致病岛及其分泌系统_许龙.pdf

生物技术通讯!#$%&(&)#*+)!),-./0123/14 56017 899:文章编号：299;949:2494综述致病岛及其分泌系统许龙，周晓巍，黄培堂军事医学科学院 生物工程研究所，北京299932 摘要 致病岛是指细菌染色体上一段具有典型结构特征的基因簇，主要编码与细菌的毒力及代谢等功能相关的产物。病原菌必须要有一套高效的分泌系统才能将致病因子分泌到细菌表面或转运出细胞，并尽可能进入宿主细胞。现在已经发现了至少?套不同的蛋白分泌系统。本文就致病岛及其分泌系统的相关研究进展作一综述。关键词 致病岛；分泌系统；传递；进化 中图分类号3AB 3?文献标识码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近年来，随着分子生物学研究的不断发展，对致 病 岛（UNFK/LHDGJGFM GE0NDO，或称毒力岛）的研究也越来越深入。致病岛的发现，使人们对病原菌的进化方式有了新的认识，认识到只需一个单一的遗传重组就能使一种非致病菌变成致病菌，也认识到细菌毒力是一个多基因作用的复杂过程。对致病岛的相关探索，为研究新病原菌提供了新思路，也为研制有效的减毒疫苗和药物提供了新途径。2致病岛的定义及特点致病岛是指位于细菌染色体上编码细菌毒力基因比较集中的某些特定区域，通常是相对分子质量比较大的C片段。致病岛首次在人的尿路致病性大肠杆菌中被发现，后来在人类、动植物的病原体中均有发现，而且一种病原性细菌往往具有一个或多个致病岛。致病岛通常携带多个毒力基因，它能编码黏附因子、毒素、透明质酸酶、蛋白分泌系统、铁摄取系统、侵袭因子、信息传导系统、调节系统等，且随着研究的不断深入，可能还会发现更多由致病岛编码的毒力因子。相同的毒力基因岛在不同的宿主菌中，有时所起的作用并不相同。致病岛包含了比较大的染色体区域（29899 YW），仅仅出现在致病株的染色体中，而在非致病株不存在。致病岛两侧一般具有重复序列和插入元件，这些重复序列可能是致病岛在插入宿主基因组时通过重组产生的，一般是噬菌体整合的识别位点，也是可移动遗传因子被切除的酶切识别序列，促成了致病岛容易缺失的不稳定性。致病岛含有潜在的可移动元件，也较容易丢失，丢失频率高于正常突变率。致病岛的丢失最后会导致病原菌基因组变小，从而减少了传代时间，更加有利于与其他微生物的竞争。致病岛的,*含量与宿主菌染色体有明显差异，并且使用的密码子也不同。一般细菌的,*含量为8?39，而病原性细菌的,*含量通常为49:9。致病岛的获得往往伴随着其他基因的丢失，因为基因组的增长并不是无限制的。8致病岛的分泌系统因为大多数致病因子作用于真核宿主细胞，因此必须要有一套高效的分泌系统将这些致病因子分泌到细菌表面或转运出细胞，并尽可能进入宿主细胞。现在已经发现了至少?套不同蛋白分泌系统2_。分泌出的蛋白参与了细胞壁的装配、代谢、防御以及致病作用。在革兰阳性菌中，细胞外和表面蛋白通过一般途径分泌；而对革兰阴性菌而言，外膜的存在导致了其结构多样性的进化，产生了很多功能不同的分泌系统。812!型分泌系统（#2%）#2%的结构比较简单，它由一个位于内膜的C#T转运结合 收稿日期899:9823 作者简介许龙（2;3;），男，博士研究生，（PNG0）Z60/DLa28:1J/P:24蛋白、一个周质蛋白和一个外膜蛋白组成。外膜蛋白具有!个!折叠，并装配成了一个!小桶，形成了外膜上的小孔。#$%转运结合蛋白的功能就是转运特异的作用蛋白。外膜蛋白可以和许多不同的#$%转运结合蛋白结合，形成许多不同结构的$!&。$!&和$&分泌是!#非依赖途径，而$&和$(&型分泌途径则依赖于!#系统。!#基因编码一些分泌途径所需要的&)*蛋白质，必需&)*蛋白质的分泌途径被称为!#依赖的分泌途径。!#依赖型的蛋白质分泌途径的一个特征是在分泌蛋白上存在一个短的主要为疏水氨基端的信号序列。信号序列帮助蛋白质分泌，当分泌蛋白到达周质时会被信号肽酶剪切掉；再通过通道蛋白穿越外膜，使蛋白质分泌至细菌细胞外而发挥作用，所以不需要分泌蛋白的氨基端加工。$!&和$&途径的蛋白质分泌是一个连续的过程，不存在明显的周质中间体。研究发现，$!&分泌的主要是溶血素+,，最具代表性的就是$!&是致尿路病大肠杆菌的溶血素操纵子，它参与了-溶血素的合成、活化和转运。