UCH-L3在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中的表达.pdf

http:/-1-UCH-L3 在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株 中的表达中的表达1 张竹青1，唐建武2*，孙成荣3，王波2，张宏颖2，赵志英2 1.大连市中心医院病理科，辽宁大连（116033）2.大连医科大学病理学教研室，辽宁大连（116027）3.大连市第五人民医院肿瘤科，辽宁大连（116021）E-mail：zzqdl_ 摘摘 要要:背景与目的：转移是导致大多数肿瘤患者死亡的主要原因，肿瘤转移机制及防治已成为当今重要的研究课题。Hca-F 和 Hca-P 是一对高度同源且淋巴道转移能力显著不同的小鼠腹水型肝癌细胞，其中 Hca-F 为高转移细胞株，Hca-P 为低转移细胞株。UCH-L3 属泛素 C-末端水解酶家族，泛素系统参与细胞周期、增殖及凋亡等生理病理过程。UCH-L3 与肿瘤的关系研究甚少，目前尚未见有其与肿瘤转移相关联的报告。本研究观察 UCH-L3 基因编码蛋白在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株（Hca-F、Hca-P）中的表达水平，分析它在这两个细胞株中表达的关系及意义，以进一步探讨 UCH-L3 基因在肿瘤转移过程中的作用及相关的分子病理学机制。方法：以 Hca-F 和 Hca-P 为研究对象，采用免疫细胞化学、Western Blot和流式细胞仪检测 UCH-L3 蛋白在 Hca-F 和 Hca-P 两细胞株的表达。结果：免疫细胞化学显示，UCH-L3 蛋白在 Hca-F、Hca-P 细胞中均主要定位于胞浆；Western Blot 及流式细胞仪结果均显示 UCH-L3 蛋白在 Hca-F 中的表达量明显低于 Hca-P（P0.01 和 P70%，Hca-P 为低转移细胞株，转移率30%13。UCH-L3 是泛素 C-末端水解酶家族(UCHs)成员之一，泛素系统作用于细胞的许多过程如细胞周期、增殖、凋亡、膜蛋白细胞内摄作用 和信号转导等4,5。本研究采用细胞免疫化学、Western Blot 和流式细胞术检测了 UCH-L3 蛋白 在 Hca-F 和 Hca-P 中的表达情况，进一步探讨 UCH-L3 表达与肿瘤淋巴道转移的关系，为解析肿瘤淋巴道转移机制提供新思路。2.材料与方法材料与方法 2.1 材料材料 高淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F），低淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-P），由大连医科大学病理教研室建株并保存。近交系 615 小鼠，雄性，体重 1822g，由大连医科大学病理教研室繁育并提供辽实动质字（2000）028 号。主要试剂 UCH-L3 多 1本课题得到教育部博士点基金（高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株的比较蛋白组研究，20040161005）和国家自然科学基金（30572098）的资助。http:/-2-克隆抗体购自 SANTA CRUZ 公司。2.2 细胞培养细胞培养 将液氮冻存的 Hca-F 和 Hca-P 细胞迅速融化后清洗两次，离心并收集沉淀将沉淀物溶解在 1ml 生理盐水中，以每只小鼠 0.2ml 细胞悬液（约 2x106个肿瘤细胞）接种到 2 只 615 小鼠腹腔内，7 天后无菌条件下抽取腹水并再以相同的量分别接种到 2 只 615 小鼠腹腔内传代，五天后无菌条件下抽取非血性腹水，离心去上清，经 PBS（PH7.4）洗涤一次，再离心，去上清后，将细胞加入含 10%新生牛血清的 RPMI-1640 培养液（PH7.2）中于 37、5%CO2、饱和湿度条件下培养。2.3 免疫细胞化学免疫细胞化学 将培养的HCa-F和HCa-P细胞用PBS重悬为1106/ml的细胞悬液，涂片标本经丙酮4固定，H2O2灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加 UCH-L3 一抗，4过夜，滴加生物素化二抗，DAB 显色，苏木精复染，脱水透明封片，空白对照选择 PBS 代替一抗。2.4 Western Blot分析分析 用超声破碎法裂解细胞，工作 20s，间歇 10s，重复 20 次，然后 8000g、4离心 30min取上清。Bradford 比色法测定蛋白质浓度。以 12.5%的 SDS-PAGE 电泳分离蛋白质样品。电泳后的凝胶用转移缓冲液平衡 30min，转至 PVDF 膜上 40min。用 5%TBS/BSA 于 37封闭2h，TBS 清洗三次；一抗（山羊抗小鼠多抗，1500稀释）4孵育过夜，TBS 洗三次（10min/次）；生物素标记的二抗，室温反应 20min，TBS 洗三次（10min/次）；加入辣根酶标记的链霉菌卵白素工作液，室温反应 30min，TBS 洗三次（10min/次）后，用 DAB 液于避光处显色，至条带清晰。蒸馏水清洗终止反应，滤纸吸干水分避光保存，实验重复三次。结果经凝胶扫描分析系统,进行光密度值（Optical density,OD）分析。2.5 流式细胞仪检测流式细胞仪检测 将培养的 Hca-F 和 Hca-P 细胞用 PBS 洗三次，离心（1000r/min，5min）收集细胞，用1ml 含 0.2%Triton X-100 和 5%血清的 PBS 重悬细胞，置冰上 10min。PBS 洗涤 3 次，离心（1000r/min，5min），用 PBS 重悬为 106/ml 的细胞悬液，取 200l 转移至 Eppendorf 管中，加入 UCH-L3 多克隆抗体 1l，371h。