基本技术实验教案-生物学531实验教学体系CAI课.docx

基本技术实验
电子教案

适用生物科学、动物科学专业

主讲：彭友林，郭春秋，熊大胜，刘良国

湖南文理学院 生物学基础实验教学中心
2008年4月
课程名称 基本技术实验
授课专业 生物科学、动物科学（本科）
授课教师 彭友林，郭春秋，熊大胜， 刘良国

主要参考文献：
刘凌云，郑光美主编. 普通动物学实验指导. 北京：高等教育出版社，1997.
解景田，赵静主编. 生理学实验（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002.
杨秀平主编. 动物生理学实验. 北京：高等教育出版社，2004.
杨芳炬主编. 机能学实验. 成都：四川大学出版社，2002.
樊继云，冯 逵，刘 燕编. 生理学实验与科研训练. 北京：中国协和医科大学出版社，2003.
王竹立，林明栋主编. 实验生理科学. 广州：中山医科大学实验生理科学教研室，2000.
北京微信斯达科技发展有限责任公司编. Pclab生物医学信号采集处理系统使用说明书. 2004.
马恒东主编. 动物生理学实验指导. 成都：四川科学技术出版社，2003.
韩秋生，徐国成，邹卫东 等主编. 组织胚胎学彩色图谱（第三版）.沈阳：辽宁科学技术出版社，2003.

