SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS,聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质,1,蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。,2,原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N,，N,四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。,3,4,5,6,30%丙烯酰胺的配制,1、称量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L烧杯中,2、向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。,3、加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45 mm滤膜滤去杂质。,4.于棕色瓶中4保存。,注意,：,丙烯酰胺具有很强的神经毒性,，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。,7,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。,表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系,分子量范围 适用的凝胶浓度/(%),蛋 白 质,10KD 20-30,1O-40KD 15-20,1O-100KD 10-15,100KD 5-10,500KD 2-5,8,分离胶的聚合（12%）,5ml体系,蒸馏水 1.634ml,30%丙烯酰胺 2.0ml,1.5M pH8.8 Tris-SDS 3.7ml,10%AP 25ul,TEMED 5ul,上层加异丙醇压胶，室温一小时,9,积层胶的聚合（5%）,2.5ml体系,蒸馏水 1.75ml,30%丙烯酰胺 0.413ml,1MpH6.8 Tris-SDS 0.338ml,10%AP 12.5ul,TEMED 2.5ul,室温一小时,10,11,过程图,202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm,12,（二）方法,1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层异丙醇(约高34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。,将异丙醇倒去用重,蒸水洗净,胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液加入分离胶上方，轻轻插入梳子.待上层胶聚合，拔出梳子,放入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即可加样。,2、样品处理：,样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的上样缓冲液6*SDS，金属浴105C 10min，加样量一般每个样品池1040,l。,13,3、电泳,将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭电源,4、染色与脱色,电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，,从凝胶板上切下一角作为加样标记,。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色，则可见蛋白质区带清晰。,14,5、转移电泳：,凝胶电泳结束前30min，将PDVF膜浸泡在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽，PDVF膜一面朝正极，恒压100伏70min，4电泳过夜，次日取出PDVF膜做好标记。,15,六、,膜的封闭,在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5%N-fat milk.封闭过程：1)洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。2)取漂洗的转印膜，放入5%No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭1h，也可在4度过夜。,3)用1xTBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.,16,七、抗体杂交抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素，酶，以及生物素等。杂交过程：）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗，封口，4孵育过夜或室温（22-25）摇动孵育2h.）液洗膜3次x10min）标记的二抗室温1h，洗膜3x10min,17,八、检测根据标记二抗的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有增强化学发光(ECL)和DAB检测系统.1)辣根过氧化物酶-DAB法:DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.显色:将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.,18,2)辣根过氧化物酶-ECL法:增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来:ECL显色剂配制:按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀.在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液,反应1-5分钟，用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的保鲜膜盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触.将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟,冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长到数小时,.冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.,19,考马斯亮蓝,和DAB,考马斯亮蓝染色:将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止,DAB染色,20,常见问题及解决方案,21,22,23,24,25,注意事项:,免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关,.,因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的,温度,也将影响凝胶聚合的速度,.,因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为,15-20,分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为,8-10,分钟开始可见聚合,.,灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合,.,26,3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.,4.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的,预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)5.加样前样品应先,离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象6.为避免边缘效应,可在未加样的孔中,加入等量的样品缓冲液,27,7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应尽快转印.9.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔10.取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为,标记,(如左上角)转膜时也应用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.11.转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极.,28,