副猪嗜血杆菌的分离与鉴定.doc

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
李晓华 *杨小燕 郑新添 戴爱玲 李改娜
（福建龙岩学院生命科学学院
预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室
福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心
福建龙岩 364000）
摘要：从福建省龙岩市l例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的患病猪的关节液中分离到1株革兰氏染色阴性可疑菌株，经卫星现象、生化鉴定等实验室诊断，进一步以副猪嗜血杆菌的16 S rRNA基因设计特异性引物进行PCR鉴定，确定该分离菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明，分离株对环丙沙星、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星有抵抗力。

关键词：副嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验
Isolation and Identification of Haemophilus parasuis
Xiaohua-Li xiaoyan-Yang xintian-Zheng ailing-Dai gaina-Li
1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan, Fujian Province 364000, PR China
2. Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology, Longyan University, Longyan, Fujian Province 364000, PR China
3. Engineering Research Center for the Prevention and Control of Zoonosis，Fujian Province 364000, PR China
Abstract：A covey of swine whose clinical symptoms looked like Haemophilus parasuis disease were checked by lab technologies．Research as bacteria observation，cultural characteristics and biochemical properties of Haemophilus parasuis were done．According to the sequence of bacterium l6S rRNA，special primers were designed for PCR amplification. The results showed that the strain was tentatively identified as Haemophilus parasuis．The drug sensitive tests showed：the strain was sensitive to 环丙沙星、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星．
Key words：Haemophilus parasuis；isolation and identification; drug sensitive test

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李晓华(1968、8—) ,女,福建长汀人，高级实验师，主要从事实验室管理及动物疫病防控研究。
基金项目：福建省科技厅创新平台建设项目（FJ200812）
福建省科技计划项目（2008N2005） *通讯作者

