肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗瘤作用的影响.pdf

。勰骂訾磊慧z 吼t 叩，：1 7 0 1 7 4 文章编号 1 0 0 7-3 8 5 X(2 0 0 3)0 3-0 1 7 0-0 5肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗瘤作用的影响汪晓莺1，梁志强1，张一心2，孙伟红2，石佑琴1(I 南通医学院免疫学教研室，江苏南通2 2 6 0 0 1；2 南通医学院附属医院外科，江苏南通2 2 6 0 0 1)摘要】目的：研究肿瘤抗原负载的树突状细胞(D C s)对原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(T I L s)体外增殖和抗瘤作用的影响。方法：将自体肿瘤细胞匀浆粗提物(T u l y)与原发性肝癌患者外周血来源的D C s 共培养以制备肿瘤抗原负载的D C(D C T u l y)，将D C T u l y 与自体T I L s 在低浓度I L-2(1 0 0U r n l)中共培养，用F C M 测定D C T u l y 的表型以及与D C T u l y 混合培养前后的T I k 表型，并计数T I L s。用L D H 法测定T I L s 的细胞毒作用。E L I S A 法检测L s 培养上清中I F N 一1 和T N F o L 的含量。结果：D C。T u l y 表面C D I a，C D 8 3，C D 8 0，C D 8 6，C D 4 0 和H L A D R 分子表达水平增高(P 0 0 5)；D C T u l y 明显诱导T I L s 的增殖(P 0 0 1)及对自体肝癌细胞的细胞毒作用(P 0 0 1)，C D 3+T I L s 增多(P 0 0 5)，C D 4+T I L s 比例较混合前升高(P 0 0 1)，但仍以C D 8+T I L s 为主。与D C T u l y 混合培养后第1，2 天，7 n k 分泌I F N 一1 和T N F d 的量明显提高(P 0 0 1)。结论：负载肿瘤抗原的D C s 可促进T I L s 的增殖，增强T I L s 的特异性抗肿瘤活性。关键词树突状细胞；肿瘤浸润淋巴细胞；细胞毒作用；原发性肝癌 中图分类号 R 3 9 2 1；R 7 3 5 7 文献标识码 AE f f e c to fD e n d r i t i cC e l l sL o a d e dw i t hT u m o rA n t i g e n so nA n t i t u m o rA c t i v i t yo fT u m o r-I n f i l t r a t i n gL y m p h o c y t e sf r o mH e p a t o c e l l u l a rC a r c i n o m ai nv i t r oW A N GX i a o r i n 9 1，L I A N GZ h i q i a n 9 1，Z H A N GK x i n 2，S U NW e i h o n 9 1，S H IY o u q i n l(J D e p a r t m e n to fI m m u n o l o g yo fN a n t o n gM e d i c a lC o l l e g e，N a n t o n g2 2 6 0 0 1；2 D e p a r t m e n to fS u r g e r yo fA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fN a n t o n gM e d i c a lC o l l e g e，N a n t o n g2 2 6 0 0 1)A b s t r a c t 0 b j e c t i v e：T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fd e n d r i t i cc e l l s(D C s)l o a d e dw i t ht u m o ra n t i g e n so nt h ep r o l i f e r a t i o na n da n t i t u m o ra c t i v i t yo ft u m o r i n f i l t r a t i n gl y m p h o c y t e s(T I L s)f r o mh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a(H C C)i nv i t r o M e t h o d s：D C sd e r i v e df r o mt h ep e r i p h e r a lb l o o do fp a t i e n t sw i t hH C Cw e r el o a d e dw i t ha u t o l o g o u st u m o rl y s a t e(T u l y)t