细胞芯片捕获恶性胸水中癌细胞的临床应用价值.pdf

9 4 南昌大学学报(医学 版)2 0 1 0年第 5 O卷第 1 2期J o u r n a l o f Na n c h a n g Un i v e r s i w(Me d i c a l S c i e n c e)2 O 1 0，Vo 1 5 0 No 1 2 细胞 芯片捕获 恶性胸水 中癌 细胞 的临床应 用价值 刘 翼军，王春福(江西 省胸科 医院 a 病 理科；b 肿 瘤科，南昌 3 3 0 0 0 6)摘要：目的 探讨抗体细胞芯片自动捕扶恶性胸水中癌细胞的临床应用价值。方法 应用抗体细胞芯片技术对 良、恶性胸水(各 4 o例)进行免疫杂交。结果 8 O例胸水 细胞芯 片 阳性免 疫杂 交点细胞 形 分布，细胞 形态完 整，结构清晰，杂交点以外无 非特 异性 结合 细胞。其中 4 O例恶性胸 水 阳性 杂交点 为：j：皮特 异性抗原 3 7例、广谱 C K3 9例、C D 4 4 V6 3 6例、C D 6 8 2 8例；另 4 0例 良 ：朐水细胞杂交点：C D 4 4 V6 5例 见少 量淋 巴细胞。另 6种 C D系 列抗体 免疫杂 交点 仅捕 获癌 性胸水 和 良性胸水 中的淋 巴细胞、多核 巨细 胞，未 见捕 获癌细胞。结论 细 胞芯片 捕 获技 术对胸水 中恶性肿瘤 细胞 的诊断与鉴别诊 断具 有重要 的临床应用 价值。关键 词：细胞芯片；捕获；免疫杂交；癌细胞；胸水 中 图分类 号：R 3 9 2 1 文 献标 志码：A 文章 编号：1 0 0 0 2 2 9 4(2 0 1 0)1 2 0 0 9 4 0 3 细胞 芯片 是 在 C D NA 微 阵 列 基 础 二 发 明 的一 种特 殊牛 物芯 片，具有 体 积小、信息量 大、高通 量、自 动识 别及 町比性 强 的优点；能高 效、快速 和低 消耗 的 进行 细胞 及组 织学 的各 种 研 究 与观 察。肿 瘤 标 志物 是对 肿瘤进 行 诊断、分 级、预 后、检 测 治疗 反 应 所必 需 的，对肿 瘤 细 胞 的诊 断尤 为 重 要。本研 究 采 用细 胞 卷片技术 制作 8 O例 胸水 细胞 芯片，同时采用 抗体 与细胞 抗原 特 异性 结 合 的方 法，通 过 自动捕 获 将所 获得 的细 胞 旧定在 特定 区域，对 胸 水 中肿 瘤 细 胞进 行诊 断和 鉴别 诊断。l 材料与方法 1 1标本 来 源 收集 2 0 0 6年 月至 2 0 1 0年 6月江 西省胸 科 医 院 门诊及住 院患者 8 O例，均经 支气 管镜 病理组 织 活 检、细胞 学 涂片 证实。其 中男 5 5例，女 2 5例，年 龄 2 6 7 8岁。良、恶 性胸水 各 4 O例。】2主 要试 剂 上皮特异性抗原(E S A)、广谱 C K、C I)4 4 V6、T 细胞(C I)3、C D 4 5 R O)、B细 胞(C D 2 0、C D7 9 o c)、霍 奇 金细胞(C DI 5、C D 3 0)、巨 噬 细胞(C D 6 8)，均 为单 克 隆抗 体，由福州迈 新生 物技 术有 限公 司提 供。1 3细胞 芯 片的制 作 1 3 1 细 胞j 巷片 的设 H 抗体微阵列(每一抗体 4个位点)。细胞芯片 模 块 制备：将 溶 化石蜡 倒入 大号 不锈 钢底模 中，制作 收 稿 日期：2 0 1 0 一l 0 2 7 基金项 目：汀 省卫q 三 厅科 技计 划(0 5】1 7 3)3 5 e m2 5 c m0 8 c m 大 小 的空 白蜡 块，待石 蜡 稍 微冷 却，设 计 8 5细胞 芯 片 微 阵 列，用 打孔 机 将 受 体蜡 块进 行 打孑 L，每 孔 直 径 约 2 mm。将 蜡 块 冷 冻 后，进行 切片，每片 1 0 n-i，裱 于玻片 上。制 成 微 阵 列 玻 片。点样：每 种抗体 与 p H 1 0 2的 Tr i s HC 1 缓 冲液等体积稀释。抗体芯片按上述 1 0种抗体，每 4孑 L 1 种 抗体依 次 排列进 行 点样，将 1 0种 抗体 分 别 点 在各 自的 区域 内，形 成 8 5微阵列。点样后 将 芷：片玻 片置于 湿盒 中，4冰箱 水化、过夜。