真核细胞周期调控与肿瘤课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,山东大学医学院生化与分子生物学系任桂杰,第一讲,细胞周期调控与肿瘤,Cell cycle regulation and tumor,1,内容介绍,:,第一节 细胞周期概述,第二节 细胞周期的各元素及其相互作用,第三节 细胞周期调控与肿瘤,2,第一节 细胞周期概述,一、细胞周期,细胞增殖周期，简称细胞周期,(cell cycle),，是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始,到下一次有丝分裂结束为止所经历的整个过程。,3,G1,期：（,DNA,合成前期）,从有丝分裂完成到,DNA,复制之前的一段时期；,S,期：,（,DNA,合成期,）,为,DNA,复制的时期；,G2,期,：（,DNA,合成后期,）,从,DNA,复制完成到有丝分裂开始的一段时期；,M,期：（有丝分裂期）,从细胞分裂开始到结束的一段时期。,细胞分裂周期,4,个时相,DNA,合成前期,DNA,合成期,DNA,合成后期,有丝分裂期,M,phase,G,0,1.Phases of Cell Cycle,4,2.Characteristics of Cell Cycle Phases,G,1,期：,细胞周期的大部分时相处于,G,1,期，动物细胞一般为,6-12,小时。该期主要的生化活动是,合成,RNA,和蛋白质,。,S,期：,此期一般持续,6-8,小时，其长短主要由基因组的复杂度决定。该期主要的生化活动是,复制,DNA,。,5,G,2,期：,该期主要的生化活动是,合成一些与有丝分裂有关的蛋白质,。,M,期：,该期很短，一般持续,0.5-2,小时。该期生化合成停止，,细胞形态发生改变,，,一个母细胞分裂成,2,个子代细胞,。,6,3.Checking Points of Cell Cycle,真核细胞的分裂增殖必须经过两个关键的调控点：即,DNA,合成开始时的,G,1,S,期的转换,和有丝分裂开始时的,G,2,M,期的转换,。,除此之外，细胞还有,G,0,G,1,期的转换,，以及,S,期,的检查点。,7,8,4.,细胞周期的特点,:,单向性：只能沿,G1,、,S,、,G2,、,M,方向推进。,阶段性：各期细胞形态和代谢特点有明显差异，细胞可因某种原因在某时相停止下来，待生长条件适合后重新活跃到下一时相。,检查点：各时相交叉处存在检查点，决定细胞下一步的增殖趋向。,细胞微环境：细胞周期是否顺利推进与细胞外信号和条件等密切相关。,9,1.,周期性细胞：,连续分裂的细胞,；始终处于增殖和死亡的动态平衡中（稳态更新），如表皮细胞、骨髓细胞。,2.G,0,期细胞：,休眠细胞,；暂时脱离细胞周期，适当刺激可重新进入细胞周期（条件更新）。如肝、肾细胞。,3.,终端分化细胞：,不分裂细胞,；不可逆的脱离细胞周期，丧失增值能力，但具有一定生理功能。如神经细胞、心肌细胞。,二、机体活细胞的分类,10,11,细胞周期蛋白,/,素,(cyclin,，,CLN,),细胞周期素依赖激酶,(cyclin-dependent kinase,，,CDK,),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,（,CDK inhibitory protein,，,CKI,）,第二节,细胞周期的元素及其相互作用,调节细胞周期的,3,类蛋白质,:,12,1.,周期蛋白依赖性蛋白激酶（,CDK)-,CDK1-6,是调节细胞周期的主要蛋白质，通过使其他蛋白质磷酸化而驱动细胞周期进程,其活性受周期蛋白的正调控，受,CKI,的负调控。,2.,周期蛋白（,cyclin)-,A,B,C,D,E,等，不同的周期蛋白与不同的,CDK,结合形成,cyclin-CDK,复合物，可调节细胞周期的不同阶段。,3.,CDK,抑制蛋白（,CKI)-,与,CDK,结合后可抑制,CDK,的活性，可分为两大家族：,CIP/KIP(p21,p27,p57,等,):,广泛抑制多种,CDK,的活性。,INK4,家族,(P15,p16,p18,p19,等,):,特异性抑制作用。