og e n e r a t eD C-T u l ya n dt h e nt h eD C T u l yw a sC O c u l t u r e dw i t ha u t o l o g o u sT I L si nl O Wc o n c e n t r a t i o no fI L 2 T I L sw e r ec o u n t e d a n dt h ep h e n o t y p e so fD C sa n dT I L sw e r ea s s a y e db yF C Ma n dt h ec y t o t o x i c i t yo fT I L sw a sd e t e r m i n e dw i t hL D Hm e t h o d T h ec o n c e n t r a t i o no fc y t o k i n e si nT I L sc u l t u r es u p e r n a t a n ts u c ha sI F N 一1a n dT N F dw a sd e t e c t e db yE L I S A R e s u l t s：T h ee x p r e s s i o nl e v e l so fC D la，C D 8 0，C D 8 3，C D 8 6，C D 4 0，H L A D Rm o l e c u l e so nt h eD C T u l ya r en o t a b l yi n c r e a s e d(P 0 0 5)T h ep r o l i f e r a t i o no fT I L sw h i c hw e r ei n d u c e db yD C T u l yw a sm a r k e d l ye n h a n c e d(P 0 0 1)a n dt h ec y t o t o x i c i t y0 ft h eT I L sa g a i n s ta u t o l o g o u st u m o rc e l l sw a sr e m a r k a b l yi n c r e a s e d(P 0 0 1)A f t e rC O c u l t u r e dw i t hD C T u l y C D 3+T I L sw e r ei n c r e a s e d(P 0 0 5)a n dt h ep e r c e n t a g eo fC D 4+T I L sw a se n h a n c e d(P 0 0 1)，h o w e v e r，t h ep e r c e n t a g eo fC D 8+T I L sw a ss t i l lh i g h e rt h a nt h a to fC D 4+T I L s B o t hc o n c e n t r a t i o n so fI F N Ya n dT N F 0【i nt h ec u l t u r es u p e r n a t a n to ft h eT I L sd i s t i n c t l yi n c r e a s e do nt h e1s ta n d2 n dd a y so fC O c u l t u r i n g(尸 9 5)作为靶细胞，按常规操作方法检测T I L s 的杀伤活性，效靶比为2 5：1，按下式计算杀伤活性：杀伤活性()=驾熬凝醢喾臻寨糯笋，0 0 0 DO D最大释放组值自然释放组值1 1 0 统计学方法结果采用(互s)表示，两组比较用t 检验，多组比较用单因素方差分析。所有统计学处理均用S t a t a 7 0软件完成。2 结果2 1T u l y 负载对D C 表面分子表达的影响H C C 病人外周血单核细胞用G M C S F 和I L 4 诱导培养5d，第6 天实验组加入自体T u l y 继续刺激培养2d 后(对照组不加T u l y)，分别检测2 组D C 的表面分子的表达，可见肿瘤抗原负载后的D C 上调表达C D l a，C D 8 3，C D 8 0，C D 8 6，C D 4 0 和H L A D R(表1)。2 2D C T u l y 对T I L s 的增殖的影响T I L s 在含I L 一2(1 0 0U m 1)完全培养基中与D C T u l y 混合培养7d，与T u l y 或单纯在含I L 一2(1 0 0U m 1)的完全培养基中培养的T I L s 相比，增殖效果明显(P 0 0 1)，3 组T I L s 增殖数分别为(1 1 1 6 2 9 5)1 0 5 孑L，(7 8 土2 6 3)1 0 5 孑L，(7 3 2 9 9)1 0 5 孑L(见图1)。