学 时 分 配 表
序号
实验名称
时数
备注
实验1
光学显微镜及体视镜构造和使用
3

实验2
生物信号采集与分析技术

实验3
培养基制作以及灭菌消毒技术

实验4
细胞组织培养技术

实验5
生物切片技术

实验6
光谱分析技术*

实验29
称量、离心及微量移液技术
6
必开
实验30
图像采集与分析技术（CAI课件）

实验31
PCR技术（CAI课件）

实验32
电泳层析技术介绍（CAI课件）

实验43
分子生物学实验技术介绍（CAI课件）

实验1 光学显微镜及体视镜的构造和使用方法

一、实验目的
1、了解光学显微镜及体视镜的一般构造和性能；
2、学会正确地使用光学显微镜及体视镜，熟练地掌握对光，低高倍物镜的使用技术，以及显微镜的维护；
3、学会临时装片的制作和徒手切片。
二、重点与难点
正确地使用光学显微镜及体视镜，熟练地掌握对光，低高倍物镜的使用技术。
三、教学方法与手段
本次课主要采取讲授法和讨论法，在学生实验过程中辅以个别指导进行教学。
四、实验内容
1、光学显微镜的构造、使用方法及维护；
2、临时装片的制作及徒手切片的练习；
3、体视镜的一般结构及使用方法。
五、实验材料
洋葱（Allium cepa）根尖永久装片；洋葱（Allium cepa）鳞片叶；油菜（Brassica campestris）或水稻（Oryza sativa）花粉。
六、实验用品
普通光学显微镜、体视显微镜；镊子、载玻片、盖玻片、培养皿、纱布、吸水纸、擦镜纸、滴瓶、毛笔；碘液、水。
七、实验方法
（一）普通光学显微镜的构造、使用方法及维护
1、显微镜的构造
显微镜的基本结构可以分两部分，即光学部分与机械部分。
（1）光学部分
①物镜、②目镜、③聚光器、④虹彩光圈、⑤反光镜、⑥镜筒
（2）机械部分
①镜座、②镜柱、③镜臂、④载物台、⑤物镜转换器、⑥调焦螺旋
2、显微镜的使用方法
（1）正确安置显微镜、（2）对光、（3）低倍物镜的使用、（4）高倍物镜的使用
（5）浸油物镜的使用、（6）显微镜的使用练习、（7）用毕复原
3、显微镜的放大倍数
4、光学显微镜的显微测微法
（1）显微测微计
①镜台测微计、②目镜测微计
（2）测量方法
用目镜测微计测量细胞的大小时，先要用镜台测微计校正目镜测微计中每一格相当于多少微米，然后用目镜测微尺测量细胞的实际大小。具体方法如下：
①将镜台测微计放在载物台上，调节好显微镜，使其刻度清晰可见。
②再把目镜测微计放在目镜内的视野光阑上。
③调节台尺，使镜台测微计上的零点与目镜测微计上的零点相重叠，再找出这两个测微计的刻度第二次重叠的地方，并计算目镜测微计上的每一刻度相当多少微米。如目镜测微计第15格正对镜台测微计上的24小格时：
目镜测微计每小格的长度= μm ==16μm
④移去台尺，换上玻片标本观察，用目镜测微计测量视野中物体的大小（标本所占目镜的小格数×目镜测微计每小格的长度）。
在进行测量时如变换显微镜，或改变目镜与物镜的倍数时，都必须进行换算校正，其次为了测量的准确性，在换算及测量时，至少要测量三次，并求其平均值，得到精确的数值。
5、显微镜的维护
（1）显微镜是精密的光学仪器，使用时一定要严格地按规程进行操作。
（2）在使用过程中，如发生故障，应及时报告老师，以防损坏。