,13,CDK4/cyclin D,-,CDK2/cyclin E,-,CDK2/cyclin A,-,CDK1/Cyclin B,14,15,16,2001,年，,Leland Hartwell,，,Paul nurse,和,Tim hunt,因成功揭示细胞周期分子机制而共同获得第,100,届诺贝尔生理学与医学奖。这标志着细胞周期的研究已获得全世界的认同，为细胞周期与肿瘤的研究奠定了基础。,17,Cyclin(CLN),又称周期素，是一组结构,相似,并能结合和调节细胞周期蛋白依赖,激酶,(cyclin-dependent kinase,CDK),活,性的蛋白质。,1.Structure and Function of Cyclin,18,周期素都是,CDK,的调节亚基,，分别在细胞周期的不同时期积累，激活,CDK,，使其具有催化关键底物磷酸化的作用并调节底物活性。,在高等真核细胞中，周期素至少分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,等几大类。,19,不同的周期蛋白（,cyclin A,B,C,D,E,F,G,H,等）能与不同的,CDK,结合，可调节细胞周期的不同阶段。,G1,S G2 M,D-CDK4/6,E-CDK2,A-CDK2,B-CDK1,G1,期运行,S,期启动,G2,期启动和进行,M,期启动和进行,20,G,1,S,G,2,M,prophase,metaphase,anaphase,telophase,Cyclin D,CDK4/6,Cyclin B,CDK1,Cyclin A,CDK2,Cyclin E,CDK2,Cyclins/CDKs in the different phases of cell cycle,21,The Expressional Levels of Cyclins during Cell Cycle,22,Cyclins,的时相性起伏,D,E,A,B,Cyclin,的功能调控主要依靠其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。,23,The Relationship of Cyclin Expressional Levels with DNA Replication,24,100aa,组成,cyclin box,Cyclin,-COOH,H,2,N-,cyclin,CDK,Cyclin/CDK,Combine,催化亚基,CDK,所有,Cyclin,蛋白分子上都有一段与,CDK,结合并使之激活的保守区，称为,细胞周期素盒,(Cyclin box),。,25,此外，周期蛋白还含有,降解盒（,destruction box,）或,PEST,序列（脯,-,谷,-,丝,-,苏），,可通过定时降解或快速转换来调节周期素的水平。,26,周期素的家族成员,27,Cyclins,通过泛素,-,蛋白酶体途径降解,28,2.Structure and Function of CDK,CDK,是一组,丝氨酸,/,苏氨酸,蛋白激酶，,需与相应的,cyclin,结合才能显示活性，,故,CDK,称为依赖,cyclin,的蛋白激酶。,不同阶段有相应的,cyclin/CDK,。,cyclin,CDK,Cyclin/CDK,29,人们对,CDK,的认识，最初是通过研究培养细胞和酵母细胞而得到的。,目前已经确定的,CDK,有：裂殖酵母中,CdC2,；酿酒酵母中的,CdC28,、,PHO85,、,KIN28,以及人类细胞中,CDK,1,10,。,2.1 Types and Characters of CDK,30,脊椎动物的,CDK,CDK,结合的相应,cyclin,作用的细胞周期,CDK1,CDK2,CDK3,CDK4,CDK5,CDK6,CDK7,CyclinA,B,CyclinA,CyclinD1,D2,D3,CyclinE,CyclinD1,D2,D3,P35,*,CyclinD1,D2,D3,CyclinD1,CyclinH,P36,*,G,2,/M,转换；,M,早期,S,期；,G,2,期,G,1,期,G,1,/S,转换,G,1,期,G,0,/G,1,转换,、,G,1,期,神经纤维的磷酸化、,G,1,期,G,0,/G,1,转换,活化,CDK,*P35,，,P36,的结构与细胞周期蛋白无相似性,31,CDK,的分子量一般为,35,40kD,，不同,CDK,的氨基酸组成有,40%,以上的同源性,。