6

猪副嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis，Hps)又称“革拉瑟氏病”(Gllisser’s Disease)，是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的一种以多发性浆膜炎和关节炎为特征的疾病[1]。该菌寄生在健康猪鼻腔等上呼吸道内，主要通过空气直接接触传播，其他传播途径如消化道等亦可传播[2]。主要影响2～4周龄的猪，感染高峰为4～6周龄的猪[3]，发病率在10%～15%，严重时病死率可达50%。随着规模化养殖和养殖密度的增加，近年来，该病的发病率和死亡率均呈上升趋势，成为危害规模化养猪场最严重的细菌性疾病之一，给养猪业造成巨大的经济损失。2008年10月，福建龙岩某规模化猪场5—8周龄的保育猪发病严重,临床症状主要表现为精神沉郁、食欲减少，体温升高40-41℃,流鼻涕,腹式呼吸,被毛粗乱，消瘦、关节肿大，病猪不愿站立，跛行，病程达4个多月，发病率40%。剖检病变主要表现为体内有水肿、充血、血液不凝,呈暗红色,全身脏器多数有出血斑点,膀胱粘膜和肾皮质点状出血,喉、会咽斑状出血,胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物;心包有大量纤维素性渗出物，似菜花状；肺脏呈纤维素性胸膜肺炎,腹腔内有大量透明黄褐色渗出液；关节腔内充满黄色浑浊液。怀疑猪副嗜血杆菌感染而致，随机采集病料进行病原分离鉴定及药敏试验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
采自福建省龙岩市某猪场疑似Hps发病仔猪的肺脏、心血、关节积液、心包液、气管。
1.1.2 培养基
普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基由实验室配制、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基购于青岛海博公司；0.005%NAD巧克力琼脂培养基、SS培养基、麦康凯培养基购于北京陆桥技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购于成都贝斯特试剂有限公司
1.1.3 生化微量鉴定管
H2S、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、柠檬酸盐均购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.4 药敏试纸：强力霉素、阿莫西林、磺胺-6-甲氧嘧啶、环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋钠、阿米卡星、恩诺沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、氟苯尼考、复方治菌磺、 林可大观、磺胺间甲氧嘧啶、泰妙菌素、泰乐菌素等药敏纸片由实验室自制。
1.1.5 PCR反应试剂：如Taq DNA聚合酶 (5IU/μL)、蛋白酶K、dNTPs，均由宝生物(大连)有限公司提供，-20℃保存。
1.1.6 引物设计与合成
参照Simone Oliveira等[9]的报道合成引物：上游引物P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′,下游引物P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，预扩增片段大小为821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2．1细菌的分离培养 无菌取送检的疑似患病猪的肺脏、心血、心包液、气管和关节积液，划线接种于巧克力培养基和5%新生牛血清TSA培养基,置于37℃恒温培养箱中，烛缸培养24-48h，观察结果。
1.2.2 细菌形态及生化特性检查
1.2.2.1细菌形态学检查 挑取TSA平板上生长的疑似菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察细菌的形态特征。
1．2.2.2细菌培养特性 挑取TSA平板上生长的单菌落，分别接种于含0.005%NAD的兔鲜血琼脂培养基平板、5%新生牛血清TSA培养基平板、鲜血琼脂培养基平板、巧克力琼脂培养基平板、麦康凯培养基和普通培养基平板中，置于37℃恒温培养箱中，烛缸培养24-48h。观察细菌的生长情况。
1.2.3卫星试验 在两个不含V因子的兔鲜血琼脂平板上接种可疑菌株，一个平行划线接种两行金黄色葡萄球菌，另一个作对照。在培养箱中37℃烛缸培养48 h，观察结果。
1.2.4生化鉴定 将分离所得可疑菌株的纯培养物分别接种于H2S、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、柠檬酸盐微量生化鉴定管中，每支生化管中同时加入1μL牛血清和1μLNAD的（V因子）置于37℃恒温培养箱，烛缸培养24-48h,观察结果。
接触酶试验：挑取单菌落在一洁净的玻片上，滴加30%的过氧化氢，30s内观察反应结果。
1.2.5 PCR检测
1.2.5.1 细菌DNA的提取
挑取单菌落进行亚克隆培养，用灭菌的双蒸水小心刮洗菌苔,置于1.5mL离心管中。12000rpm离心30s,弃上清，保留细胞沉淀；加入567μLTE悬浮沉淀，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提,，使两相完全混合，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟，吸取上清液，等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提1次，至溶液中有絮状的DNA沉淀出现；将DNA沉淀转移到1mL70%乙醇中洗涤，65℃干燥箱中干燥2分钟。用50-100μLTE缓冲液(含20μg/mLRNase)溶解DNA沉淀，即为试验所需模板，4℃保存备用。
1．2.5.2 PCR鉴定
以上述方法提取得到的菌株DNA为模板,将P1、P2等比例混合，PCR反应体系为50μL:10×Taq Buffer5μL, 10μmol/LdNTP2μL,Template2μL,5U/μLTaqDNA聚合酶1μL, H2O36μL，上、下游引物(浓度均为10 μmol／L)各1μ L，反应条件为94℃ 5min；94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 1min,30个循环;72℃ 7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。
1.2.6药敏试验
无菌棉签蘸取分离菌的菌悬液,涂布接种于含NAD及新生犊牛血清的TSA平板上,然后把做好的药物纸片用无菌镊子分别平贴于培养基表面,于37℃CO2培养箱中培养24h,测量抑菌环直径并判定结果。判断标准为：抑菌圈直径小于15 mm的为不敏感，15～20 mm的为中度敏感，20 mm以上的为高度敏感。
2 结果
2.1细菌的分离培养
取关节液划线接种的巧克力培养基上出现无色、透明的小菌落,接种于普通培养基不生长。接种于TSA平板，可见有针尖大小、圆形、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的小菌落生长。
2.2细菌的形态学检查
取分离所得可疑菌落涂片，革兰氏染色后在光学显微镜下见到革兰氏阴性的短杆状或球杆状小杆菌，以纤细杆状居多。
2.3培养特性
该菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基中均未见生长，在鲜血琼脂平板、巧克力平板上生长不好，在TSA平板、NAD鲜血琼脂平板上生长良好。
表1 细菌培养特性
Table 1.The Cultural Characteristics of the isolatied strains
培养基 生长情况 菌落形态
普通培养基 -
麦康凯培养基 -
SS培养基 -
鲜血琼脂培养基 + 极少数无色透明、边缘光滑、湿润的针尖状大小菌落，传代后几乎不生长
巧克力琼脂培养基 ++ 无色透明、边缘光滑、湿润、针尖状大小的菌落，传代后几乎不生长
0.005%NAD的鲜血琼脂培养基 +++ 无色透明、边缘光滑、湿润的菌落，菌落呈针尖状大小，边缘整齐
含5%新生牛血清和0.005%NAD TSA培养基 ++++ 无色透明、边缘光滑、湿润的菌落，菌落呈针尖状大小，边缘整齐，大量的菌落连成一片
注：“++++”生长良好；“+++”生长一般；“++”生长但生长较差；“+”生长但极难生长； “-”不长。
2.4卫星现象
试验观察结果可见，越接近葡萄球菌所形成的菌株，菌落越大、越多，离葡萄球菌愈远，菌落越小、越少，甚至不生长，呈现出明显的“卫星现象”。
2.5生化鉴定结果
分离株生化鉴定结果见表2。
表2：分离菌生化鉴定结果
Table 2.The biochemistries identification of isolatied strains
项目
Item
H2S
蔗糖
Saccharose
麦芽糖
Maltobiose
乳糖
lactose
半乳糖
Galactose
山梨醇
Sorbitolum
甘露醇
Manciol
尿素酶
urase
接触酶
Catalase
结果
Result
-
+
+
-
-
-
-
+
+