（3）要保持显微镜各部件的清洁，尤其是光学部分，切不可让镜头沾水或化学药剂，用后必须用干净柔软的绸布或镜头纸擦净。
（4）显微镜的存放要做到四防：防潮、防腐、防热、防撞击。
（二）临时装片的制作及徒手切片的练习
1、临时装片的制作
（1）准备、（2）取材、（3）盖上盖玻片、（4）染色、（5）观察
2、徒手切片的练习
（1）材料的选择
①材料不宜太硬或太软，一般选择发育正常、健康的幼茎、幼根或植物的叶片，所取材料应放入水中，防止徒手切片时萎蔫。
②若实验材料过于柔嫩，可用胡萝卜、土豆或塑料泡沫块等作支持物，把材料夹在其中切片；叶片可卷成筒状切片。
③材料大小：一般直径不超过5mm，长度以1.5-2.5cm为宜。
（2）徒手切片操作练习（以陆英（Sambucus chinensis）幼茎的横切为例）
①切片、②选片、③制作临时装片、④观察
（三）体视显微镜的一般结构及使用方法
1、体视镜的一般构造
2、体视镜的使用方法
3、体视镜的使用练习
八、作业与思考
（一）作业
l、简述光学显微镜的组成。
2、低、高倍物镜的使用各应注意哪些事项？
（二）思考题
1、在显微镜下用手移动标本，为什么前后、左右的方向与显微镜中见到的恰恰相反？
2、在制作临时装片时，应如何避免产生气泡？

实验2 计算机生物信号采集处理系统的认识及使用

计算机是一种现代化、高科技的自动信息分析、处理设备。随着电子计算机技术在生物、医学领域的广泛应用，使原先不易进行的某些生物信息的检测，变得简易可行。利用计算机采集、处理生物信息，让计算机进入机能学实验室已成为必然趋势。
计算机生物信号采集处理系统就是以计算机为核心，结合可扩展的软件技术，集成生物放大器与电刺激器，并且具备图形显示、数据存储、数据处理与分析等功能的电生理学实验设备。对生物信号采集系统的了解和熟练使用，是今后对完成生理学实验的数据和图形采集、储存和处理所必须具备的基本技能之一。

图1－1 Pclab生物医学信号采集处理系统
一、实验目的
1、熟悉计算机生物信号采集处理系统的基本原理及组成；
2、熟悉并掌握计算机生物信号采集处理系统的基本操作与使用方法。
二、实验原理
　　 现代生物机能实验系统的基本原理是：首先将原始的生物机能信号，包括生物电信号和通过传感器引入的生物非电信号进行放大（有些生物电信号非常微弱，比如减压神经放电，其信号为微伏级信号，如果不进行信号的前置放大，根本无法观察）、滤波（由于在生物信号中夹杂有众多声、光、电等干扰信号，这些干扰信号的幅度往往比生物电信号本身的强度还要大，如果不将这些干扰信号滤除掉，那么可能会因为过大的干扰信号致使有用的生物机能信号本身无法观察）等处理，然后对处理的信号通过模数转换进行数字化并将数字化后的生物机能信号传输到计算机内部，计算机则通过专用的生物机能实验系统软件接收从生物信号放大、采集硬件传入的数字信号，然后对这些收到的信号进行实时处理，一方面进行生物机能波形的显示，另一方面进行生物机能信号的实时存贮，另外，它还可根据操作者的命令对数据进行指定的处理和分析，比如平滑滤波，微积分、频谱分析等。对于存贮在计算机内部的实验数据，生物机能实验系统软件可以随时将其调出进行观察和分析，还可以将重要的实验波形和分析数据进行打印。