,CDK,催化亚基的活性中心约由,300,个氨基酸残基组成，当处于,单体或非磷酸化状态时，,CDK,没有催化活性,。,32,Molecular Structure of CDK2,33,在,激活因素,中，目前认为,CDK,与,周期素的结合,以及保守的,苏氨酸残基,(Thr,161,),的磷酸化,是较为重要的两种调节因素；,而在,抑制因素,中，,CDK,的,N-,端氨基酸残基的,抑制性磷酸化,(Thr,14,和,Tyr,15,),以及,抑制蛋白,(CKI),的结合,是主要的调节因素。,2.2 Regulation of CDK Activity,34,35,周期素的激活作用：,周期素中的,“,周期素盒,”,结构域直接和,CDK,结合，并与,CDK,的激活相关,。,周期素的结合与激活作用主要通过周期素在细胞周期中的,浓度波动,来调控。,2.2.1 Activation of CDK,36,CyclinA-CDK,2,Complex with ATP Bound,37,磷酸化修饰的激活作用：,CDK,的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人,CDK,1,（,p34,cdc2,）的,Thr,161,和,CDK,2,的,Thr,160,的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。,38,催化,CDK,1,和,CDK,2,磷酸化的酶是,CAK,，,催化亚基为,CDK,7,CAK,调节亚基为,周期素,H,组装蛋白因子,MAT1,（,MAT1 CDK-activating kinase assembly factor 1,）,39,Complex of CDK,7,-CyclinH-MAT1,Cyclin H,CDK,7,MAT1,40,CAK,CDK,的激活机制,:,CDK,Thr 160/161,磷酸化,CDK/Cyclin,cell cycle,41,CDK,的激活和失活还与,Thr14/Tyr15,的磷酸化和去磷酸化有关。,Thr14/Tyr15,的去磷酸化,导致,CDK,的激活,使其去磷酸化的,磷酸酶是,CDC25,。,42,CDK,启动,cell cycle:,CDK,激活,Cyclin,与,CDK,结合,CAK,对,CDK,Thr 160/161,的磷酸化,Cell cycle,CDC25,对,CDK,Thr14/Tyr15,去磷酸化,43,磷,酸化修饰的抑制作用：,在人的,CDK,1,和,CDK,2,中，,Thr,14,和,Tyr,15,残基的磷酸化可抑制,CDK,的催化活性。,其原因在于上述残基的侧链位于该酶活性中心,ATP,结合部位的顶端。,2.2.2 Inhibition of CDK,44,催化,Thr,14,和,Tyr,15,磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使,Thr,14,磷酸化的为蛋白激酶,Myt1,，使,Tyr,15,磷酸化的是蛋白激酶,Wee1/Mik1,。,催化,Thr,14,和,Tyr,15,脱磷酸化的是蛋白磷酸酶,CDC25,。,因此，蛋白激酶,Wee1,和,Myt1,及蛋白磷酸酶,CDC25,的相对活性，决定,CDK,1,和,CDK,2,的活性高低。,45,Regulation of CDK Activity,CAK,46,抑制蛋白的作用：,抑制蛋白，即,周期素依赖性蛋白激酶抑制子（,CKI,），,大部分,CKI,都是抑癌基因的编码产物。,在哺乳动物细胞中，目前已经确定的,CKI,主要有：,P15,和,P16,、,P19,、,P21,、,P27,、,P53,和,PRb,，,可分别抑制各型,CDK,的活性。,47,P16,INK4A,和,P15,INK4B,：,是分别由抑癌基因,INK4A/MTS1,和,INK4B/MTS2,编码合成的蛋白质，,能专一性的与,CDK,4,和,CDK,6,结合,，并阻止其与周期素的结合反应，从而抑制其蛋白激酶活性，,使细胞停留于,G,1,期。