万方数据1 7 2 中国肿瘤生物治疗杂志2 0 0 3S e p；1 0(3)表1T u l y 负载对D c 表面分子表达的影响T a b 1E f f e c to nt h ee x p r e s s i o no fm o l e c u l e so nD Cb yl o a d i n gT u l yG r o u D sC D laC D 8 3C D 8 0C D 8 6C D 4 0H L A D RD C3 9 6 9，75 4 5 8 75 2 9 1 2 04 1 0 1 1 14 7 1 1 2 85 3 6 8 6D C T 廿v5 5 6 士1 1 7+7 6 4 1 3 7+6 8 9 士1 1 5+6 5 3 土1 3 0+7 3 1 1 2 5+8 2 3 士1 4 1#C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u pP 0 0 1G r o u p s图1D C T u l y 对T I L 的增殖的影响F i g 1E f f e c to fD C-T u l yo nt h ep r o l i f e r a t i o no fT I L2 3D C T u l y 对T I L s 抗瘤作用的影响3 组T I L s 对3 种靶细胞的杀伤率结果见表2。T I L+I L-2+D C T u l y 组对自体肝癌细胞的细胞毒作用较T I L+I L-2+T u l y 组和T I L+I L-2 组显著性增强(P 0 0 1)，3 组T I L s 对自体肝癌细胞的细胞毒作用均明显高于对S K h e p 1，K 5 6 2 肿瘤细胞的细胞毒作用(P 0 0 5)。2 4D C T u l y 对T I k 分泌细胞因子的影响T I L s 经D C T u l y 刺激的第1，2 天，分泌I F N y 和T N F 一0【的水平较T u l y 组或I L-2 组的T I L s 显著增高(P 0 0 1)，且以第1 天分泌水平最高(P 0 0 1)(见图2，3)。2 5D C T u l y 对T I L 的细胞表型的影响T I L 与D C T u l y 混合培养后，C D 3+T 细胞增多(P 0 0 5)，C D 4+T 细胞比例较混合前升高(尸 0 0 1)，表2D C-T u l y 对T I L s 杀伤靶细胞活性【)的影响(i s。n=8)T a b 2E f f e c to fD C-T u l yo nt h ec y t o t o x i e i t yo fT I La g a i n s tt a r g e tc e l l sC o m p a r e dw i t ht w oc o n t r o lg r o u p sP 0 0 1：C o m p a r e dw i t hK 5 6 2a n dS K H e p 一1g r o u p sP 0 0 57 0 06 0 0鼍5 0 0罂4 0 0主3 0 0苔2 0 0l O O04 87 2H o u r s图23 组T I L 不同培养时间分泌I F N-Y的含量(p g w a)(i s。n=8)F i g 2T h ec o n c e n t r a t i o n so fI F N-Ys e c r e t e db yt h r e eg r o u p so fT I Li nd e f f e r e n tc u l t u r i n gp e r i o d s(p g n 1 1)2 44 87 2H o u r s图33 组T I L 不同培养时间分泌T N F d 的含量(p g m 1)(x s，n=8)F i g 3T h ec o n c e n t r a t i o n so fT N F-ds e c r e t e db yt h r e eg r o u p so fT I Li nd e f f e r e n tc u l t u r i n gp e r i o d s(p g n 1 I)642O8642O(Ipfb_vd L L加印如如加m0一H吕、龇一j0阻Z 万方数据中国肿瘤生物治疗杂志2 0 0 3S e p；1 0(3)1 7 3 B e f o r ec o c u l t u r i n gA f t e r(3 0 一c u l t u r i n g7 3 2 6 5 1 68 8 4 0 3 9 1 1 7 3 5 3 4 43 6 7 2 6 1 7 5 0 0 8 4 7 54 7 5 3 3 6 81 4 6 8 3 3 17 4 5 2 4 6+C o m p a r e dw i t hb e f o r ec o-c u l t u r i n gg r o u pP 0 0 5但仍以C D 8+T 细胞为主，C D 5 6+细胞比例下降P 0 0 1)，见表1。3 讨论T I L s 是原发或继发肿瘤组织周围的淋巴细胞，大多是C D 3+C D 8+C T L，而C T L 的激活和成熟依赖于抗原肽刺激及第二信号的传导。由于肿瘤细胞表面缺乏或不能正常表达C D 8 0，C D 8 6 等协同刺激分子，而不能有效的激活C T L M l，同时肿瘤组织内微环境条件下存在免疫抑制物质，抑制T I k 的活化、增殖，使T I L s 活性较低。尽管T I L s 联合应用I L-2 可产生较强的抗肿瘤效果，但需I L-2 的剂量较大，且I L-2 具有严重的副反应，其程度和范围与I L-2 的用量呈正比，因此，急需寻找一条在低浓度I L-2 条件下诱导具有高效特异性抗肿瘤活性的T I k 的新途径。