分光光度法测定麦汁及啤酒中的-葡聚糖,探讨了实验条件,在 pH8.0的条件下,刚果红和水溶性的-葡聚糖(分子量 103 104)形成有色物质,摩尔吸光系数为 9.64 (103 104)L mol-1 cm-1,当参加反应的 2.0ml-葡聚糖溶液中-葡聚糖的含量为 0 100 g时,反应液吸光度的变化符合比耳定律,变异系数 1.1%5.1%,标样的回收率在 90.2%98.6%之间,测定麦汁或啤酒中的-葡聚糖时,变异系数为 3.7%左右。关键词刚果红;-葡聚糖;分光光度法中图分类号 T S262.50 前言-葡聚糖是大麦胚乳细胞壁的主要成分,含量因大麦品种、产地、种植年份,自然条件而异,一般占 5.0%9.5%(大麦的绝干量),细胞壁中-葡聚糖大多是分子量为 107 108的高分子化合物,在制麦汁过程中受到麦芽-葡聚糖酶不同程度水解,其中间产物分子量 103 104,为热水可溶性物质,能进入麦汁,再进入啤酒中。含量过高(如 200mg/L)会造成麦汁或啤酒粘度高,过滤困难,形成啤酒早期混浊3。含量过低(80mg/L)造成啤酒口味淡薄,因此控制麦芽和啤酒中的-葡聚糖含量是当今啤酒界关心的问题。文献 8报道了-葡聚糖的测定方法。传统的 Phenol Sulpuric4,包括麦汁同硫酸铵在0 4 下长达 20h的平衡过程,现该法已逐渐被更新的方法取代。酶法6包括酶反应的三个步骤,但测定的是-葡聚糖的总含量。近年来,许多研究人员开始采用流动注射分析仪的荧光法测定-葡聚糖1,5,7,然而 Fluro-chrome Calcofluor与-葡聚糖的结合能力会受到 Cal-cofluor的发光及实验条件如 pH值、缓冲液的离子强度和试剂浓度的影响1。据报道,刚果红与-葡聚糖的结合具有高度的专一性 9。虽然反应呈现出随-葡聚糖的分子量变化而变化的特征,但对变化的-葡聚糖的分子量而言,刚果红和 Calcofluor的敏感性显示出,两种试剂与-葡聚糖的反应具有相似的结构模式2,而实验表明,刚果红法更简便、快捷、实用。1 实验仪器及试剂1.1 仪器721型分光光度计 pHs87-3型酸度计1.2 试剂大麦-葡聚糖 Sigma公司产品;刚果红(Congo Red)Fluka产品;-葡聚糖标准溶液准确称取 0.0010g大麦-葡聚糖,加少量蒸馏水,70 水浴助溶,冷却至室温后定容至 10ml,冰箱贮存备用,使用前配制成 0.1mg/ml的溶液;刚果红溶液 0.1000克刚果红溶于 0.1mol/L pH8.0的磷酸缓冲液中,定容至 1L;酒样市售 12 P Lager型啤酒2 试验方法2.1 标准曲线绘制取 6组试管,除 0号为 1只外,其余均为3只平行管,按表 1将标准-葡聚糖溶液进行稀释。以上各试管中,分别加 4.0ml刚果红 溶液摇匀,20下准确作用 10min,用表 1 标准-葡聚糖溶液的稀释试管组号标准-葡聚糖溶液(100 g/ml)蒸馏水稀释-葡聚糖溶液浓度(g/2.0ml)0 0 2.0 010.251.752520.501.505030.751.257541.001.0010051.250.751251.0cm的比色杯,于 550nm波长下测定吸光度,以 0号管中反应液作空白调零。2.2 样品分析吸取 0.1ml麦汁或啤酒,依次加 1.9ml蒸馏水,4.0ml刚果红,20 下准确反应 10min,以 2.0ml蒸馏水代替样品作空白,测定吸光度,根据标准曲线即可得知样品中的-葡聚糖含量。3 条件确定3.1 最大吸收波长按试验方法测试试剂及反应液的吸收光谱及差谱,最大吸收分别为 480nm,500nm,且在 550nm处有最大差谱,所以选择测定波长为 550nm,吸收光谱和差谱分别见图 1和图 2.图 1吸收曲线图 2差谱水+刚果红溶液-葡聚糖溶液+刚果红溶液9李永仙等:刚果红法测定麦汁和啤酒中的-葡聚糖图 3 吸光度-pH曲线3.2 pH对测定的影响1)配制不同酸度的刚果红溶液:用不同 pH值浓度为 0.2mol/L的磷酸缓冲液与等体积的浓度为200mg/L蒸馏水的刚果红溶液混匀备用。2)-葡聚糖标准溶液 2.0ml,分别加入以上不同酸度的刚果红溶液 4.0ml;2.0ml蒸馏水加入相对应的刚果红溶液作空白测定吸光度,结果见图 3.