图1－2 Pclab系统工作原理模式图
计算机生物信号采集处理系统由硬件和软件两大部分组成。硬件主要完成对各种生物电信号（如心电、肌电、脑电）与非生物电信号（如血压、张力、呼吸）的采集。并对采集到的信号进行调整、放大，进而对信号进行模/数（A/D）转换，使之进入计算机。软件主要用来对已经数字化了的生物信号进行显示、记录、存储、处理及打印输出，同时对系统各部分进行控制，与操作者进行对话。
计算机生物信号采集处理系统在功能上基本可替代原来的刺激器、放大器、记录仪、示波器等。此外，引进模拟实验系统软件还可以演示简单重复的印证性实验，在动手前预习实验，甚至代替部分实验。微机生理系统已成为生理实验教学与研究的一个发展方向。
1、 传感器和放大器
生物所产生的信息，其形式多种多样，除生物电信号可直接检取外，其他形式的生物信号必须先转换成电信号，对微弱的电信号还需经过放大，才能作进一步的处理。生物信号采集处理系统中的刺激和放大器都是由计算机程控的，其工作原理和一般的刺激器、放大器完全一样。主要的区别在于一般仪器是机械触点式切换，而生物信号采集处理系统是电子模拟开关，由电压高低的变化控制，是程序化管理，提高了仪器的可靠性，延长了仪器的寿命。
2、生物信号的采集
计算机在采集生物信号时，通常按照一定的时间间隔对生物信号取样，并将其转换成数字信号后放入内存，这个进程称为采样。
(1)Ａ/D转换器　生物信号通常是一种连续的时间函数，必需转换为离散函数，再将这个离散的函数按照计算机的“标准尺度”数字化，以二进制表达，才能被计算机所接受。Ａ/Ｄ转换设备能提供多路模/数转化和数/模转换。Ａ/Ｄ转换需要一定时间，这个时间的长短决定着系统的最高采样速度。Ａ/Ｄ转换的结果是以一定精度的数字量表示，精度愈高，（曲线的）幅度的连续性愈好。对一般的生物信号采样精度不应低于12位数字。转换速度和转换精度是衡量Ａ/Ｄ转换器性能的重要指标。
(2)采样　与采样有关的参数包括通道选择、采样间隔、触发方式和采样长度等方面。
①通道选择　一个实验往往要记录多路信号，如心电、心音、血压等。计算机对多路信号进行同步采样，是通过一个“多选一”的模拟开关完成的。在一个很短暂的时间内，计算机通过模拟开关对各路信号分别选通、采样。这样，尽管对各路信号的采样有先有后，但由于“时间差”极短暂，因此，仍可以认为对各路信号的采样是“同步”的。
②采样间隔　原始信号是连续的，而采样是间断进行的。对某一路信号而言，两个相邻采样之间的时间间隔称为采样间隔。间隔愈短，单位时间内的采样次数愈多。采样间隔的选取与生理信号的频率也有关，采样速率过低，就会使信号的高频成分丢失。但采样速率过高会产生大量不必要的数据，给处理、存储带来麻烦。根据采样定律，采样频率应大于信号最高频率的2倍。实际应用时，常取信号最高频率的3～5倍来作为采样速率。
③采样方式　采样通常有连续采样和触发采样两种方式。在记录自发生理信号（如心电、血压）时，采用连续采样的方式。而在记录诱发生理信号（如皮层诱发电位）时，常采用触发采样的方式。后者又根据触发信号的来源分为外触发和内触发。
④采样长度　在触发采样方式中，启动采样后，采样持续的时间称为采样长度。它一般应略长于一次生理反应所持续的时间。这样既记录到了有用的波形，又不会采集太多无用的数据造成内存的浪费。
3、生物信号的处理
计算机生物信号采集处理系统因其强大的计算机功能，可起到滤波器的功能，而且性能远远超过模拟电路，恢复被噪音所淹没的重复性生理信号。人们可以测量信号的大小、数量、变化程度和变化规律，如波形的宽度、幅度、斜率和零交点数等参数。做进一步的分类统计、分析给出各频率分能量（如脑电、肌电及心率变异信号）在信号总能量中所占的比重，从而对信号源进行定位。对实验结果可以用计数或图形方式输出。对来自摄像机或扫描仪的图像信息经转换后，也可输入计算机进行分析。所以计算机生物信号采集处理系统，不仅具备了刺激器、放大器、示波器、记录仪和照相机等仪器的记录功能外，而且还兼有微分仪、积分仪、触发积分仪、频谱分析仪等信号分析器的信息处理功能。为节省存储空间，计算机可对其获得的数据按一定的算法进行压缩。
4、动态模拟
通过建立一定的数学模型，计算机可以仿真模拟一些生理过程，例如激素或药物在体内的分布过程、心脏的起搏过程、动作电位的产生过程等均可用计算机进行模拟。除过程模拟外，利用计算机动画技术还可在荧光屏上模拟心脏泵血、胃肠蠕动、尿液生成及兴奋的传导等生理过程。
三、实验内容
1、 学习计算机生物信号采集处理系统的组成及原理。
2、 计算机生物信号采集处理系统的基本操作与使用。
四、实验方法与步骤（以Pclab－UE为例介绍）
Pclab-UE是集放大器、采集卡、刺激器为一体的外置式USB接口高性能的生物医学信号采集处理系统。
1.生物医学信号放大器使用介绍
硬件放大器分前后两个面板，前面板用来做常规，后面板主要用来连接线路，其中前面板的各部分功能如下：