D C 是体内功能最强的抗原提呈细胞，其细胞表面丰富表达与抗原递呈有关的M H C I 类和M H C I I 类分子，高水平表达多种共刺激分子(如C D 8 0，C D 8 6，C D 4 0 等)，目前发现D C 既可将外源性抗原与M H C1 I 类分子结合，提呈给C D 4+T淋巴细胞。又可将外源性抗原多肽与M H CI 类分子结合，提呈给C D 8+T 细胞”1。我们的实验结果显示，负载肿瘤抗原的D e s 上调表达C D l a，C D 8 3，C D 8 0，C D 8 6，C D 4 0 和H L A D R 分子，提示该D C 成熟度增高，抗原提呈功能增强。我们将负载肿瘤抗原的D C s与肝癌患者T I L s 共同培养，旨在探讨在低浓度I L 2 的培养条件下，增强T I L s 特异性杀伤作用的可行性。在建立的荷瘤鼠模型中，负载肿瘤抗原的D C 体内应用能产生明显的抗肿瘤效果M 1。我们将肝癌患者T I b 与D C T u l y 在含低浓度I L-2(1 0 0U m 1)的培养基中混合培养，并与加T u l y 或单纯在低浓度I L-2(1 0 01 3 m 1)条件下培养的T I L s 进行比较。实验结果表明，T I L+I L-2+D C T u l y 组的T I L s 较T I L+I L-2+T u l y 组和T I L+I L-2 组的T I L s 增殖效果明显；虽然3 组T I L s 对自体肝癌细胞的细胞毒作用均明显高于对S K H e p 1，K 5 6 2 肿瘤细胞的细胞毒作用，显示T I L s 抗肿瘤免疫的特异性，但负载肿瘤抗原的D C 诱导的T I k 对自体肝癌细胞的细胞毒作用显著性增强，提示D C T u l y 促进了特异性的C T L 反应。M u l d e r s p l 等研究发现，负载肿瘸抗原的D E s 与低浓度I L-2 对人肾细胞癌T I L s 体外增殖及细胞毒作用具有较强的正向调节作用，本实验结果与该文献报道相一致。T I L 被激活后能够产生许多细胞因子，其中I F N 一1，T N F O t 具有较高的抗肿瘤活性。它们一方面可直接作用瘤细胞发挥杀伤作用，另一方面还可调节其它免疫细胞协同对肿瘤细胞的攻击。R o s s e l 旧1 等分别从细胞因子m R N A 表达和细胞因子分泌情况观察到缺乏细胞因子的配合是T I L s 细胞毒活性低下的一个重要原因。为证实负载肿瘤抗原的D C s 对T I L s 细胞因子分泌的影响，我们对T I k 在不同培养条件下分泌I F N y，T N F O t 含量进行测定，结果显示，T I L+I L-2+D C-T u l y 组第1，2 天分泌I F N-1，T N F-O t 的量较T I L+I L-2+T u l y 组和T I L+I L-2 组显著增高。C h a n g 归1 等用黑色素瘤病人外周血D C s 负载肿瘤抗原，在含I L-2(6 0U m 1)的培养基中可诱导T h l 细胞分泌高水平的I F N 一1。I F N 0【，T N F 一 y 可增强D C s 表面M H C 分子和黏附分子的表达，从而增强D C s 将肿瘤抗原呈递给T 细胞的能力，促进T 细胞向C T L 分化。C D 3+C D 5 6 细胞群体数量的增加程度，可作为D C s 激发抗肿瘤特异性T 细胞的指标之一 7】。d eV e a r m a s u 等发现，D C s 只有通过外源抗原负载激活C I M+T 细胞后，才能诱导产生抗原特异性的C T L；负载抗原的D C s 不能刺激纯化C D 8+T 细胞产生C T L 应答，加人C D 4+T 细胞则可产生应答2 1。本结果显示，被D C T u l y 活化后的T I L s 中C D 3+T 细胞增多，C D 5 6+细胞比例下降，C D 4+T 细胞所占比例较混合培养前升高，但仍以C D 8+T 细胞为主。提示被D C T u l y 活化的C I M+T 细胞对C D 8+T 细胞最终分化为肿瘤抗原特异性C T L 有着极其重要的作用。本实验结果表明，负载肿瘤抗原D C s 能促进T I L s的增殖和有效地活化T I L，使其对自体肿瘤细胞产生较强的细胞毒作用，分泌高产量的抗肿瘤细胞因子。为临床肝癌患者应用这种高效、特异性的T I L s 进行过继治疗提供了实验依据。万方数据1 7 4 中国肿瘤生物治疗杂志2 0 0 3S e p；1 0(3)一 参考文献 1 王建华，童善庆，蒋玖，等卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞某些细胞因子基因表达的研究 J 中国肿瘤生物治疗杂志，1 9 9 9，6(1)：3 9-4 4 2 朱学军，曹雪涛，于益芝，等人外周血树突状细胞的体外扩增与鉴定 J 中国肿瘤生物治疗杂志 J ，1 9 9 7，4(4)：3 0 2 3 0 6 3 何金生，宗庭益L D H 法检测N K 细胞活性的方法学研究 J 中国实验l 临床免疫学杂志，1 9 9 6，8(2)：1 0 1 3 4 D e n f e l dR W，D i e t r i c hA，w u t t i gC。