由图 3可知,pH在 7.8 8.4之间,吸光值较大,选择反应时的 pH为 8.0.3.3 反应时间的选择按试验方法,测定了反应液在 5 12min内吸光度的变化,结果见图 4.由上结果,实验中选择刚果红与-葡聚糖的反应时间为 10min.3.4 作用温度的选择按试验方法,测定了在不同温度下反应液的吸光度变化,结果见图 5.图 4 吸光度-时间变化曲线图 5 吸光度-温度变化曲线由图 5可知,温度对反应液吸光度的变化有较明显的影响,温度为 20 时,吸光度最大,因此选 20 的反应温度。3.5 被测样品的添加量对测定结果的影响将麦汁稀释 10倍、吸取 0.25 1.25ml加蒸馏水定体积为 2.0ml,按试验方法测定吸光度,结果见图 6.同样方法,啤酒的测定结果见图 7.图 6 麦汁取样量对-葡聚糖回收率的影响图 7 啤酒取样量对-葡聚糖回收率的影响10无 锡 轻 工 大 学 学 报第 16卷第 1期根据图 6,图 7结果,取 0.1ml待测样品,依次加入标样及蒸馏水,按试验方法,测定标样的回收率,结果见表 2.表 2标样的回收率麦汁啤酒样品体积(ml)0.10 0.10 0.10 0.100.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.100.1mg/ml的标样体积(ml)0.100.200.300.400.500.100.200.300.400.50蒸馏水(ml)1.801.701.601.501.401.801.701.601.501.40-葡聚糖(g/2.0ml混合样)24.6734.2445.1455.72 64.1920.43 30.3739.2647.9456.41测得-葡聚糖(混合样-样品含量)10.4620.0330.9341.51 49.989.10 19.0427.9336.6145.08实际加入标样(g/2.0ml)10.6121.8332.2044.26 53.0110.00 20.0030.0040.0050.00标样回收率(%)98.4091.7596.0593.78 94.2891.00 95.2093.1091.5390.16 0.1ml样品含-葡聚糖:麦汁中含 14.12 g,啤酒中含 11.33 g由以上结果可知,当被测样品取量为 0.1ml时,能较准确地测得样品中的-葡聚糖含量。3.6 氧化、还原物质对测定结果的影响按试验方法,测得结果见表 3和表 4.表 3 添加物对标样测定的影响标样-葡聚糖标样+V C标样+H2O2含量(g/2.0ml)100100+3100+300100+1.0110+303吸光度 A0.2700.2750.2750.2830.2650.2650.2650.2800.2700.260A-0.2730.2740.2650.2780.265表 4添加物对啤酒中的-葡聚糖测定的影响酒样*啤酒(T)啤酒(Q)啤酒+添加物酒+水酒+VC液酒+H2O2酒+水酒+VC液酒+H2O2所加体积(ml)1.0+1.01.0+1.01.0+1.01.0+1.01.0+1.01.0+1.0吸光度 A0.0350.0330.0380.0350.0360.0350.1720.1740.1770.1770.1790.176A-0.0340.0380.0360.1730.1770.178-葡聚糖(mg/L)63.1266.3964.23361.60363.21364.20*酒样除气后稀释 10倍;VC及 H2O2的浓度分别为 300mg/L,101mg/L.图 8 -葡聚糖的标准曲线从表 3和表 4中的结果可以看出,氧化还原物质对-葡聚糖的测定结果无明显影响。4 试验结果4.1-葡聚糖的标准曲线按试验方法绘制-葡聚糖的标准曲线,见图 8.由曲线可得,当-葡聚糖浓度为 25 g/ml时,对应的吸光度为 0.241,由此可得摩尔系数 9.64 (103104)L mol-1 cm-1,桑德尔灵敏度为 1.0411李永仙等:刚果红法测定麦汁和啤酒中的-葡聚糖(10-1 10-2)gcm-2,变异系数在 1.1%5.1%之间,取曲线中的前 5个点进行线性回归,得相关系数 0.996.