,48,P16,CDK,4,cyclinD,1,一,P cdk,介导的磷酸化,Rb Rb P,一,G,1,S,DNA,转录,49,P21,WAF1/CIP1,：,是由抑癌基因,WAF1/CIP1,编码合成的蛋白质，几乎,能与所有的周期素,-CDK,复合物结合,，抑制其蛋白激酶活性，,使细胞停留在,G,1,期。,50,P27,KIP1,：,是由抑癌基因,KIP1,编码合成的蛋白质，也,能与几乎所有的周期素,-CDK,复合物结合,，抑制其蛋白激酶活性，,使细胞停留于,G,1,期。,51,p27-cyclin-cdk complex,52,P53,：,由抑癌基因,p53,编码合成的蛋白质，是,WAF1/CIP1,基因,（,P21,）的转录激活因子,。,因此，,P53,的表达可促进,P21,WAF1/CIP1,的转录表达，从而抑制,CDK,的蛋白激酶活性。,53,Function of P53,：,54,55,56,PRb,：,是由,Rb,抑癌基因编码合成的蛋白质，有,低磷酸化型和高磷酸型,两种型式。,低磷酸化型的,PRb,可与转录因子,E2F,形成复合体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分裂；而高磷酸化型的,PRb,则不能与,E2F,形成复合体。,催化,PRb,由低磷酸化型转变为高磷酸化型的蛋白激酶就是各型,CDK,。,57,Rb,在细胞周期内的磷酸化,58,Cyclin D,与,CDK,结合使,Rb,释放结合的转录因子,E2F,59,60,Figure.Regulation of Rb and E2F activities in late G,1,.,Interaction of E2Fs with nonphosphorylated Rb protein initially inhibits E2F activity.When signaling from mitogens is sustained,the resulting initiate the phosphorylation of Rb,converting some E2F to the active form,which activate target genes whose products are essential for S phase.,61,Rb function is linked to other tumor suppressors,62,小结,Rb,的生理作用,:,Rb,基因是视网膜母细胞瘤的致病基因，位于,13q14,。,Rb,蛋白,p105,两种形式：磷酸化,Rb,和非磷酸化,Rb,（活性形式）,Rb,蛋白的,作用：,1.,非磷酸化,Rb,与转录因子,E2F,结合，抑制其活性，使细胞停留在,G1,期。,E2F,是很强的转录因子，可促进许多参与,S,期的酶和蛋白质如,DNA,聚合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶等的表达，增强,DNA,的复制，促进细胞通过,G1/S,控制点。,2,Rb,磷酸化 磷酸化的,Rb,释放,E2F,促进,DNA,的合成,细胞分裂增殖。,63,3.,病毒癌蛋白（,SV40,大,T,抗原，腺病毒,EIA,和人乳头瘤病毒,E7,等）和,Rb,结合，释放,E2F,，从而促进细胞的分裂增殖和转化。,4.Rb,基因的突变失活（点突变，缺失或,GC,岛的高甲基化等）使之失去结合,E2F,和抑制细胞增殖的能力。,5.,生长因子如,EGF,、,PDGF,和癌基因,c-myc,等都可促进,cyclinD1,的表达和,D1-CDK4/6,的形成，从而促进细胞的分裂增殖。,6,CDK,抑制蛋白,P16,是抑癌基因,P16,可竞争性地与,CDK4/6,结合，抑制,CDK4/6,的活性，从而抑制细胞从,G1S,过渡，使细胞停留在,G1,期。,64,3.,细胞周期调控中各元素间的相互作用,细胞周期的调控可分为外源和内源性调控,.,外源性调控,主要是细胞因子以及其它外界刺,激引起；,内源性调控,主要是通过,Cyclin,CDK,CKI,的网络调控来实现。