自噬基因Beclin1在宫颈鳞癌中的表达及其与HPV感染的关系.pdf

DO I:10.3969/J.ISSN.1007-6611.2010.09.010自噬基因 Beclin 1在宫颈鳞癌中的表达及其与 HPV感染的关系王赞宏1,?彭芝兰2,?段振玲3,?欧阳运薇2?(1山西医科大学第一临床医学院妇科,?太原?030001;?2四川大学华西第二医院妇产科;?3昆明医学院第一附属医院妇产科)摘要:?目的?探讨自噬基因 Beclin 1在宫颈鳞癌中的蛋白表达以及对人乳头状瘤病毒(HPV)16 E6、E7感染的影响。?方法?采用免疫组化 SP法检测 81例宫颈鳞癌、20例宫颈上皮内瘤样病变(CI N)?级和 20例正常宫颈组织中自噬基因 Bec?lin 1的表达,采用 PCR扩增法检测宫颈鳞癌组织中 HPV16E6、E7的 DNA状况。?结果?宫颈鳞癌组织中 Beclin 1阴性、弱阳性、强阳性表达率依次是 43.2%(35/81),34.6%(28/81),22.2%(18/81),分别与正常宫颈组 15.0%(3/20)、30.0%(6/20)、55.0%(11/20)和宫颈上皮内瘤样病变组 20.0%(4/20)、30.0%(6/20)、50.0%(10/20)相比,Beclin 1在宫颈鳞癌中的表达存在显著下调(P=0.009,P=0.033)。HPV16E6、E7在宫颈鳞癌中的阳性率分别为 66.7%和 58.0%,HPV16 E6、E7感染与宫颈鳞癌中 Beclin 1蛋白的表达无相关性(r=-0.126,P=0.262;r=-0.125,P=0.270)。?结论?自噬基因 Beclin 1在宫颈鳞癌中表达下调,其表达对 HPV16E6、E7感染无明显影响。关键词:?宫颈鳞癌;?自噬;?Beclin 1;?HPV中图分类号:?R737.3?文献标志码:?A?文章编号:?1007-6611(2010)09-0792-05Expression of autophagy gene Beclin 1 in cervical squamous cell carcinom a and its relationship with infection ofHPV16WANG Zan?hong1,PENG Zhi?lan2,DUAN Zhen?ling3,OUYANG Yun?wei2(1Dept of Gynecology,First ClinicalM edical College,ShanxiM edical University,Taiyuan030001,China;2Dept of Obstetrics and Gynecology,WestChina SecondHos p ital,Sichuan University;3Dept of Obstetrics and Gynecology,FirstAffiliatedH ospital of Kunm ingM edicalCollege)Abstract:?Objective?To investigate the expression of autophagy gene Beclin 1 in cervical squa mous cell carcinoma and its effect onpapillomavirus 16 infection.?M ethods?SP i mmunohistoche m istry wasused to detect the expression of Beclin 1 in 81 cases of cervicalsqua mous cell carcino ma,20 cases of cervical intraepithelialneoplasm(CIN)?,and 20 cases of nor mal cervix.Polymerase chainreaction(PCR)was used to detect the expression ofHPV16 E6,E7.?Results?The rates ofnegative,weak,strong positive expressionofBeclin 1were 43.2%(35/81),34.6%(28/81),22.2%(18/81)in cervical squa mous cell carcinoma,respectively,15.0%(3/20),30.0%(6/20),55.0%(11/20)in nor mal cervix and 20.0%(4/20),30.0%(6/20),50.0%(10/20)in CI N?.The strongpositive rate of Beclin 1 in cervicalsqua mous cell carcinomawas