PCLAB-UE生物医学信号采集处理系统
电源
开
关
通道1
通道2
通道3
通道4
刺激输出
5V
10V
100V

电源开关用来打开或关闭硬件设备，注意在采样的过程当中不要关闭此电源。
通道1、通道2、通道3、通道4分别是四个独立的放大器通道，其中通道3是专用的心电通道，不能进行其他的信号采集。
刺激输出有两个插口，上方的是0~5V档输出和0~10V档输出，选择不同档刺激输出指示灯会随之变化。
★下方是0～100V档输出，红色标记是提醒实验人员注意高压危险！
后面板的各部分功能如下：
北京微信斯达科技发展有限责任公司
USB接口
监听输出
地线接口
电源接口

USB接口用来插接USB线的小方端口，USB线的另一端接入计算机的USB接口。
监听输出口是与音箱的音频线相连，它是用来监听神经放电的声音。
监听输出口旁边的口是与串口线连接，它是用来传输刺激命令的。
地线接口用来接地线以减少外界环境对有效信号的干扰。
电源接口用来接入电源线，要求使用交流市电220V，50Hz。
★若是前面板电源灯不亮，通常是保险管烧了。

2. Pclab-UE应用软件窗口界面功能介绍
Pclab-UE应用软件运行时窗口如下图：

界面自上而下为：
（1）标题栏：用于提示实验名称、文件存盘路径、文件名称及“最小化”、“还原”、“关闭”按钮。
（2）菜单栏：用于按操作功能不同而分类选择的操作。包含如下主菜单名称：
A、文件：包含所有文件操作，如打开、存盘、打印等；
B、编辑：包含对信号图形的编辑功能，如复制、清除等；
C、视图：包含对可视部分的控制及信号反相、锁定等；
D、设置：对系统运行有关的设置功能进行选择；
E、数据处理：对采集后的数据进行滤波处理、导入Excel、微分、积分等；
F、帮助：包括帮助主题、版权信息与公司网址等。
（3）工具栏：提供了最常用的快捷工具按钮，依次为：新建、打开、记录存盘、选择存盘、打印预览 、复制、取消、采样、记录、刺激、面板切换、测量、锁定。