项目
Item
赖氨酸
lysine
鸟氨酸
ornithine
苯丙氨酸
L-Phenylalanine
葡萄糖
Dextros
D-核糖
Ribose
葡萄糖酸盐
gluconate
柠檬酸盐
citrate
结果
Result
-
-
-
+
-
-
-
注:“- ”阴性;“+ ”阳性。
Note:" + "positive ," - " negative.
2.6 PCR反应结果
以提取的总DNA产物作为模板,用PCR方法扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察，发现被检菌株有约821bp的特异性条带，其大小与预期的扩增片段大小相符。如图2:

图2：PCR检测结果
M：DNA 标准 DL 2000；1:分离株PCR产物；2：阴性对照
Figure 2.Results of PCR identification
M: DNA Marker DL 2000; 1: Results of PCR amplification ;
2.7分离菌药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、头孢噻呋钠、氨苄西林、庆大霉素高敏，对泰乐菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏，对林可大观、泰妙菌素、诺氟沙星 磺胺间甲氧嘧啶低敏，见表3。
表3:分离菌药敏试验结果
药物 抑菌圈直径/mm
Drugs Diameter
环丙沙星Ciprolfloxacin 32
卡那霉素 Kanamycin 30
强力霉素 Doxycycline 26
头孢噻呋钠Ceftiofur Sodium 24
氨苄西AmpicillinSuppositories 23
庆大霉素Gentamicin 22
阿米卡星 Amikacin 20
泰乐菌素 Tylosin 18
磺胺-6-甲氧嘧啶Sulfamonmethoxine 17
林可大观Spectinomycin Hydrochloride 14
泰妙菌素 Tiamulin 12
诺氟沙星 Norfloxacin 10
磺胺间甲氧嘧啶Sulfamonomethoxine 6
注：抑菌直径d≥20mm为高度敏感;15mm≤d<20mm为中度高敏; d<15mm为不敏感。
3 讨论与小结
3.1 根据分离菌的菌落形态特征、镜检结果、生化特性及卫星现象结果，初步鉴定为副猪嗜血杆菌，以HPS的16SrRNA中的基因序列设计合成引物，进行PCR扩增，成功扩增出长约821bp的16sRNA基因片段,说明分离菌株为HPS。该菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基中均未见生长，在鲜血琼脂平板、巧克力平板上生长不好，在TSA平板、NAD鲜血琼脂平板上生长良好。说明5%新生牛血清TSA培养基是HPS的理想培养基。
3.2 该菌的药敏结果显示，对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、头孢噻呋钠、氨苄西林、庆大霉素高敏，对泰乐菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏，对林可大观、泰妙菌素、诺氟沙星 磺胺间甲氧嘧啶低敏，与高鹏程、吕素芳等的研究结果基本相同。
3.3 本研究根据Hps的l6 S rRNA序列设计引物进行PCR扩增，通过热裂解法和CTABA裂解法对PCR扩增条件进行优化，成功扩增出了821bp片段，所建立的PCR检测方法不仅可从分离培养物中对Hps进行鉴定，而且可以直接对病料进行PCR检测，在临床诊断中具有实用性。
3.4 近年来，副猪嗜血杆菌病已成为影响世界养猪业的典型细菌性疾病，危害日益严重，已经在全球范围影响着养猪业的发展，成为断奶前后仔猪和保育猪头号杀手，死亡率高达50％一9％，给养猪业带来的危害与经济损失已不容忽视。国内在北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北、江苏、上海、安徽、广西、浙江、江西、山东、福建等省市都均有发生，损失惨重【6】。本研究借助传统方法和特异性高的PCR方法鉴定副猪嗜血杆菌病，为深入研究猪HPS感染的快速诊断及有效防治提供了实验依据。
3.5 由于猪副嗜血杆菌对抗生素的耐药性问题，目前大多采用疫苗对猪副嗜血杆菌病进行防制，然而，猪副嗜血杆菌的血清型较多，且不同血清型之间无交叉保护力，若不知当地流行的血清型而随便应用商品化疫苗，猪副嗜血杆菌病就不能得到有效控制。目前已知的副猪嗜血杆菌至少可分为15 种血清型，还有20%以上的分离株无法定型【9-10】。而且HPS 具有明显的地方性特征，不同地区流行的血清型有可能不同，因此，对闽西地区猪副嗜血杆菌进行分型鉴定，可为该地区猪副嗜血杆菌病的防制提供科学依据，具有重要的理论指导意义。

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