近似得到麦汁(或啤酒)中的-葡聚糖含量:-葡聚糖含量(mg/L)=(A-b)/a1V 2.0式中 V 麦汁或啤酒的吸取体积(本试验中为 0.10ml)a,b常数(曲线回归方程所得)2.0参加反应的样品体积(0.10ml样品加 1.9ml蒸馏水)A在 550nm处样品的吸收值进而得到麦芽中的水溶性-葡聚糖的含量:-葡聚糖(mg/100g绝干麦芽)=麦汁中的-葡聚糖的含量(mg/100ml)D(100-G)(800+w)100100-w式中 w 麦芽水份的百分含量D 协定麦汁容重G 麦芽汁浸出物的质量分数4.2 样品分析结果按样品分析方法,测定几种麦芽协定糖化过滤麦汁及几种市售啤酒中的-葡聚糖含量,结果见表 5和表 6.表 5 麦芽糖化过滤麦汁中的-葡聚糖麦芽品种(麦芽来源)江苏冈二(实验室自制)加麦麦芽(进口)新疆莫特 44(实验室自制)甘肃匈 84(实验室自制)江苏冈二(南京麦芽厂)过滤麦汁浸出物 8.048 8.756 8.244 8.6348.317-葡聚糖mg/L麦汁334.7156.9173.9156.6199.3-葡聚糖mg/L8.6 P麦汁357.7154.1181.4150.0206.1-葡聚糖 mg/100g 绝干麦芽304.4140.8156.5136.3179.6表 6 几种市售 12 P Lager型啤酒中的-葡聚糖酒样(出品厂)青岛啤酒(青岛二啤)青岛啤酒(青岛一啤)中德啤酒(武汉中德长啤)太湖水啤酒(无锡啤酒厂)-葡聚糖 mg/L啤酒427.2361.6114.960.1注:表中所列酒样为 1993年市售啤酒麦汁经过 6次平行测定,变异系数为 3.7%.5 结论1)利用刚果红分光光度法能够较准确、方便、快速地测定出麦汁或啤酒中的-葡聚糖含量。2)从实验结果可以看出,当参加反应的麦汁或啤酒实际用量为 0.10ml时,测定结果有较高的准确性。随着用量的增加,测定数值准确性下降,出现这种现象的原因,还有待进一步研究。12无 锡 轻 工 大 学 学 报第 16卷第 1期参考文献1 American Society of Brewing Chemists.Report of Subcommittee on betaglucan in Congress Wort by FluorescenceMethod.J.ASBC,1991,49:187 1892 Anderson I W.The effect of beta-glucan molecular weight on the sensitivity of dye binding assay procedures for beta-glucan estimation.J.Inst.Brew,1990,96:323 3263 Bamforth C W.Barley beta-glucans,their role in malting and 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B-glucan in wort and beerand methods of experiment have been studied in this paper.2.0ml of B-glucan(0 59mg/L,molecular weight is 103 104)mixed with 4.0ml congo red solution(100mg/L in 0.1MpH 8.0 phoshpato buffor)forms a coloured complex.The apparent molar absrptivity of 9.64 103 9.64 104L/mol.cm goes in agreement with Beer s law.The variation and re-covery rate by using this method are within 1.1%5.1%and 90.2%98.6%respective-ly.The variation is 3.7%in detecting the soluble B-glucan in wort or beer.Key-words congo red;-glucan;spectrophotometry13李永仙等:刚果红法测定麦汁和啤酒中的-葡聚糖