（4）实时计算工具栏：提供了实时计算数据的结果。

（5）采样窗：四个采样窗分别对应放大器的四个物理通道，用于采样时的波形显示、数据处理、标记、测量等功能，是主要的显示区域。
（6）状态栏：从左到右依次为命令提示区、状态提示区、标记或帧数提示区、采样时间、硬件状态提示区。

（7）控制面板：位于整个界面的最右侧，是各通道的控制中心，针对当前通道进行不同的控制调节，如下图所示。

（8）计算结果显示面板；浮于整个窗口的上方，用于对选定的波形进行计算分析并显示结果，如下图所示。

3.一般生物医学信号采集的软件设置操作
用Pclab-UE生物医学信号采集处理系统做好电生理实验的第一步就是在开始实验之前要做好信号采样的软件设置工作。这就相当于使用传统仪器开始实验前，要将仪器面板上的所有重要开关打开，所有重要按钮设定大体和传统仪器的位置一样。不过，使用Pclab-UE将会使您轻松自如，具体操作如下：
第一步，执行“设置”菜单中的“采样条件”菜单项，打开采样条件设置窗口见下图：

该窗口中有四个下拉列表框，分别用来设置显示方式、触发方式、采样频率、通道个数。
（1）其中采样频率可以根据实验做出选择，通常是变化快的选择采样频率高一些（如：减压神经放电实验可以选择10KHz），变化慢的选采样择频率底一些（如：血压、呼吸、张力等实验可以选择1KHz）。
（2）通道个数用来确定实验中使用通道的个数，选择1个通道，则是第一通道；选择2个通道，则是第一和第二通道；选择3个通道，则是第一、二和第三通道；选择4个通道，则是全部的通道。
（3）显示方式：有记录仪方式和示波器方式两种，可根据实验的需求来选择显示方式。
I、“记录仪”方式：用来记录变化较慢，频率较低的生物信号。如电生理实验中的血压、呼吸、张力、心电等。其扫描线的方向是从右向左，连续滚动，与传统仪器的二导记录仪相一致。它的采样频率从20Hz到50KHZ，11档可选。一般上述典型实验1KHz左右。此时无触发方式选择。
Ⅱ、“示波器”方式：用来记录变化快，频率高的生物信号。如电生理实验中的神经干动作电位、AP传导速度、心室肌动作电位等。其扫描方向是从左向右，一屏一屏的记录，与传统的示波器相一致。它的采样频率从1KHz到200KHz。★在200KHz采样频率只允许单窗口运行。
（4）触发方式：有自动触发和刺激器触发，当使用记录仪方式显示时，此功能自动关闭（变成灰色）；若使用示波器方式，还可以进一步选择是自动触发还是刺激器触发，如果是刺激器触发则 的启停由按钮来控制。
第二步，为每个通道在控制面板的通道功能列表框中选择对应的实验类别，同时确定要计算的内容。如图：

第三步，适当调节输入范围，时间常数，低通滤波，陷波，纵向放缩，时间单位等参数。
（1）“输入范围”（也称“放大倍数”或“增益”），它是对输入进去的生物信号进行放大。如下图：（即50倍～50000倍）

（2）“时间常数”它有两重功能：一是用来控制交直流（即控制电信号与非电信号），非电信号（如：血压、呼吸、张力等）时它是处于“直流”状态；二是在做电信号实验时它相当于高通滤波。如下图:

★高通滤波是指高于某种频率的波形可以通过，时间与频率是倒数关系
（3）“低通滤波”是指低于某种频率的波形可以通过，适合于滤除含有某种固定频率的周期性干扰信号。
（4）“50Hz陷波”,是指当采样曲线中有干扰出现时,并且这种干扰有一定频率的周期性。
（5）“纵向放缩”是指对当前通道的波形进行纵向拉伸、压缩。其与“时间常数”是有区别的，它是对采样后的波形进行人为的放大、压缩，对生物信号本身没有真正的放大。
（6）“时间单位”是指对当前通道的波形进行横向拉伸、压缩，同时也对当前走纸通道速度进行调节。
第四步，如果使用直流状态，即使用传感器进行非电信号实验时，要对通道进行调零，执行“设置”菜单中的“当前通道调零”菜单项进行自动调零如图：（若是偏离太大，则先调传感器的电位器）

第五步，对非电信号如血压、张力等可以进行定标，执行“设置”菜单中的“当前通道定标”菜单项进行定标。
第六步，单击工具栏上的按钮开始采样，在采样的过程中可以实时调整输入范围、低通滤波、纵向放缩等各项指标以使波形达到最好的效果，再次单击此按钮则可停止采样。
4. 刺激器的设置与调整
为了方便电生理实验，Pclab-UE系统内置设有一个由软件程控的刺激器，该刺激器所提供的功能与性能指标完全能够满足实验的要求，且工作稳定、可靠。恒压源设计，刺激输出电压不会因刺激对象阻抗变化而变化，共分为0-5V；0-10V； 0 -100V三档，其中每一档的输出电压的步长都不相同。共有七种不同的刺激方式，分别为单刺激、串刺激、周期刺激、自动幅度、自动间隔、自动波宽、自动频率。不同的实验选择不同刺激方式和刺激幅度会令实验效果十分理想。为了正确使用刺激器可进行如下设置：
第一步：打开刺激器设置面板，可以通过“设置”菜单下的“刺激器设置”菜单项来实现，也可以通过工具栏上的按钮在控制面板和刺激面板间进行切换，此时刺激面板就会代替放大器控制面板以方便您进行刺激器的参数设置。刺激面板如图：

第二步：选择适当的刺激模式，调整相应的波宽、幅度、周期、延时、间隔等参数，然后单击工具栏上的“刺激”按钮即可发出所要刺激。
第三步：刺激标记想要显示在哪个通道上，就在相对应的通道上打钩，这样在当前通道上就可以显示相应的刺激幅度、波宽与标记。
5.实验结果的存盘及打印输出
（1）为了保证实验数据的完整保存，Pclab-UE系统提供了强大的数据保存机制，并且采用了标准的文件存盘方式。根据用户要保存的目的不同，本系统对数据的保存分三种，一种是整个实验过程中的全部数据的保存；另一种是通过记录保存；还有一种是对做完实验后的选择保存。下面分别予以介绍。
I、全部数据保存是指从开始波形采样就对整个实验过程中所采集的全部波形数据的保存，其目的是在实验结束后可再现实验过程。这个保存机制和微软的Word、Excel相一致。一是通过停止采样后“文件”菜单中的“所有实验数据保存”菜单项来实现的；二是在“新建实验”或关闭Pclab-UE界面时系统用户只需要输入一个文件名即可，文件将被自动存放在本系统安装后的UserData文件夹中以便用户集中管理。
II、记录保存是针对实验过程中出现的稳定而平滑的波形进行保存的，它可以保存一段时间内的较好的波形，其操作方法是当出现较好的或用户认为需要记录的波形后按下工具栏上的“记录”按钮，从此刻开始的波形将会被记录起来，直到用户再次单击此按钮停止记录为止。在采样的过程当中用户可以多次通过此按钮来记录数据，当停止采样后，用户可通过工具栏上的“存盘”按钮或“文件”菜单中的“实验记录保存”菜单项来保存所记录下来的文件，用户只需要输入文件名即可，文件将被自动存放在本系统安装后的UserData文件夹中以便用户集中管理。
III、选择保存是对做完实验后未及时通过记录保存，采取事后保存的一种方式。它是对采样后的波形进行涂黑，然后按工具栏的“选存”按扭就会弹出一个对话框让您输入文件名。接下去再涂黑按“选存”就不会出现对话框，因为它是将后面涂黑的波形与前面涂黑的波形保存在同一个文件名下。
通过以上三种方式，可以放心地保存实验所采样的数据，若是Pclab-UE软件下载了保存在UserData文件夹的数据也不会丢失。
（2）对于采样波形的打印输出，可以先通过工具栏上的“预览”按钮或“文件”菜单中的“打印预览”菜单项来进行波形的预览，然后通过“文件”菜单中的“打印”菜单项直接打印输出。（也可以通过打印预览中的“打印”直接进行打印输出）。
五、作业与思考
（一）简述计算机生物信号采集处理系统的组成及基本原理。
（二）试述计算机生物信号采集处理系统的基本操作流程。