PBS 洗 3 次，离心（1000r/min，5min）；加入 FITC标记的二抗各 1l，充分震荡，置冰上 40min，PBS 洗 3 次，离心（1000r/min，5min）。同时以 PBS 代替一抗作为阴性对照。流式细胞仪进行检测，每管计数 10000 个细胞。UCH-L3蛋白在各细胞中的表达以相对荧光强度（Relative fluorescence intensity，RFI）表示，RFI=该样品的几何均数(Geo Mean)均值(Mean)。3.结果结果 3.1 免疫细胞化学结果免疫细胞化学结果 UCH-L3 蛋白在两细胞株中均主要表达于胞浆，且在 Hca-F 中的表达弱于在 Hca-P 中的表达（图 1）。http:/-3-图 1 UCH-L3 蛋白在 Hca-F 中的表达 UCH-L3 蛋白在 Hca-P 中的表达 图 1 免疫细胞化学(SP 法)分析 Hca-F、Hca-P 中 UCH-L3 蛋白的表达 Figure 1 the expression of UCH-L3 detected in Hca-F cells and Hca-P cells by immunocytochemistry 3.2 Western Blot 分析分析 以-actin 为内参照，于 26KD 处出现单一蛋白质条带，表明在 Hca-F 和 Hca-P 细胞中均有 UCH-L3 的表达，但在 Hca-P 细胞中的表达量明显高于 Hca-F 细胞，约为 1.85 倍（图 2）。图 2 Western Blot 测定 UCH-L3 蛋白在 Hca-F、Hca-P 中的表达 3.3 流式细胞仪分析流式细胞仪分析 以只加 FITC 标记的二抗作为阴性对照，排除了细胞非特异吸附荧光的影响，因此，流式细胞仪检测结果证实，Hca-F、Hca-P 细胞中确有 UCH-L3 的表达，且 Hca-P 细胞的表达量约为 Hca-F 细胞的 1.78 倍（图 3）。http:/-4-图 3 流式细胞仪分析 Hca-F 和 Hca-P 细胞中 UCH-L3 蛋白的表达 4.讨论讨论 UCH-L3是泛素C-末端水解酶家族(UCHs)成员之一，目前已成功克隆了在人类和鼠中的4种UCHs同工酶，即UCH-L1、UCH-L3、UCH-L4 和UCH-L5。其中研究较为深入的是UCH-L1，其两种突变体与人类帕金森病、鼠轴突营养不良关系密切6，7。在一些非神经元性肿瘤和神经痛病变组织中，UCH-L1存在表达异常。UCH-L3位于人类染色体13q22，有52%的氨基酸序列与UCH-L1同源8，分子量为26KD。通过x线晶体学研究显示，其二级结构是由6条反向平行的-片层为中心，-螺旋包绕-片层各面组成的。两者组合可形成木瓜蛋白酶相关的半胱氨酸蛋白酶。UCH-L3的活化位点有Cys95、His169及Asp184等。UCH-L3的mRNA表达涵盖不同组织，尤其在睾丸、胸腺中表达丰富4。在泛素途径中，UCH-L3操纵着细胞周期、转录活性、细胞生长和凋亡及突触发生等一系列生理病理过程。UCH-L3与肿瘤的关系在文献中鲜有报道。Rolen9等利用功能蛋白质组学方法分析人宫颈癌HPV携带者及邻近正常组织中泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin specific protease)活性时发现，大部分肿瘤组织中UCH-L3活性上调，提示该酶可能在生长转化中发挥作用。另有报道，在结肠癌免疫应答研究中，发现在结肠癌患者血清中，有19/43检测出存在自身抗体10。不难看出，UCH-L3与肿瘤的关系十分密切。有学者认为，UCH-L3能抑制多种促肿瘤生长蛋白的降解11。最近，Miyoshi 12等对100例浸润性乳腺癌中UCH-L1和UCH-L3的mRNA表达水平与不同临床病理特征及患者预后的关系进行了研究，显示在肿瘤组织中UCH-L3 mRNA水平显著高于癌旁正常组织（P0.005），而UCH-L1mRNA无显著差异。但二者mRNA水平在组织学分级较高肿瘤中的表达均显著高于较低分级的肿瘤，而且二者mRNA高表达的患者预后较差，易早期复发。目前尚未见有UCH-L3与肿瘤转移的相关报告。本课题组前期联合应用荧光差异双向凝胶电泳(2D DIGE)和质谱技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白，在众多差异性蛋白质中，UCH-L3在Hca-P中显著升高13。在本实验中，我们通过Western Blot、流式细胞术等方法检测了UCH-L3蛋白在肝癌淋巴道转移株Hca-F和Hca-P中的表达情况，结果显示，Hca-F中UCH-L3蛋白的表达水平明显低于Hca-P，这与前期研究结果相一致。因此，我们认为UCH-L3http:/-5-的异常表达可能参与肿瘤淋巴道转移，同时，该蛋白在Hca-F中低水平表达可能与Hca-F细胞具有较高转移力相关。此外，UCH-L3参与细胞凋亡引起了研究者的关注。Yae Sano14等发现UCH-L3缺失鼠生后3周龄即表现出光感受器细胞发生凋亡和显著的视网膜变性，尽管此前并无明显的形态学异常。超微结构观察发现，在光感受器内部节段的线粒体嵴和囊泡区域变小；免疫反应性提示，UCH-L3缺失鼠在生后视网膜变性过程中可能通过Caspase 非依赖途径增加线粒体氧化应激相关蛋白如COX（cytochrome coxidase)、Mn-SOD(manganese superoxide dismutase)以及AIF(apoptosis-inducing factor)等的表达，诱导光感受器细胞凋亡。Kwon 15等认为UCH-L3和Nedd8之间的相互作用可能引起生殖细胞的凋亡。