$!&分泌需要种分泌蛋白：一是内膜运输#$%./)，它提供蛋白质分泌的能量；二是通过!#途径分泌的外膜蛋白；三是定位在内膜跨过周质的膜融合蛋白。通过$!&途径分泌的蛋白质不属于蛋白质水解切割，其分泌信号位于分泌蛋白0端12个氨基酸残基。3#型分泌系统（$&）在革兰阴性菌和阳性菌中，很多蛋白由分泌系统转运通过细胞质膜。这些底物蛋白具有4端信号肽。当转运通过细胞质膜后，这个信号肽被信号蛋白酶切除。对于革兰阳性菌来说，这种转运机制已经足够了；但是在革兰阴性菌中，$&就发挥了作用，将这些前体蛋白的周质衍生物转运出外膜。$&由至少!个亚单位组成，外膜上的亚单位低聚形成小孔。然而，编码$&的基因存在于细菌的核心基因组上，而不是致病岛上。但是通过$&转运的很多蛋白对于致病性却很重要，这些蛋白是由致病岛编码的+,。$&是!#系统依赖的分泌途径。如霍乱弧菌表达的几丁质酶、细胞毒素、蛋白酶等毒力因子均通过$&中的一般分泌途径分泌至胞外。3$型分泌系统（$&）$&是!#非依赖途径。分泌信号长期以来被认为位于分泌蛋白氨基端的!562个氨基酸残基。但是，通过分析$&分泌蛋白的氨基端序列，发现没有任何可识别的结构类似性，由此推测分泌信号可能位于编码分泌蛋白的784#59区。$&分泌机制组分和鞭毛生物合成的因子有同源性，有些$&分泌系统在细菌表面组装类似鞭毛的超分子结构，同蛋白质运输到真核细胞有关。$&的装配结构很复杂，需要265个基因参与+(,。尽管它被称为“分泌系统”，但$&的主要功能并非分泌蛋白到细胞外，而是转运蛋白通过第三层膜，例如真核宿主细胞膜。这些效应蛋白转移进入真核宿主细胞后，会产生特性干扰细胞功能，导致宿主细胞被侵入、吞噬细胞失活和胞内运输过程被干扰。$&在非病原性微生物中暂时没有发现。$&分泌的两大特点是：只有在细菌和宿主细胞相互作用后才能被激活；一些细菌分泌系统的分泌蛋白含有4端可切除的信号肽序列，而它缺乏明确的分泌信号，这是它区别于其他分泌系统的一个显著特征。所有的$型蛋白可分成(类，即细菌膜上的装置蛋白（:.*;)7)7:.?*).;A/B;)=?/）；转 位 子 蛋 白（;B*B?BC;)=?/）；被转移的效应蛋白（;B*.;)D)EE)*;B B;)=?/）和$&分子伴侣（;F)$*G.)#/N荧光染料标记其四半胱氨酸，并不改变其功能。将细菌与宿主接触后，观察细菌内荧光成下降趋势，而且在(7=?内有52O的效应物进入了宿主体内+P,。参见图!。&*GA7:)J)#/N法标记效应物许龙等：致病岛及其分泌系统1!5生物技术通讯!#$%&(&)#*+)!),-./0123/14 56017 899:图8实时图像法观测%;=分泌和幽门螺旋杆菌的=摄取?29722。现在研究比较充分的#4%是根瘤土壤杆菌.;A(B4，它可将=C蛋白复合物转移进植物细胞?28。人类病原体如百日咳杆菌、巴尔通体属、嗜肺性军团病杆菌、布鲁氏菌属和幽门螺旋杆菌中也有很多#4%非常重要。幽门螺旋杆菌#4%是由!#致病岛编码的?2D，!#致病岛由#4%和*EF=蛋白组成。近来发现，定植于胃上皮表面的幽门螺杆菌通过其特有的#4%将*EF=蛋白注入宿主细胞内，经位于宿主细胞质膜的G8HAG和!IJ激酶将其*8端谷氨酸C脯氨酸C异亮氨酸C酪氨酸C丙氨酸（K&-=）序列中的酪氨酸磷酸化后与%+K88结合，从而干扰细胞信息传递。81L!型分泌系统（#L%）?2472L最早研究认为，#L%可被看作一种主动运输体（E6M/MAEJHN/AMOA，=#），它与底物蛋白结合成一个前体蛋白，一个端信号序列指导该前体蛋白通过分泌系统进入周质。在信号序列被切割后，运载体的低聚物在外膜上形成一个小桶结构，而被运载蛋白通过这个小桶结构形成的小孔运出细胞外。#L%可结合的蛋白很多，如免疫球蛋白,蛋白酶等。致病岛编码的典型#L%有病原性大肠杆菌的K!=和H*、沙门氏菌的%K&CD和弗氏志贺氏菌的%+&C2。最近还有发现，认为两部分分泌途径（MP/C=的摄取。尽管这个外源=大部分最终会退化，但是还是有一些“有用”的基因被整合进宿主染色体中，并被保留了下来。这种基因的去与留取决于环境的选择压力。D18致病岛和质粒在某种病原菌致病岛上发现的毒力基因往往在其他病原菌的毒性质粒上也存在。