基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制.pdf

广 东 药 科 大 学 学 报Journal of Guangdong Pharmaceutical UniversityJul,2023,39(4)收稿日期：2023-04-04基金项目：国家重点研发计划“中医药现代化研究重点”专项（2018YFC1707100）；广东省重点领域研发计划项目（2020B1111120002）；广东省中医药局科研项目（20221214）；广东省医学科学技术研究基金项目（B2017098）作者简介：姜帆（2000），男，2022级在读硕士，研究方向：中药炮制原理与饮片质量标准化研究，Email：通信作者：王秋红（1969），女，教授，主要从事中药炮制原理与饮片质量标准化研究，Email：。基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制姜帆1，李慧敏1，林婉娜1，洪菲惠2，陈雨婵2，彭东辉2，曾元宁1，王长福1，王秋红1，2（1.广东药科大学中药学院/广东省中药饮片规范化炮制工程技术研究中心，广东 广州 510006；2.黑龙江中医药大学/教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）摘要：目的 基于网络药理学及动物实验验证黄芪桂枝五物汤（HGWD）治疗类风湿关节炎（RA）作用机制。方法 采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），结合吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion）功能筛选HGWD主要活性成分并预测其靶点；通过GeneCards、DrugBank、DisGeNET数据库获取RA主要靶点，利用String平台进行药物疾病交集靶点蛋白相互作用分析；采用Metascape平台分析药物靶点与疾病基因交集，筛选HGWD治疗RA的潜在靶点、生物过程及潜在通路。利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-靶点-通路”网络图。SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、HGWD组，模型组用牛CII 胶原溶液与弗氏佐剂CFA（或IFA）造模，通过记录大鼠关节炎指数，HE染色检测大鼠踝关节病理形态变化，ELISA法检测HGWD血清炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素 6（IL-6）的影响，蛋白免疫印迹法验证靶点蛋白的表达。结果 网络药理学共筛选出HGWD活性成分共39个，其作用靶点共275个，与RA疾病交集靶点共为183个；其中经筛选得到关键靶点AKT1、TNF-、MAPK1、STAT3及IL-6等。动物实验结果表明与模型组比较，HGWD治疗组能够缓解RA的滑膜增生和炎症，减轻大鼠脚部肿胀程度；HGWD可抑制炎症因子TNF-、IL-1及IL-6表达，并且可下调JAK2、STAT3蛋白表达水平。结论 通过网络药理学及动物实验表明HGWD可通过参与JAK2、STAT3免疫炎症相关通路发挥治疗RA作用。关键词：网络药理学；类风湿关节炎；黄芪桂枝五物汤；JAK2/STAT3信号通路中图分类号：R285文献标识码：A文章编号：2096-3653（2023）04-0049-10DOI：10.16809/ki.2096-3653.2023040401Study on mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritisbased on network pharmacologyJIANG Fan1,LI Huimin1,LIN Wanna1,HONG Feihui2,CHEN Yuchan2,PENG Donghui2,ZENG Yuanning1,WANGChangfu1,WANG Qiuhong1,2*（1.School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Engineering TechnologyResearch Center for Standardized Processing of Chinese Materia Medica,Guangzhou 510006,China;2.HeilongjiangUniversity of Chinese Medicine,Key Laboratory of Northern Medicine Foundation and Application under Ministry of Education,Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Pharmacodynamic Material Base,Harbin 150040,China）*Corresponding author Email:Abstract:Objective To explore the effect of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction(HGWD)in the treatment ofrheumatoid arthritis(RA)based on network pharmacology and animal experiments.Methods The systemspharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine(TCMSP),combined with absorption,distribution,metabolism and excretion functions,was used to screen the main active components of HGWD and广东药科大学学报第39卷predict its targets.The main targets of RA were obtained through GeneCards,DrugBank,and DisGeNET databases,and the String platform was used for protein interaction analysis of drug disease intersection targets.TheMetascape platform was used to analyze the intersection of drug targets and disease genes,and to screen forpotential targets,biological processes and potential pathways for the treatment of RA by HGWD.The drug-target-pathway network diagram was built by using Cytoscape3.7.2 software.SD rats were randomly divided into thenormal group,the model group,positive drug group and HGWD group.The model group was modeled by usingbovine CII collagen solution and Freunds adjuvant CFA(or IFA).The arthritis index of the rats was recorded,HEstaining was used to detect pathological changes in the ankle joint of the rats,ELISA was used to detect TNF-,IL-1 and IL-6,and western blotting was used to verify the expression of target proteins.Results A total of 39 activeingredients of HGWD were screened in network pharmacology,with a total of 275 