significantly lower than that in nor mal cervix(P=0.009)andCI N(P=0.033).The infection rates ofHPV16 E6 and E7were 66.7%and 58%in the invasive carcinoma,respectively.The expression ofBeclin 1 was not correlatedw ith the infections ofHPV16 E6,E7(rE6=-0.126,P=0.262;rE7=-0.125,P=0.270).?Conclusion?Expression of autophagy gene Beclin 1 is down?regulated in cervical squa mous cell carcinoma,which is not associated with the infec?tion ofHPV16 E6,E7.K ey words:?cervical squa mous neoplasm;?autophagy;?Beclin 1;?HPV?自噬是?型程序性细胞死亡(type?pro?grammed cell death),是细胞通过双层膜结构包裹待降解物形成自噬体,再运送到溶酶体形成自噬溶酶体,从而降解蛋白和其他细胞成分的分解代谢过程,用以实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新,是正常细胞的功能,在维持细胞的自我平衡中非常重要,自噬调控的异常可促使肿瘤的发生 1,2。Bec?lin1是参与自噬调控的重要基因,可以通过提高细胞自噬抑制肿瘤的生长,是候选的肿瘤抑制基因 3。其与 bcl?2基因产物相互作用能抑制 Sindbis病毒的复制,减少中枢神经系统的凋亡,可能在宿主的抗病毒防御上起作用 4。人乳头瘤病毒(HPV)的感染与宫颈癌有着十分密切的关系。本研究采用免疫组化方法检测宫颈鳞状上皮细胞癌组织中 Be?clin1蛋白表达及人乳头瘤病毒(HPV)的感染情况,对宫颈鳞癌中 Beclin 1蛋白表达状况及其是否影响HPV的感染进行初步探讨。1?材料和方法1.1?材料1.1.1?资料来源?选择 2005-01 2005-05间在?基金项目:?山西省青年科技研究基金项目(2008021046-2);山西省卫生厅科技攻关计划项目(200719)!792!?山西医科大学学报(J Shanx iM edUniv)2010年 9月,41(9)?华西第二医院住院治疗的宫颈鳞癌患者共 81例,宫颈上皮内瘤样病变 20例,另取正常宫颈组织 20例作为对照。宫颈鳞癌组患者年龄 29-70岁,中位年龄 45.8岁。宫颈鳞癌临床分期按国际妇产科联盟(FI GO1995)制定的标准。临床分期:期 31例,?a期 28例,?b期 22例。大体类型:外生型 45例,内生型21例,溃疡型 5例,糜烂型 10例。局部肿瘤大小(可估计的病灶最大直径):4 c m 者 48例,#4 cm者 33例。组织学类型均为鳞状上皮细胞癌,细胞分化 级 6例,?级 27例,级 48例。术后病理报告宫颈肌层的受累程度:累及浅肌层 21例,中肌层 11例,深肌层或宫颈全层 49例。盆腔淋巴结转移 27例,未发现淋巴结转移 54例。20例患者术前行新辅助化疗,所有患者术前未行放疗,术中均行腹腔冲洗液细胞学检查,术式为广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术。宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraeoithelial ne?oplasm,CI N)组 20例为因 CI N?级行手术切除者的宫颈组织。正常宫颈组 20例为因子宫肌瘤切除子宫者的无瘤性病变的宫颈组织。1.1.2?试剂?Beclin 1多克隆抗体 BECN1为美国Santa Cruz公司产品,生物素化二抗(SPN?9001)为SantaCruz公司产品,购自北京中杉金桥生物技术有限公司,蛋白酶 K购自美国 MERCK公司,Taq PCRK it、DNA Marker为北京天为时代公司产品,消化缓冲液,TE 溶液 参照 分子克隆实验 指南(第三版)%5配置,二甲苯、氯仿和异丙醇等购自上海华舜生物工程有限公司。HPV16 E6、E7引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成,HPV16 E6上游引物 5&-GACCCGAAAGTTACCACAG-3&,下游引物5&-CAGCTGGGTTTCTCTACGTG-3&,扩增长度 201bp;HPV16 E7上游引物,5&-ATGACAGCTCAGAG?GAGGAG-3&,下 游 引 物 5&-TGAGAACAGAT?GGGGCACAC-3&,扩增长度 430 bp。