截至目前，有关UCH-L3的研究尚不多，凭借已知的生化结构和机理还难以解释和推测其诸多生物学功能和它在肿瘤中发挥的作用，相信随着研究的深入，我们对UCH-L3将会有较为全面的理解和认识。5.结论结论 在我们的实验中，UCH-L3蛋白在这两个具有不同淋巴道转移力瘤株中的表达具有显著差异，我们推测，在肿瘤转移过程中，UCH-L3可能参与肿瘤细胞的凋亡。何种机制导致UCH-L3在两种细胞中表达的差异，还有待进一步研究。参考文献参考文献 1 凌茂英，刘希凤，关素琴，等.小鼠肝癌不同转移力克隆的分离极其特性的研究，中华医学杂志，1990,70(6):315318.2 凌茂英，王明辉，郭伶伶，等.Hca/16A3-F 及 Hca/16A2-P 两株小鼠淋巴道转移肝癌细胞系的特性研究，中华医学杂志，1995,75(3):170171.3 Hou L,Ying L,Yong-Hua J,et al.Molecular mechanism about lymphogenous metastasis of hepatocarcinoma cells in mice.J.World J Gastroenterol,2001,7(4):532-536.4 Kurihara LJ,Semenova E,Levorse JM,et al.Expression and functional analysis of Uch-L3 during mouse development J.Mol Cell Biol.2000,20(7):2498-2504.5 Sano Y,Furuta A,Setsuie R,et al.Photoreceptor cell apoptosis in the retinal degeneration of Uchl3-deficient mice J.Am J Pathol.2006,169(1):132141.6 Leroy E,Boyer R,Auburger G,et al.The ubiquitin pathway in Parkinsons disease J.Nature.1998,395(6701):451452.7 Saigoh K,Wang YL,Suh JG,et al.Intragenic deletion in the gene encoding ubiquitin carboxy-terminal hydrolase in gad mice J.Nat Genet.1999,23(1):4751.8 Wilkinson KD,Deshpande S,Larsen CN.Comparisons of neuronal(PGP 9.5)and non-neuronal ubiquitin C-terminal hydrolases J.Biochem Soc Trans.1992,20(3):631637.9 Rolen U,Kobzeva V,Gasparjan N,et al.Activity profiling of deubiquitinating enzymes in cervical carcinoma biopsies and cell lines J.Mol Carcinog.2006,45(4):260269.10 Nam MJ,Madoz-Gurpide J,et al.Molecular profiling of the immune response in colon cancer using protein microarrays:occurrence of autoantibodies to ubiquitin C-terminal hydrolase L3 J.Proteomics.2003,3(11):21082115.11 Tirat A,Schilb A,Riou V,et al.Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2 J.Anal Biochem.2005,343(2):244255.12 Miyoshi Y,Nakayama S,Torikoshi Y,et al.High expression of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase-L1 and-L3 mRNA predicts early recurrence in patients with invasive breast cancer J.Cancer Sci.2006,97(6):523529.13 孙成荣，唐建武，孙明忠，等.采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白，生物化学与生物物理进展，2007,34(8):856864.14 Sano Y,Furuta A,Setsuie R,et al.Photoreceptor cell apoptosis in the retinal degeneration of Uchl3-deficient mice J.Am J Pathol.2006,169(1):132141.15 Kwon J,Wang YL,Setsuie R,et al.Two closely related ubiquitin C-terminal hydrolase isozymes function as reciprocal modulators of germ cell apoptosis in cryptorchid testis J.Am J Pathol.2004,165(4):13671374.http:/-6-Expression of UCH-L3 in mouse hepatocarcinoma ascites cell lines Hca-F(highly metastatic)and