比如志贺氏菌中编码#D%的$%&和(基因在毒性质粒上，而在沙门氏菌中则存在于%K&C2上。结合反应可以导致这些细菌间质粒的转移，这些质粒能够在染色体中进行自主复制，在某些特定条件下又整合回染色体。这是一个可逆的过程。因此，这也是细菌间致病岛水平转移的一种方式。D1D转导几乎所有的菌株中都有噬菌体的存在，而噬菌体基因组能图D=#（=）和#K%（(）途径示意图=：%K为信号肽，K为运载物区域，为运载体区域，&Q为内膜，)Q为外膜。该结合物先通过%OG运出内膜，然后区域插入到外膜中，将与区域共价结合的运载物区域转运出外膜到达细胞表面。图中的黑色三角表示转运成功后，蛋白质进行分解。(：#K%为#H=蛋白的#K%区域。当#H=蛋白和#H(蛋白均被%OG转运出内膜后，#H(插入到外膜中。#H(与#H=特异识别，并发生作用，最后被转运出细胞外。在周质内的特异识别作用暂时只是一种推测:2:携带并传递细菌毒力基因。很多致病岛对于噬菌体基因组来说太大而难以携带。例如致病岛上编码!型分泌系统和型分泌系统的基因簇大小为!#$%&，这个大小基本上等同于整个噬菌体的基因组大小。因此在这些情况下，可能存在其他机制。通常噬菌体在宿主菌中进行复制时，它的基因组拷贝装配成新噬菌体的头部，并且宿主()*断裂成碎片。有时候装配噬菌体基因组的酶错误地将宿主()*碎片装配进噬菌体头部，并被携带到了新的宿主菌中发生了整合，就导致了转导作用的发生。$致病岛的进化点突变、基因组重排、基因水平转移是微生物进化的几种方式。点突变的方式过于缓慢，基因组大片段的获得与失去则大大加快了新的变异菌株产生的速度。在这种进化过程中，噬菌体、质粒、转座子和致病岛是基因水平转移的各种不同形式。研究发现，致病岛常具有质粒和噬菌体这两种遗传物质的特征，反映了这两种染色体外遗传物质共整合体形成的可能，这个过程常可在链霉素菌中被观察到。对所获得的新基因进行遗传加工也是非常重要的，一般包括稳定所获得的基因以及最佳表达该基因。在有些菌株中，为了稳定所获得的基因，往往会通过高突变率在可移动基因中引入终止密码，使得新变异株成为特定环境下的优势种群。致病岛携带的特异基因也只有参与了新病原菌的代谢和调控，才能得到合适的表达。有些特定种类中并没有致病岛，原因还不太清楚，但是通过对比它们的生活方式，可以得到某些提示。某些缺乏致病岛的病原菌群对于特定宿主环境显示出了很强的适应性，在宿主体外的时候也会伴有基因组的缩减和复制能力的丧失，如链球菌。这种现象应该归功于链球菌群内的高度快速重组。有人推测，尽管水平基因转移在链球菌内也起了相当重要的角色，但是快速重组使得很难对水平获得的()*进行鉴定。菌群内的高度重组形成了镶嵌染色体和镶嵌基因结构，这种快速的基因重排也使得经典的致病岛很难形成+,-.。相反，大多数含有致病岛的病原体能够很灵活地利用不同的宿主进行增殖；另外，含有致病岛的病原体通常可以在自然环境中生存，这都暗示着致病岛扩展了病原体的生存范围。岛中代谢功能基因的获得与保留，也使得病原体能在新环境中生存。致病岛研究的前景及意义以上对致病岛及其分泌系统做了简单的介绍，我们也注意到致病岛的数量还在源源不断地增加。虽然在结构上可认为致病岛是外源的，但目前尚未发现其染色体外的存在形式，而且某种细菌特异的致病岛也可在其他一些细菌中存在。因此，对于细菌的致病岛究竟来源于何处、以什么为载体，在不同细菌间水平转移的机制等一系列的问题，仍有待于进一步的研究。目前研究致病岛的方法较多，用于鉴定未知毒力基因的方法主要有代表性差异分析、/0)*功能分析、比较基因组作图、接合介导的()*插入取代标记法、笔迹标识法等。另外，利用抑制消减杂交（12334511678 1294:;9646?6:9678，AAB）技术可以研究细菌病原体的致病株和非致病株或弱致病株之间的基因序列差异，它克服了差异显示法的假阳性率高和代表性差异分析法消减杂交轮次较多的缺点。C:8&5+,D.等用AAB技术检测致病性大肠杆菌菌株EF和非致病株GH,!株IJ,F之间的差异表达基因，发现有!个毒力株EF特异性差异表达基因，其中个与已知毒力决定簇具有同源性，可能代表部分毒力岛基因。05;&156?K54+,L.等用AAB技术检测类鼻疽伯克氏菌毒力株和无毒株之间的差异表达基因，结果发现了编码荚膜多糖的糖基转移酶基因；当糖基转移酶基因被失活以后，在动物模型中类鼻疽伯克氏菌和泰国伯克霍尔德氏菌的M(%值相似，说明此糖基转移酶基因和荚膜的产生对细菌毒力很重要。