1.2?方法1.2.1?标本处理?81例宫颈鳞癌组织石蜡标本,20例 CI N组织石蜡标本及 20例正常宫颈组织石蜡标本以 5?m厚度切片,连续切 5张置于 EP管中,用于 DNA的提取及 HPV16 PCR检测,另切两张制成切片,一张用于重复 HE染色,一张用于免疫组化检测 Beclin 1的表达。1.2.2?免疫组化 SP法检测宫颈鳞癌中 Beclin 1的表达?采用免疫组化 SP 法。切片经二甲苯脱蜡,酒精脱水后,3%过氧化氢液中封闭内源性过氧化酶活性,置于 0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH6.0)中,抗原修复后,滴加山羊血清工作液,封闭非特异性抗原。滴加 Beclin 1多克隆抗体,工作稀释度为 150,37(恒温箱内孵育,4(湿盒内过夜,滴加生物素化二抗,滴加链亲和素-生物素过氧化物酶复合物,DAB显色,适时终止。苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片,镜下观察。每批实验均设有阴、阳性对照,以前列腺癌为阳性对照,以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。1.2.3?PCR-琼脂糖凝胶电泳?采用酚氯仿法提取石蜡组织 DNA,-20(保存备用。三组标本均经HPV16 E6、E7两对引物 PCR 扩增。在 0.5 m l EP管内依次加入下列试剂,提取的 DNA产物和适量去离子水,使终反应体积为 25?l。反应体系为:模板DNA 2?l、10)Buffer 3?l、25mmol/L MgCl22.4?l、dNTP 2.4?l、TaqDNA聚合酶 0.4?l、引物 0.8?l、去离子水 13.2?l。反应条件:HPV16 E6 94(预变性 2m in,94(变性 30 s,57(退火 30 s,72(延伸1m in,共循环 35次,最后 72(再延伸 5 m in。HPV16 E7将退火温度调整为 59(,余反应条件不变。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳 40 m in,溴乙锭染色,检查产物的产量并与分子量标准进行对照,鉴定扩增产物的确切性。1.3?结果判断?免疫组化判定方法采用半定量评分,用低倍和高倍镜观察全片,Beclin 1阳性染色为在细胞膜或质内出现棕黄色颗粒。在 400倍镜下任意计数 5个视野,每个视野数 200个癌细胞,分别对阳性细胞数所占比例以及染色强度进行评分,评分标准为 6:1分为阳性染色细胞数 10%;2分为阳性染色细胞数占 10%-50%;3分为阳性细胞数#50%。阳性细胞的染色强度评分:0分为无染色;1分为淡黄色;2分为黄色;3分为棕黄色。两项得分相乘,最后评分,0-1分为阴性(-),4分为弱阳性(+),4分及 4分以上为阳性(+)。PCR产物结果判断,HPV16 E6 扩增长度为 430 bp 条带,HPV16 E7扩增长度产物为 201 bp条带。1.4?统计学分析?各组间 Beclin 1表达的比较,宫颈癌组织中 Beclin 1的表达的比较,计数资料采用卡方检验,相关性分析采用 Spear man等级相关分析。统计学分析采用 SPSS10.0统计软件包完成。!793!?山西医科大学学报(J ShanxiM edUniv)2010年 9月,41(9)?检验标准?=0.05。2?结果2.1?Beclin 1在正常宫颈、CI N和宫颈鳞癌组织的表达?Beclin 1阳性染色为在细胞膜或质内出现棕黄色颗粒(见图 1)。正常宫颈组织中 Beclin 1阴性、弱阳性和强阳性表达分别占 15.0%、30.0%、55.0%;CI N中分别为 20.0%、30.0%、50.0%;宫颈鳞癌中分别为 43.2%、34.6%、22.2%(见表 1)。宫颈癌鳞组 Beclin 1蛋白强阳性表达的比例低于正常宫颈组(P=0.009)和宫颈 CI N组(P=0.033),宫颈鳞癌中常见 Beclin 1表达下调和缺失。而正常宫颈组与 CI N组间 Beclin 1的表达差异无统计学意义(P=0.909)。图 1?正常宫颈上皮(A)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)(B)、宫颈鳞癌中 Beclin 1(C)中Beclin 1的表达(SP,)200)F ig 1?Expression of Beclin1 in nor mal cervical epithelia(A),cervical intraepithelial neoplasm(B),cervical squamous cell carcinoma(C)(SP,)200)表 1?