,65,生长信号（,GF,）,：,通过早期应答基因传递到细胞周期调控机制时,首先是,cyclinD,的表达增加,与,CDK4/6,形成复合物，使细胞周期运行。,抑制信号（,TGF-,）,：,促进,CKI,表达增加,抑制,CyclinD-CDK4/6,复合物的功能，使细胞阻滞在,G1,期。,66,67,P,Rb,E2F,D-CDK 4/6,E2F,磷酸化的,Rb,EGF,PDGF,c-myc,等,Cyclin-D,病毒癌蛋白与,Rb,结合,参与,S,期,DNA,合成的,蛋白质基因的表达,细胞的过度增殖,和癌变,Rb,基因的突变,P16,突变的,Rb,蛋白,68,69,各种细胞周期蛋白随特定细胞时相而出现。,G1,早期，,cyclinD,表达,并与,CDK4,或,CDK6,结合，成为始动细胞周期的启动子；,G1,晚期、,进入,S,早期后,cyclinE,表达，并与,CDK2,结合，推动细胞进入,S,期；,进入,S,期后，,cyclin A,表达,，,cyclin A,和,CDK2,相结合可以调节,S,期进入,G2,期；,S,晚期、,G2,早期，,cyclIin A,、,cyclin B,表达，,并与,cdc2,结合，促进细胞进入,M,期。,70,P53 P16,介导 抑制,CDK,4,p21,CDK,4,cyclinD,1,抑制,CDK,4,活化,CDK,4,P cdk,介导的磷酸化,Rb Rb P,E2F,无活性复合物,E2F,启动,DNA,转录,G,1,S,DNA,转录,71,CDK,活性状态是以磷酸化形式存在的,。,CAK,可诱导,CDK,磷酸化（,Thr,161,），而,p27,通过与,CDK,亚单位的结合,，使,CAK,不能与,CDK,直接发生作用。非活化的,CDK,不能使,Rb,蛋白磷酸化，,使细胞停留在,G1,期，对细胞周期进行负调控。,P27,还可阻止,Rb,蛋白磷酸化,，其过度表达能抑制细胞进入,G1,期。,72,小结,:,细胞周期由一系列瀑布式的,CDKs,激活,所驱动,CDKs,的激活受控于,四大机制,(cyclin,CAK,Weel/CDC25,CKIs),CDKs,激活执行细胞周期的两大生物学功能,:,复制和分裂,73,第三节,细胞周期调控与肿瘤,科学家在研究中逐渐发现，几乎所有,癌基因、抑癌基因,的生物学效应，最终都会聚到,细胞周期,机制上。,许多癌基因、肿瘤抑制基因,直接参与细胞周期的调控,，,或者本身就是细胞周期调控复合体的主要成分,。这些基因变异的结果，导致了细胞周期的失控，直接诱发肿瘤。,74,驱动机制,检查机制,CKI,-,checkpoint,CDK4,6/cyclinD,CDK2/cyclinE,CDK2/cyclinA,CDK1/cyclinB,Cyclin-CDK,+,细胞恶性增殖,驱动力增强,检查机制失灵,肿瘤细胞恶性增殖的机制,75,肿瘤细胞恶性增殖的机制,Cyclin,的过表达,CDK,的增多,CKI,表达不足和突变,检查点功能障碍,细胞增殖过度与肿瘤,G,1,/S,检查点功能障碍（,P,53,突变）,G,2,/M,检查点功能障碍,恶性增殖,76,一、肿瘤细胞周期失控的分子基础,1,细胞周期蛋白异常,G1cyclin,基因突变、重排，使这些,cyclin,异常表达，,从而使细胞通过,G1,期，进入,S,期，细胞即自发增殖，出现转化特征。,许多人类肿瘤中，均发现有,cyclin D1,基因的扩增,。,77,Cyclin D1,（原癌基因,Bcl-1,）过表达原因,:,基因扩增,（,Cyclin D1,过表达的主要机制）,乳腺癌、胃癌、食道癌存在,Cyclin D1,基因扩增过度。,染色体倒位,（,Chromosome inversion,）,Cyclin D1,基因倒位于甲状旁腺启动子控制下,Cyclin D1,蛋白合成 甲状旁腺腺癌,染色体易位,（,Chromosome translocation,),Bcl-1 t(11:14)(q13:q32),易位,Cyclin D1,受,Ig,重链基因增强子影响,Cyclin D1,表达,78,【Cyclin D,过表达致肿瘤机制,】,Cyclin D,过表达,+,生长因子,CDKs,瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变,基因突变,Cyclin D,1,T,286,突变,Cyclin D,1,泛素化受阻,Cyclin D,1,79,B,型肝炎病毒（,hepatitis B virus,HVB,）感染人体后成为导致肝癌的因素之一，有研究发现，,HVB,基因组整合入,cyclinA,基因的一个内含子中，产生异常、过量表达的转录物。