Hca-P(low metastatic)Zhang Zhuqing1,Tang Jianwu2,Sun Chengrong3,Wang bo2,Zhang Hongying2,Zhao Zhiyng2 1.Department of Pathology,Dalian Municipal Central Hospital,Dalian,Liaoning,P.R.China(116033)2.Department of Pathology,Dalian Medical University,Dalian,Liaoning,P.R.China(116027)3.Department of Oncology,Dalian No.5 hospital,Dalian,Liaoning,P.R.China(116021)Abstract BACKGTOUND&OBJECTIVE:Most of patients with cancer died from its metastasis,the mechanism of metastasis and prevention and therapeutics have been an important issue in tumor domain.Hca-F(highly lymphatic metastasis potential)and Hca-P(low metastasis)are a pair of syngeneic mouse hepatocellular cell lines which present different potential of lymphatic metastasis.UCH-L3 belongs to the ubiquitin C-terminal hydrolase family.There are little reports concerning the role of UCH-L3 in tumor,especially regarding its correlation with tumor metastasis.In our study,the expression of UCH-L3 were detected in Hca-F and Hca-P and analyzed the relationship between the two tumor cell lines in order to explore the role of encoding protein of UCH-L3 genes in tumor metastasis and its relevant molecular mechanisms.METHODS:the expression of UCH-L3 protein were detected in Hca-F and Hca-P tumor cells by immunocytochemistry,Western Blot and flow cytometry.RESULTS:Immunocytochemistry manifests that UCH-L3 was localized to the cytosol between the two tumor cells.Western Blot and flow cytometry indicate that the expression of UCH-L3 was lower in Hca-F than in Hca-P(P0.01,P0.001).CONCLUSION:The expression of UCH-L3 may be related to the lymphatic metastasis.Keywords:liver neoplasms;lymphatic metastasis;UCH-L3 protein http:/-7-附图：附图：UCH-L3 蛋白在 Hca-F 中的表达(x400)UCH-L3 蛋白在 Hca-P 中的表达(x400)图 1 免疫细胞化学(SP 法)分析 Hca-F、Hca-P 中 UCH-L3 蛋白的表达 Figure 1 the expression of UCH-L3 detected in Hca-F cells and Hca-P cells by immunocytochemistry Hca-F Hca-P A Western Blot 分析 Hca-F、Hca-P 细胞中和 Hca-P 细胞中 UCH-L3 蛋白表达的差异(0.01)UCH-L3 的表达情况 图 2 Western Blot 测定 UCH-L3 蛋白在 Hca-F、Hca-P 中的表达 Figure 2 the expression of UCH-L3 detected in Hca-F cells and Hca-P cells by Western Blot B 以-actin 作为内参照,统计分析细胞 Hca-F 26KD UCH-L3 42KD-actin 00.050.10.150.20.250.30.35Hca-F Hca-POD(UCH-L3/actin)http:/-8-A Hca-F cells B Hca-P cells C Hca-F 和 Hca-P cells 细胞 相对荧光强度的统计分析(0.001)图 3 流式细胞仪分析 Hca-F、Hca-P 中 UCH-L3 蛋白的表达 Figure 3 flow cytometry analysis of UCH-L3s expression in Hca-F cells and Hca-P cells 050010001500200025003000350040004500Hca-F Hca-PRFI(UCH-L3)