宫颈鳞癌、CIN与正常宫颈 Beclin 1蛋白表达的比较?例(%)Tab 1?Expression of Beclin 1 protein in nor m al cervix and cervical squamous carcinoma?cases(%)组别nBeclin 1阴性弱阳性强阳性正常宫颈组203(15.0)6(30.0)11(55.0)CI N 组204(20.0)6(30.0)10(50.0)宫颈鳞癌组8135(43.2)28(34.6)18(22.2)*#?与正常宫颈组比较,*P 0.05;与 CI N 组比较,#P 0.052.2?HPV16 E6、E7在宫颈鳞癌中的感染情况以及与 Beclin 1蛋白表达的关系?HPV16 E6和 E7在宫颈鳞癌和 CIN中阳性率的差异均无统计学意义,见表 2和图 2、3。相关性分析表明,HPV16 E6、E7感染与 Beclin 1蛋白在宫颈鳞癌中的表达无相关性(rE6=-0.126,P=0.262;rE7=-0.125,P=0.270)。表 2?HPV16 E6、E7在宫颈鳞癌和 CIN中的感染?例(%)Tab 2?HPV16 E6,E7 infections in cervical squamous carcinoma and CIN?cases(%)组别nHPV16 E6+-PHPV16 E7+-PCI N2014(70.0)6(30.0)0.77615(50.0)5(50.0)0.163宫颈鳞癌8154(66.7)27(33.3)47(58.0)34(42.0)3?讨论3.1?自噬基因 Beclin 1在宫颈鳞癌中的表达?自噬是不同于凋亡的另一种细胞程序性死亡。自噬具有两个特点:形态学上具有自噬泡(autophagic!794!?山西医科大学学报(J Shanx iM edUniv)2010年 9月,41(9)?1.标准梯带;2,3,4.HPV16 E6阳性宫颈鳞癌组织;5.阳性对照;6.阴性对照图 2?HPV16E6电泳结果图(产物为 430 bp)Fig 2?The 430 bp products ofHPV16 E6 after electropho?resis1.标准梯带;2,3,4.HPV16 E7阳性宫颈鳞癌组织;5.阳性对照;6.阴性对照图 3?HPV16 E7电泳结果图(产物为 201 bp)Fig 3?The 201 bp products ofHPV16 E7 after electropho?resisvacuoles,AV)的形成;生化方面其发生不依赖于caspase的参与。在自噬过程中,部分或全部细胞器被包裹在双层膜结构中,构成自噬泡。自噬泡最终和溶酶体相融合,形成单层膜的自噬溶酶体,并降解其中的成分 1。自噬不仅在维持细胞的生长、发育、分化和自我平衡中非常重要,而且多种基因通过与这条途径相作用而发挥抗肿瘤效应,比如 PTEN、Beclin等 7。自噬基因 Beclin 1位于染色体 17q21,编码一种450个氨基酸序列,60 kD的蛋白质,在 75%的卵巢癌,50%的乳腺癌和 40%的前列腺癌中缺失 3,4,8。Beclin 1在进化上相当保守,具有调节细胞存活、分化和生长的作用。A ita等 8使用 Beclin 1特异性FISH 筛选 22个乳腺癌细胞株发现其中 41%的细胞株存在 Beclin 1等位基因缺失,所以将 Beclin 1列为一个候选的肿瘤抑制基因。L iang等 3通过体外克隆形成实验和裸鼠成瘤性分析发现,将 Beclin 1稳定转染 MCF7乳腺癌细胞可降低其恶性显型,减慢增殖率,同时过表达 Beclin 1基因的 MCF?7细胞在裸鼠中的成瘤能力显著降低。免疫组化方法发现,32例乳腺癌组织中 18例 Beclin 1蛋白表达水平显著下降。Yue等 9的研究发现 Beclin 1+/-杂合性突变小鼠自发性肿瘤发生率增加,存活期明显缩短。以上均提示在 Beclin 1缺失的细胞中,自噬活性显著降低,细胞的增殖能力显著提高。本研究显示,Beclin 1在宫颈鳞癌组织中以阴性和弱阳性表达为主,各占 43.2%、34.6%,显著高于正常宫颈组和 CI N 组(15.0%、30.0%,20.0%、30.0%)。提示宫颈鳞癌中存在 Beclin 1表达缺失和下调(阴性和弱阳性表达)。另外宫颈 CI N 组虽然 Beclin 1的表达出现下调趋势(50%),但与正常宫颈组(45%)比较,差异无统计学意义,而与宫颈鳞癌组相比,有统计学差异。说明在宫颈鳞癌中存在 Beclin 1基因的表达缺失或下调。3.2?HPV感染与 Beclin 1蛋白表达的关系?分子流行病学研究已经证实,人乳头瘤病毒(HPV)的感染与宫颈癌的发生有着十分密切的关系,HPV是宫颈癌发生和发展的主要致病因素。