细菌种类繁多，基因组成也很复杂。值得注意的是，基因组方法并不适合区分水平获得的毒力基因与其他功能的基因，因此需要进一步的实验分析来确定这些元件对毒力的影响。也有利用基因的功能和体内表达来鉴定毒力基因的报道，但这些方法并不能确定该基因究竟是位于致病岛上还是病原体本身的染色体上。因此，有关致病岛的研究还有很多工作要做。参考文献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a5;9678 6897=719;5KK1+C.Q!%O,%!VEWX,!$D+L.S=461965 CQN35 15;459678X 68954;5KK2K:4 94:8154 7/:;47/7K5;2K51 1195/1:8;5194:KK 45K:95?97;78a2P:9678/:;=6851+C.Q I7K I6;4767KO!%,O$%V!WX!L$+,%.B:/6K978 BMO(7/68P25)IO A;=R:49 GCO!#$%0!-11!/-#2()(/,(!#!15;45951;=47/717/:K()*6:8735 15;459678 1195/+C.QI7K I6;4767KO!%OVFWX,-%$+,.B7452954(O T?584569 AO B:1 0Q):924:K 94:8174/:9678;7/35958;5 68 3!4$-5(6#5!/+*$(/-61/5?6:95?9=5:16;7/3785891 7:935 15;4596781195/+C.Q I7K I6;4767KO!%,O$,V!WXE-L+,!.S=461965 CQ N35 15;459678X 9=5 72/(6#5!/-.Y64Ub($:8?45K:95?;78a2P:9678 1195/1+C.Q U67;=6/U673=1*;9:O!%$O,FL$V,HEWX!,L+,E.S58?478 MO A5?5K*O*8P5K686*O!#$%S419:K 1942;9245 7 S:PcO:347956847/9=5 3!$-5(6#5!/+*$(/-3:9=7P586;69 61K:8?9=:9 58;7?51 74:935 15;459678 1195/+C.Q C I7K U67KO!%$OE$%V$WXDD,+,$.B58?54178 0O):9:47 CO G:354 CUO!#$%058:/68P 3479568 15;459678 68 9=5J4:/H85P:965:;9546:+C.Q N458?1 I6;4767KO!%ODVDWXE!+,.B58?54178 0O S:335KK7 0O):9:47 CQ*29794:81374954 34795681O 51+C.Q U67;=6/U673=1*;9:O!%$O,FL$V,HEWX!E+,-.B:&585;&0O U:K/5KK5)O e554 UO!#$%I71:6;P5851:8?/71:6;=47/717/51X 6894:H:8?68954135;651 P587/6;:46:9678 7&/!+(5(55.1+)!.(4)-#!+C.Q 85;9/28O!%,OFLV$WX!$-+,D.C:8&5 UO(7468?9 fO B:;&54 CO!#$%*1294:;9646?61:9678:8:K161 7P587/6;?65458;51 59R558 9=5 2473:9=7P586;8%5($-194:68 EF:8?9=5 8%5($-GH,!194:68 IJ,F+C.Q d5/1 I6;4767K M599O!%,O,LLV,WXF,+,L.05;&156?K54 AMO(5A=:54(O A7&7K*O!#$%(595;9678 7:;9546:K 1294:;9646?6:9678X6?58966;:9678 7;:312K:4 37K1:;=:46?5 7 9./:,($;!/-#+1!.;(#$!-:1:/:a74 642K58;5?5954/68:89+C.Q 85;9/28O!%,OFLV,WXE$许龙等：致病岛及其分泌系统F,-