实验3 培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术

一、实验目的与要求
1、学习细菌、放线菌及真菌常规培养基的制备方法；
2、学习微生物操作中常用的灭菌与消毒方法；
3、掌握高压蒸汽灭菌锅的灭菌原理及使用方法；
4、学习并掌握棉塞制作及常用器皿包扎的方法；
5、学习并掌握无菌操作接种技术要点。
二、重点与难点
1、高氏一号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基分别属于哪种类型的培养基？分别适合培养哪种微生物？
2、使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时必须排尽锅内的冷空气，为什么？
3、掌握无菌操作与斜面接种技术要点。
三、教学方法与手段
本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。实验过程中1-7项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。
四、实验内容
1、 牛肉膏蛋白胨培养基的制备；
2、 高氏一号合成培养基的制备；
3、 马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备；
4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎；
5、 常用灭菌和消毒方法简介；
6、 用高压蒸汽灭菌锅对培养基和器皿进行灭菌；
7、 无菌操作与斜面接种技术。
五、实验材料
1、药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaC1、10%NaOH溶液、10%盐酸溶液；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCI、FeSO4·7H2O、琼脂、10%NaOH 溶液、10%盐酸。
2、材料：新鲜马铃薯、蔗糖或葡萄糖。
六、实验用品
小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、100mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH试纸、分装漏斗、棉花、棉皮圈、天平、100 mL烧杯、标签纸、电炉、菜板、小刀、纱布、18mm×180mm试管。
七、实验方法
（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备
1、实验原理
牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和测数等。
2、培养基配方
牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaC1 5.0g、琼脂20.0g、自来水1000 mL、pH7.0。
3、操作步骤
⑴ 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，加50 mL自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。
⑵ 向小铝锅中加入500 mL自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次。加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌。
⑶ 加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL。
⑷ 用玻棒沾少许液体，用pH试纸测定pH值。用NaOH或HC1调至pH7.0。
⑸ 分装漏斗分装于10mm×180mm试管中，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好。★是否可以搁置几天后进行灭菌？
⑹ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
⑺ 灭菌后摆放斜面。
（二）高氏一号合成培养基的制备
1、 实验原理
高氏一号培养基是一个合成培养基，常用于分离和培养放线菌。
2、 培养基配方
可溶性淀粉20.0g、硝酸钾1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL、pH7.2～7.4。
3、操作步骤
⑴ 用搪瓷杯量取自来水500 mL置小铝锅中，在电炉上加热。
⑵ 根据培养基配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。其中可溶性淀粉称入100 mL烧杯中，加入50 mL自来水调成糊状，待培养液沸腾时及如铝锅中，边加边搅拌，以防糊底。
⑶ 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至熔化，补足1000 mL水量，调pH7.2～7.4。
⑷ 趁热分装于18mm×180mm试管，斜面试管每管8 mL，若倒平板则每管装15 mL，装量根据需要而定。
⑸ 塞好棉塞，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好，贴好标签。
⑹ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
⑺ 若有斜面试管，在灭菌后及时摆放斜面。
（三）马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备
1、实验原理
马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基，常用于培养多种真菌。
2、培养基成分
去皮的马铃薯200g 、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂20g、自来水1000 mL、pH 自然
3、操作步骤
⑴ 称取去皮新鲜马铃薯200g 切成1cm 见方小块放于小铝锅中，加1000m L 自来水，置电炉上煮沸20min 后，用双层纱布过滤。滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸。
⑵ 加入称好的蔗糖、琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，并补足水量至1000m L。
⑶ 趁热用分装漏斗分装于18mm×180mm试管，斜面以8 m L为宜，柱状15m L为宜。分装完毕后做好棉塞，装入小试管筐并捆好，写好标签。
⑷ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。若需摆斜面，灭菌后趁热摆成斜面。
（四）棉塞的制作及玻璃器皿的包扎
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口或三角瓶口完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内（图示）。做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。做棉塞过程如图所示。
此外,现配现用的培养基和无菌水，还可使用硅胶橡胶塞或聚丙烯塑料试管帽。
在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞。所谓通气塞就是几层纱布，一般8层，相互重迭而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生长或发酵。
（五）常用灭菌和消毒方法
采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌（sterilization）。消毒（disinfection）则是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞，实际上是部分灭菌。
在微生物实验、生产和科学研究工作中，需要进行微生物纯培养，不能有任何外来杂菌。因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。
实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理的达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是是使微生物的蛋白蛋和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比干热灭菌好。这是因为湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。
1、干热灭菌
火焰灭菌
微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。
干热灭菌
用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160oC～170oC加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌目的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，凡不适于用其它方法灭菌而又能耐温的物品都可用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。干热灭菌箱的构造（图示）。
⑴ 干热灭菌操作步骤
①装箱：将准备灭菌的玻璃器材洗涤干净、晾干，用锡箔纸包裹好或放入灭菌专用的铁盒（或铝盒）内，放入干热灭菌箱，关好箱门。
②灭菌：接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，待温度升至80oC～100oC时关闭排气孔。继续升温至160oC～170oC时，开始计时。恒温1～2h。
③灭菌结束后，断开电源，自然降温至60oC，打开干热灭菌箱门，取出物品放置备用。
⑵ 注意事项
①灭菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。
②灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。
③灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。
④灭菌温度恒定在160～170 oC为宜。温度超过180 oC，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。
⑤降温时，需待温度自然降至60oC以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
2、湿热灭菌
湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸气灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸气对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维护蛋白质三维结构的氢键和其它相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比（表示）；②热蒸汽热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量，故可迅速提高灭菌物体温度。
多数细菌和真菌的营养细胞在60oC左右处理15min后即可杀后，酵母菌和真菌的孢子要耐热些，要用80oC以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120oC下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。
常压蒸汽灭菌：
（1）常压蒸汽灭菌方法
常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质，如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏（Aruokd）灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100oC，压力为常压，大多数微物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全灭菌。
蛋白质含水量与其凝固温度的关系
蛋白质含水量/% 蛋白质凝固点/oC
50 56
25 74～80
18 80～90
6 145

①巴氏消毒：是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌，如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60～85oC下处理15～30min。具体的方法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63oC下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速，用于牛奶消毒时只要在85oC下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体——伯氏考克斯氏体（一种立克次氏体）。
②间歇灭菌法：又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100oC下蒸煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20～30oC下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌（121oC）后会发生熔化，而在100oC的温度下则呈结晶状。
③蒸汽持续灭菌法：微生物制品土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100oC时，持续加热3～6h，杀死绝大部分芽胞和全部营养体，达到灭菌目的。
以上三种方法通过是在无高压蒸汽灭菌条件的地方（如农村）使用。
（2）灭菌过程中注意事项
①使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100oC后，开始计算灭菌时间，此时锅顶上应有大量蒸汽冒出。
②为利于蒸汽穿透灭菌物，锅内或蒸笼上堆放物品不宜过满过挤，应留有空隙。固体曲料大量灭菌时，每袋以1.5～2.0kg为宜，料袋在锅内用蓖子分层隔开，不能堆压在一起。
③火大水足才能保证汽足，蒸锅里应先把水加足。一次持续灭菌时，如锅内盛水量不能维持到底，应在