1 3 2 封 闭 用 2 5 酪 蛋 白 P B S溶 液室 温下 封闭 芯片 1 h，封 闭抗 体外 的非 特异 性结 合 区，P B S冲洗 2次。1 3 3 杂 交 取 E D TA K 冲洗标 本细 胞 3次，每次 3 mi n，使 细胞膜 抗原 充分 暴 露，调 整 细 胞 浓 度 为 l O。I 、制 成 细胞 悬液，将 细胞 悬 液直 接 滴 在芯 片 上孵 育 1 h，使 细胞 与特 异性抗 体 充分结 合，P B S冲洗 3次，每次 3 mi n。1 0 9 6 甲醛 固定细 胞 3 0 mi n。1 3 4 染 色 芯 片 巴 氏染 色。主要 染 色 步 骤：将 苏 木 精 染 液 滴在 芯片 上，孵 育 l()2 0 mi n，P S B 冲洗 3次，每 次 3 mi n；用 0 5 的盐酸去掉胞浆中多余的苏木 精 染液，数 秒 钟后 P B S冲洗 3次，每 次 3 mi n；置 稀 碳 酸 锂 溶 液 中 碱 化 1 mi n，P B S冲洗 3次，每 次 3 mi n；用 9 5 乙醇 脱 水 2 rai n；用 橘 黄 G 染 液 1 3 mi n；9 5 乙醇 洗涤 2次，各 1 O 2 O s；在 刘翼军等：细胞芯片捕获恶性胸水 中癌细胞的临床应用价值 9 5 E A3 6染液 中染 色 2 3 mi n，至胞浆 着 色 为止；用 9 5 乙醇洗 涤 2 3次，去 除过 多 的 染 液，再 置 无水 酒精 中脱水，然 后置 二 甲苯 中洗涤 2次。用 中性 树 胶 封 固。2 结 果 2 1 杂交 图像 应 用光 学显微 镜 4 0、1 0 0、2 0 0、4 0 0等 倍 数 进 行 逐 级观察，阳性 杂 交 点 细胞 呈 圆形 分 布，界 限 清楚。细胞 形态 保存 良好，杂 交点 以外 未 见 待 异 性 结 合 细胞，见 图 1 2。图 1 胸水免疫杂交阳性细胞(光学显微镜，4 0 0)图 2胸 水 免疫 杂 趸 I 性 细 胞(光 学 显 微锐，2 0 0)2 2 杂 交结 果 4 0例肺 癌胸 水经 过细胞 芯 片 杂 交，阳性 杂 交点 分别 为：C D 4 4 V6 3 6例、E S A3 7例、广 谱 C K 3 9例；4 0例 良 性 胸 水 细 胞 经 过 细 胞 芯 片 杂 交，5例 在 C D 4 4 V6上 捕 获 淋 巴 细 胞，C D3、C D4 5 R O、C D2 0、C D 7 9 、C D1 5、C D3 0、C D6 8抗 体 负疫 杂 交 点分 别 捕 获癌性 胸水 和 良性胸水 中的淋 巴细胞、多核 巨 细胞，未 见捕 获癌 细胞，此 结果 与 病 理 学及 常规 细 胞 学结 果基 本 相符。见 表 1。表 1 8 O例胸水细胞芯片的杂交结果 无 此 项。3 讨 论 胸腔 积液是 由多 种 原 因 引起 的异 常，其 细 胞学 评价 主要 是用 于确 定 有 无恶 性 肿 瘤，很 多 肺 癌 患 者 最初 表现 为恶性 渗 出液，除原发 肿瘤 引起 外，转 移癌 累犯浆 膜，也是 引起 积液 的常见 原 因。据 文献 报道，原发性 肺癌 占恶 性胸膜 渗 出液 的 4 0 9 6 或 更 多，且 大 多数 为腺癌；转 移 性 恶 性 肿 瘤 占胸 水 中 的 4 5 、心 包 积液 中的 7 、腹 水 中的 3 5 E I D 6 4 6 5；以上 皮 性 恶 性 肿瘤 累犯浆 膜最 常见，在 非 上 皮 细胞 性恶 性 肿 瘤 中，淋巴瘤 白细胞最为常见。因此，了解胸腔积液 的渗 出机制及 其 良、恶性 质，是临 床上 亟待解 决 的课 题 之一。正常生理条件下，毛细血管的流体静压和血浆 中的胶 体渗透 压维 持平 衡，便 于脏 层 吸收液 体，一旦 控 制液 体通 过浆膜 移 动 的稳 定 力被 打 破，便 会 发 生 渗 出，引起 平衡 失 调。导致 渗 出 的机 制 _ 6。包 括：系统性 因素。流 体 静压 升 高一 充 血性 心 衰；胶 体渗 透压 减低 肾病 综合 征。局部 原 因。毛 细 血管 通透 性升 高 感 染、炎 症；淋 巴引流减 少 一 肿瘤。胸 腔 负 压 升 高 支 气 管 阻 塞、肺 不 张。外 伤。