e ta 1 i ns i t ue x p r e s s i o nB 7a n dC D 2 8r e c e p t o rf a m i l i e si nh u m a nm a l i g n a n tm e l a n o m a：R e l e v a n e ef o rT，c e l l m e d i a t e da n t i t u m o ri m m u n i t y J I n tJC a n c e r，1 9 9 5。6 2(3)：2 5 9-2 6 5 5 M o r o nG，R u e d aP，C a s a lI，e ta 1 C D 8 a l p h a C D l l b+d e n d r i t i cc e l l sp r e s e n te x o g e n o u sv i r u s-l i k ep a r t i c l e st oC D 8+Tc e l l sa n ds u b s e q u e n t l ye x p r e s sC D 8 a l p h aa n dC D 2 0 5m o l e c u l e s J JE x pM e d，2 0 0 2，1 9 5(1 0)：1 2 3 3 1 2 4 5 6 M u l eJ J T u m o rv a c c i n es t r a t e g i e st h a te m p l o yd e n d r i t i cc e l l sa n dt u m o rl y s a t e s：E x p e r i m e n t a la n dc l i n i c a ls t u d i e s J I m m u n o lI n-v e s t，2 0 0 0，2 9(2)：1 2 7 1 2 9 7 M u l d e r sP，T s oC L，G i t l i t zB，e ta 1 P r e s e n t a t i o no fr e n a lt u m o ra n t i g e n sb yh u m a nd e n d r i t i cc e l l sa c t i v a t e st u m o r i n f i l t r a t i n gl y m-研究简报 文章编号】1 0 0 7-3 8 5 X(2 0 0 3)0 3-0 1 7 4-0 1p h o c y t e sa g a i n s ta u t o l o g o u st u m o r：I m p l i c a t i o n sf o rl i v ek i d n e yc a n c e rv a c c i n e s J C a n c e rR e s，1 9 9 9，4 4 5(5)：4 4 5 4 5 3 8 R o u s s e lE，G i n g r a sM C，G r i m mE A，e ta 1 H i g he x p r e s s i o no fa d h e s i o nm o l e c u l e s a c t i v a t i o nm a r k e r 8w i t hl i t t l ei n t e r l e u k i n-2 i n t e r-f e r o ng a m m a，a n dt u m o rn e c r o s i sf a c t o rb e t ag e n ea c t i v a t i o ni nf r e s ht u m o r i n f i l t r a t i n gl y m p h o c y t e sf r o ml u n ga d e n o c a r c i n o m a J C a n c e rI m m u n o l I m m u n o t h e r，1 9 9 5，4 1(1)：1-9 9 C h a n gj w，P a n gM，V a q u e r a n oJ E I n d u c t i o no f T h lr e s p o n s eb yd e n d r i t i cc e l l sp u l s e dw i t ha u t o l o g o u sm e l a n o m aa p o p t o t i cb o d i e J A n t i c a n c e rR e s，2 0 0 0，2 0(3 A)：1 3 2 9-1 3 3 6 1 0 L u t zM B，A s s m a n nC U，G i r o l o m o n iG，e tn 1 D i f f e r e n tc y t o k i n e sr e g u l a t ea n t i g e nu p t a k ea n dp r e s e n t a t i o no fap r e c u r s o rd e n d r i t i ce e l ll i n e J E u rJI m m u n o l，1 9 9 6，2 6：5 8 6-5 