,和正常的,cyclinA,相比，它,缺少,N,端的“,destruction box”,，逃脱了对它的降解，大量异常的,cyclinA,刺激细胞增殖。,80,2,CDK,和,CKI,基因的突变,研究中发现肿瘤细胞,CDK,的水平一般较高，,而,CKI,基因常见纯合性缺失突变，,细胞内缺少,CKI,，或,CKI,抑制,CDK,功能的丧失。,CDK,表达异常,主要见于,CDK,4,、,CDK,6,过表达。,CDK,4,+cyclin D,结合,CDK,4,/cyclin D,pRb pRb,磷酸化,细胞增殖过度,E2F G,1,/S,过渡加速,81,细胞增殖异常,CKI,的缺失与突变,肿瘤细胞中常见,CKI,（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。,【p16,InK4,基因失活原因,】,突变或缺失、染色体易位、,p16,InK4,高度甲基化。,【Mechanism】,p16,InK4,基因表达,CDK,4,与,cyclin D,结合,细胞周期处在“易于”被启动状态,易发生细胞癌变,可能,82,【Mechanism】,p53,基因突变,P21,cip1,转录,DNA,受损细胞增殖,P21,含量减少,（,Deficient expression of Kip/Cip,）,P21,cipl,功能,cyclins/CDKs,活性 细胞周期速度,增殖细胞核抗原（,PCNA,）阻滞,DNA,复制,83,3,癌基因和抑癌基因突变,不少癌细胞中发现,Rb,或,P53,基因,发生了突变，使,Rb,失去了阻断,mRNA,转录，,P53,失去了使细胞休止在,G,1,后期的功能，造成细胞周期失控。,84,细胞周期素与原癌基因：,与,G0,G1,期转化有关的原癌基因,有,myc,和,ras,，它们在转化细胞中与,cyclin D,共同作用。,E2F,刺激,c-myc,和,cyclin A,的表达。,E2F,释放可以进一步增加,c-myc,的表达，诱导,cyclin E,和,cyclin A,。,cyclin E,CDK,的激活,则依赖于,ras,和,myc,的共同作用。,c-myc,表达增加,可防止,cyclinE-CDK2,灭活,，允许细胞在,p27,存在的情况下继续增殖。,c-fos,高表达可下调,p27,水平,而使,cylcinE-CDK2,复合物活性增强，促使细胞增殖。,C-myc,与,ras,在细胞内共表达时可使细胞内,p27,消失。,85,Defects of DNA checkpoints&tumor,Normal,Tumor,Tumor,86,二、细胞周期调控与肿瘤的防治策略,抑制,cyclin,或,/,和,CDK,的表达和活性,提高,CKI,的表达和活性,修复有缺陷的细胞周期检查点,87,三、细胞周期与肿瘤的基因治疗,1.,抑制,G1,期,cyclins,的过度表达,G1,期,cyclins,反义核酸（,RNA,干扰,），在体外和裸鼠体内都可抑制肺癌的增殖。,反义,DNA,可以与基因结合而阻止基因的转录，,反义的,RNA,可与,mRNA,结合，而抑制其翻译，都可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。,88,2.,促使肿瘤细胞表达正常的,CKIs,有报道用,正常的,P16,、,P21,、,P27,基因与腺病毒载体重组，将重组的腺病毒导入肿瘤细胞，,重组的腺病毒在肿瘤细胞内表达有功能的,P16,、,P21,和,P27,蛋白，抑制,CDKs,的活性，使肿瘤细胞停止在,G0,G1,，抑制肿瘤细胞增殖。,89,3.,抑制,E2F,的活性,把,对,E2F,有高度亲和性的双链,DNA,片段导入细胞，,该,DNA,能够结合游离状态的,E2F,生成一种复合物，复合物中的,E2F,不再与有关基因的启动子结合，从而阻断这些基因的表达，抑制细胞增生。,90,91,谢谢！,91,