HPV 分子结构内的 E6、E7片段被认为是 HPV的癌基因,其与抑癌基因结合后,可使抑癌基因丧失活性,促进肿瘤的发生和进展,所以预防和治疗 HPV的感染成为目前宫颈癌治疗的新策略 10。L iang等 4的研究表明,Beclin 1与 bcl?2基因产物相互作用,能抑制 Sindbis病毒的复制,减少中枢神经系统的凋亡,可能在宿主的抗病毒防御上起作用。而在肝脏和肝癌细胞中的研究却发现,在营养缺乏的条件下,乙肝病毒 X蛋白(HBx)可以导致 Beclin 1的 mRNA和蛋白水平表达上调,并可以提高自噬活性,同时,复制 HBV和转染有 HBV基因组 DNA的细胞中自噬作用增强,提示 HBV感染在营养缺乏的情况下可以引起自噬水平上升,这就表明 HBx可通过上调 Beclin 1表达进而增强细胞内自噬作用,这可能是 HBV感染的肝细胞在营养缺乏情况下生长的一种重要机制 11。此两项研究说明自噬过程在病毒感染方面作用的复杂性,一方面可以清除病毒保护宿主,另一方面自噬过程又可以在营养缺乏的情况下为感染病毒的宿主细胞提供必要的能量使其继续生长。宫颈癌的发生也与病毒的感染有着十分密切的关系,HPV的感染是其发病和进展的元凶,而自噬在宫颈癌中究竟是以!795!?山西医科大学学报(J ShanxiM edUniv)2010年 9月,41(9)?何种方式来影响 HPV的作用,仍无相关研究。在本研究中,检测了高危型 HPV16在宫颈鳞癌中的感染情况及与 Beclin 1蛋白表达的相关性,虽然经统计学比较没有相关性(r=-0.126,P=0.262;r=-0.125,P=0.270),但是提示了两者之间存在负相关的趋势,是否可以说明,在宫颈鳞癌中,自噬水平的降低,使得 HPV 病毒得以逃脱被清除的机制,最终使 HPV持续存在导致了肿瘤的进一步发展,这与我们前期研究中宫颈鳞癌 Beclin 1的表达与反映肿瘤侵袭程度的盆腔淋巴结转移相关(P=0.002),与反应肿瘤生物学行为恶性度的细胞分化程度相关(P=0.001)相一致 12。综上所述,自噬基因 Beclin 1在宫颈鳞癌中表达下调,与 HPV16 E6、E7感染无关,但本研究尚不能充分说明在宫颈鳞癌中自噬基因 Beclin 1与HPV16病毒感染的关系,相信通过进一步扩大样本和分子水平的研究能够进一步探讨两者之间的关系,为宫颈癌的研究提供新的实验依据。参考文献:1?Lockshin RA,Zakeri Z.Caspase?independent cell deaths J.CurrOpin Cell Bio,l 2002,14(6):727-733.2?Clarke PG.Develop mental cell death:morphological diversity andmultiple mechanisms J.Anat Embryo,l 1990,181(3):195-213.3?L iang XH,Jackson S,SeamanM,et al.Induction of autophagyand inhibition of tumorigenesis by beclin 1 J.Nature,1999,402(6762):672-676.4?L iang XH,K leeman LK,Jiang HH,et al.Protection against fatalSindbis virus encephalitis by beclin,a novel Bcl?2?interactingprotein J.JV iro,l 1998,72(11):8586-8596.5?J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南 M.3版.黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:369-390.6?SchindlM,Birner P,Bachtiary B,et al.The i mpact of expressionof themetastasis suppressorproteinKA I1 on prognosis in invasivesquamous cell cervical cancer J.Anticancer R es,2000,20(6B):4551-4555.7?K itanaka C,Kuchino Y.Caspase?independent programmed celldeath w ith necrotic morphology J.Cell Death D iffer,1999,6(9):508-515.8?A ita VM,L iang XH,Murty VV,et 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