随着破 译 生 命 密 码 的人 类 基 因 组计 划 进 入 尾 声，一 个 以蛋 白质和 肿 瘤 标 志物 为 研 究 重点 的后 基 因组时代已经拉开序幕；肿瘤标志物是对肿瘤进行 诊 断、分期、预后、监测 治疗 反应 所必 需 的，对肿瘤 细 胞的诊断尤其重 要，根据抗原、抗体 的免疫 反应原 理，应 用肿瘤 标 志物 对 细 胞 内抗 原 或 抗 体 物质 定 性 或 定位，从 而识别 细胞 的性 质。细胞 芯片(细胞微 阵 列)是指将数个、数十个、数百个及数千个抗体整齐，警 蠢 一 嗨 9 6 南昌大学学报(医学版)2 0 1 0年 1 2月，第 5 O卷第 1 2期 地 排列 在一 个 普 通 的 载玻 片 上而 制 成 的抗 体 微 阵 列 _ 2。细胞 芯 片的特 点是：高 通量。将 原来 需要 分别 进 行 多 次 的 免 疫 细 胞 化 学 程 序，在 1个 仅 占 2 0 C 1 T I 1 6 c m 大小 的玻 片 上集 为 一 体，1次 实验 就 可得 到所 有结 果；同 时每 一 抗 体 在不 同 的区域 设 计 多个 点，相 当于在相 同条 件下进 行 多次 同一实 验，成 功率较大，结果可靠。体积小，信息量大。根据不 同的需求，可进 行 大 量抗 体 组 合。具 有 自动识 别 能力，微 阵列 中特定 区域 的 抗 体对 过 往 的瘤 细胞 具 有 自动识 别能 力，自动捕 获效应 细胞。可 比性 强。在 1 张 载玻 片上 同时 观察 多个 结 果，自然 形 成 阳性 对 照，易 于 比较；并且 每 一结果 都处 在相 同实验 条件 下，误差 小。费用 低，应 用 范 围广 泛。实验 用 每 1 种抗体 1次只需 0 1肚 I ，辅助试剂及耗材也明显减 少。操 作简 单。无 需 大 型及 特 殊 设备，且实 验 结 果直 观，细胞形 态 特点 不 变，容 易 接 受，还 可在 此 基 础上 对细 胞进 行更 深 入 的研 究，如 免 疫 细胞 化 学 标 记、DNA倍体分析及染色体上的原位杂交M J。所 需标 本量少。以往 的免 疫 细 胞 化学 实 验，标 记 1个 抗体 需 1张涂 片，完 成一项 诊断 需要 大量 的标本，而 细胞 芯 片解决 了这一 难点。日本 的()o d e K 等 研 制 的细胞 芯片 是 在 1个 面积 为 3 0 mi D _ 1 6 mm 的 玻 片上，预制 出 5 0个 直 径 为 2 I l l r n的 凹洞，每 个 凹 洞中放置 1 0 0 0以内的细胞，然后进行 DNA的倍体 分析及染色体上的原位杂交。美 国剑桥大学 Z i a u d d i n J 等 发 明 的 细胞 片，是 将 1 9 2个 c D NA 包 被在 1张玻 片上，然后 放在 细胞 培养皿 中，细胞生 长、他他 弛 j 也 一 9 0 0 ，c 时与玻 片上 的 c D NA 反应，摄入 c DNA，然后 表现 出 不 同的现象，有的基因可以使细胞死亡，有的基因使 细胞 黏在一 起，可 以鉴 别每 种基 因 的功能，因此节 约 了人力、物力 和财 力。本 课题 设计 的新 型 细 胞 芯 片，利 用 细胞 膜 表 面 不同的抗原物质，与结合在玻片上的不同抗体发生 特 异性 结合，通过 自动 捕获 细胞 固定在 特定 区域，以 此 对恶 性胸 水 中癌 细胞 进行 诊断和鉴别 诊 断。结 果 显 示，癌 性胸 水上 皮源 性抗原 抗体 杂交 点增 强，良性 胸水淋巴细胞抗原抗体杂交点增强，提示采用细胞 芯片捕 获恶 性胸 水 中癌细胞 的方 法具 有重要 的临床 应 用价 值。