9 4 f11 d eV e e r m a nM，H e i m a nC，V a nM e i r v e n n eS，e ta 1 R e t r o v i r a l l yt r a n s d u c e db o n em a T o w d e r i v e dd e n d r i t i cc e l l sr e q u i r eC D 4+Th e l pt oe l i c i tp r o t e c t i v ea n dt h e r a p e u t i ca n t i t u m o ri m m u n i t y J JI m m u n o l，1 9 9 9，1 6 2：1 4 4-1 5 1 1 2 R i d g eJ P，D iR o s aF，M a t z i n g e rP，e ta 1 Ac o n d i t r o e dd e n d r i t i cc e l lC a nb eat e m p o r a lb r i d g eb e t w e e naC D 4+T h e l p e ra n daT k i l l e rc e l l J N a t u r e，1 9 9 8，3 9 3(6 6 8 4)：4 7 4 4 7 8 收稿日期 2 0 0 3-0 3 0 7 修回E t 期 2 0 0 3 0 5 2 5T N P-4 7 0 对肺癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用吴晓娟，杨向红(中国医科大学实验病理学研究室，沈阳1 1 0 0 0 1)应用体外培养的人脐带静脉内皮细胞(H U V E C)和人肺腺癌细胞株A Z G Y 8 2 A，探讨了T N P-4 7 0 对肿瘤细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用及其机制。人脐静脉内皮细胞的培养采用本实验室改进的J a f f e 氏培养法，并且将人肺癌细胞株进行传代培养。制备肺癌细胞条件培养液和肺癌细胞粉碎液。待血管内皮细胞生长至亚融合状态后，与肺癌细胞条件培养液或细胞粉碎液同时加入T N P-4 7 0 作用液(T N P-4 7 0浓度分别为：1 0“2，1 0。1 0，1 0 一，1 0 一g m 1)。用免疫细胞化学方法检测内皮细胞P C N A，F l k-1，F G F R 的表达。肿瘤细胞可合成和释放多种活性因子，促进其血管新生。其中血管内皮细胞生长因子(V E G F)、成纤维细胞生长因子(F G F s)是主要的促血管新生调节因子。许多恶性肿瘤细胞均有V E G F 及F G F s 表达的增多。V E G F 是一种分泌型糖蛋白细胞因子，体外培养时，其主要存在于培养细胞的条件培养液中。而F G F s 是一种非分泌型生长因子，合成后贮存于细胞的胞浆，可存在于体外培养细胞的粉碎液中。V E G F R-2 F l k 一1，F G F R 均为血管内皮细胞表面存在的受体酪氨酸激酶家族成员。本研究应用肺癌细胞条件培养液和细胞粉碎液刺激可见H U V E CP C N A 表达增加，表明两者均可刺激血管内皮细胞的增殖。T N P 4 7 0(0 一氯乙酰氨基甲酰烟曲霉素)是一类人工合成的烟曲霉素类衍生物，其在体内、外抑制肿瘤生长和转移的作用被认为与其抑制血管生成的作用密切相关。本研究表明，T N P-4 7 0作用后，由肺癌细胞诱导的内皮细胞P C N A，F l k 一1，F G F R 的表达均减弱，并呈剂量依赖关系。因此推测，T N P 4 7 0 抑制血管内皮细胞增殖的作用可能与其降低了血管内皮细胞表面的F l k-1，F G F R 的表达，进而削弱了酪氨酸激酶受体介导的细胞增殖途径有关。关键词 T N P-4 7 0；血管新生；血管内皮细胞；肺癌细胞 中图分类号 R 7 3 0 5 文献标识码 D 收稿日期 2 0 0 3 一0 3 一l O【修回日期 2 0 0 3 0 5 2 0 万方数据肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗瘤作用的影响瘤作用的影响作者：汪晓莺，梁志强，张一心，孙伟红，石佑琴作者单位：汪晓莺,梁志强,孙伟红,石佑琴(南通医学院免疫学教研室,江苏,南通,226001)，张一心(南通医学院附属医院外科,江苏,南通,226001)刊名：中国肿瘤生物治疗杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CANCER BIOTHERAPY年，卷(期)：2003,10(3)被引用次数：4次 参考文献(12条)参考文献(12条)1.朱学军;曹雪涛;于益芝 人外周血树突状细胞的体外扩增与鉴定 1997(04)2.王建华;童善庆;蒋玖 卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞某些细胞因子基因表达的研究 1999(01)3.Ridge JP;Di Rosa 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