参考文献：1 S u d h a R K 细胞病理学鉴 别诊 断彩色 图谱：脱落 和穿刺 细胞 病理学E M 张惠英，译 天 津：天津科技 翻译 出版公 司，2 0 0 0：6 3 6 8 E 2 Ma c B e a t h G，S c h r e i b e r S 1 P r i n t i n g p r o t e i n s a s mi c r o a r r a y s f 6 r h i g h-t h r o u g h p u t f u n c t i o n d e t e r mi n a t i o n J S c i e n c e，2 0 0 0，2 8 9 (5 4 8 5)：】7 6 0 1 7 6 3 E 3 S t i l h n a n B A，To n k i n s o n J I F AS T s l i d e s：a n o v e l s u r f a c e f o r mi c r o a r r a y s J B i o t e e h n i q u e s，2 0 0 0，2 9(3)：6 3 0 6 3 5 4 ()o d e K，F u r u y a T，Ha r a d a K，e t a 1 Th e d e v e l o p me n t o f a c e l l a r r a y a n d i t s c o mbi n a t i o n wit h l a s e 卜s c a n ni n g c y t o me t r y a l l o ws a h i g h t h r o u g h p u t a n a l y s i s o f n u c l e a r DNA c o n t e n t E J Am J P a t h o l，2 0 0 0，1 5 7(3)：7 2 3-72 8 5 Z i a u d d i n J，S a b a t i n i D M Mi c r o a r r a y s o f c e l l s e x p r e s s i n g d e f in e d c I)NAs J Na t u r e，2 0 0 1，4 1 1(6 8 3 3)：1 0 7 1 1 0 (责任 编辑：罗芳)(上 接 第 8 8页)参考文献：1 上 海市 白血病协作 组 急性 白血病 患者 P g P、md r l、MR P和 TO P Oli 表达及其 与预后 关系 的研究 J 中华 血液 学杂 志，2 0 0 1，2 2(2)：6 8 7 l _ 2 张之南，沈悌 血 液病诊断及疗效标准 M 3版 北京：科 学出 版社，2 0 0 7：1 0 6 1 1 2 3 F i e d l e r W，Gr a e v e n U，E r g u n S，e t a 1 Va s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o wt h f a c t o r，a p o s s i b l e p a r a c r i n e g r o wt h f a c t o r i n h u ma n a c u t e my e l o i d l e u k e mi a J B l o o d，1 9 9 7，8 9(6)：1 8 7 0 4 李 晓明，韩建群 VE GF和 MD R1 在急性髓 系自血瘸中的表达 及其与 预后 关 系研 究 J 现 代 肿瘤 医学，2 0 0 6，1 4(2)：2 1 5 2 1 7 5 D Ama t o R J，L o u g h n a n M S，F l y n n E，e t a 1 Th a l i d o mi d e i s a n i n h i b i t o r o f a n g i o g e n e s i s J P r o c N a t l Ac a d S e i US A，1 9 9 4，9 1 (9)：4 0 8 2 4 0 8 5 6 S h i m M J，Kim H J，Y a n g S J，e t a 1 Ar s e n i c t r i o x i d e i n d u c e s a p o p t o s i s i n c h r o n i c my e l o ge n ou s l e u k e m i a K5 62 c e l l s：p o s s i b l e i n v o l v e me n t o f p 3 8 MAP k i n a s e J J B i o c h e m Mo l B i o l，2 0 0 2，3 5(4)：3 7 7-3 8 3 (责任编辑：罗芳)