targets of action and 183targets that intersect with RA diseases.Among them,the key targets AKT1,TNF-,MAPK1,STAT3 and IL-6were screened.Compared with the model group,HGWD treatment alleviated synovial hyperplasia andinflammation in RA,and reduced the degree of foot swelling in rats.Meantime,HGWD inhibited the expressionof inflammatory factors TNF-,IL-1 and IL-6,and down-regulated the expression of JAK2 and STAT3 proteins.ConclusionHGWD can exert therapeutic effects on RA by participating in JAK2 and STAT3 immuneinflammation related pathways based on network pharmacology and animal experiments.Key words:network pharmacology;rheumatoid arthritis;Huangqi Guizhi Wuwu Decoction;JAK2/STAT3signaling pathway类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一类病因复杂、以慢性滑膜炎为症状的慢性系统性疾病。其特征是手、足小关节的对称性、侵袭性关节炎症，常伴有关节外器官受累，严重可致关节畸形及功能丧失。研究1指出滑膜组织是一种位于关节腔内的膜性器官，在RA的关节破坏中起关键作用。黄芪桂枝五物汤（Huangqi Guizhi Wuwu Decoction，HGWD）出自 金匮要略，由黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣组成，具有和血痛痹、益气温经的功效。研究表明 HGWD可有效改善 RA引起的关节肿胀和晨僵时间等症状2-3，但HGWD治疗RA的作用机制尚无系统阐明4。因此，本研究通过网络药理学预测HGWD治疗RA的主要靶点及生物工程，并通过动物实验验证 HGWD治疗 RA的相关作用靶 点，揭 示 了 HGWD 治 疗 RA 的 作 用 机 制，为HGWD的临床应用奠定基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器黄芪、桂枝、白芍（购自圻晖药业有限公司，批号为2009271、2009272、2009273）；大枣、生姜（购自广州清平中药材市场，批号为 2009271、2009274），经广东药科大学王长福副教授鉴定符合2020年版中国药典 规范；牛型胶原溶液（美国Chondrex公司，批号20022）；完全弗氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）、弗氏不完全佐剂（Freunds Incomplete Adjuvant，IFA）（美国Sigma公司，批号F5881、F5506）；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）（上海上药信谊药厂有限公司，批号 036200301）；大鼠 IL-1、IL-6、TNF-酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司，货号分别为MM-0046R1、MM-0190R1、MM-0195R1）；GAPDH 一抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号 AF1282、AF1186）；STAT3一抗（上海碧云天生物技术有限公司，批号AF1492）；JAK2一抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号 BM4165）、HRP 标记的山羊抗小鼠抗体、HRP 标记的山羊抗兔抗体、BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号 A0216、A0208、P0012）；HE染液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号G1003）。Milli-QadvantageA10超纯水系统（广州皇河科技有限公司）；Chem Studio PLUS超敏多功能成像仪（德国analytikjena耶拿公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）等。1.2 动物饲养与造模56周龄 SPF级 SD雄性大鼠 50只，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002，饲养于广东省医学实验动物中心SPF级别实验环境，适应性喂养1周后开展实验，实验通过广东省医学实验动物中心伦理委员会审查，编号为C202112-04。大鼠经适应性喂养后，随机选取8只作为空白对照组，余下建立胶原诱导型（collagen-inducedarthritis,CIA）模型5，将牛CII 胶原溶液与 CFA（或50第4期姜帆，等.基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制IFA）低温等比例混合，第1次免疫在大鼠尾部选取3点皮下注射 0.2 mL牛 CII+CFA，第 2次免疫于第 1次注射 8 d 后在尾部不同部位皮下注射 0.1 mL 牛CII+IFA。第2次免疫后每周进行关节炎指数AI评分，并做记录。1.3 黄芪桂枝五物汤的配制取黄芪、桂枝、白芍、大枣、生姜药材饮片，按照质量比为3 3 3 4 6的比例混合后，加入至10倍量的去离子水中浸泡30 min，煎煮3 h，重复2次，合并煎液，减压浓缩得到质量浓度为 2.0 g/mL 的煎煮液，-20 C保存备用。1.4 动物分组及给药大鼠建立CIA模型后，以关节炎指数评分AI3判断造模是否成功。将24只造模成功的大鼠随机分为3组：模型组（CIA）、甲氨蝶呤组（MTX）、黄芪桂枝五物汤（HGWD）组。另设正常组，每组 8只。根据 医学实验动物学 中实验动物给药用量6，采取大鼠灌胃给药，甲氨蝶呤给予 0.13 mg/（kgd），HGWD组给予黄芪桂枝五物汤5.13 g/（kgd），正常组及模型组每日给予同等剂量生理盐水，给药28 d。1.5 关节炎指数AI评分关节炎指数AI评分以大鼠两后足累计评分为总分，评分标准见表1。1.6 病理切片检测大鼠踝关节4%（）多聚甲醛中固定，10%（）乙二胺四乙酸脱钙2个月，各梯度乙醇及二甲苯脱水透明，置于二甲苯和石蜡中透蜡进行包埋，4 m切片进行染色后中性树脂封片，在光学显微镜下观察其组织病理形态变化。1.7 ELISA检测大鼠血清中指标含量取大鼠血清，按照ELISA试剂盒的说明书，测定大鼠血清中的IL-1、IL-6、TNF-水平。1.8 黄芪桂枝五物汤活性成分收集及潜在靶点预测通过中医药系统药理平台TCMSP寻找黄芪桂枝五物汤5味中药化学成分，根据口服利用度（oralbioavailability，OB）30%且类药性（drug-likeness，DL）0.18进行活性成分靶点筛选以获得活性化合物及其作用的蛋白的靶点，并根据已有文献对活性化合物靶点进行补充。得到活性成分后，利用Uniprot 蛋白质数据库（https：/www.uniprot.org）对活性成分靶点进行标准化处理8-9。1.9 RA相关靶点预测以“Rheumatoid arthritis”、“RA”为关键词，借助GeneCards 数据库10（https：/www.genecards.org）、DRUGBANK数据库11（https：/www.drugbank.ca）和DisGeNet 数据库12（https：/www.disgenet.org）寻找疾病靶点。在GeneCards数据库中，Score值越高代表该靶点与疾病联系越密切，合并3个数据库的靶点后，删除重复基因，即可得到RA疾病靶点。1.10 黄芪桂枝五物汤治疗潜在治疗靶点的筛选绘制韦恩图，得二者交集靶点，而后将交集靶点提交至STRING11.0数据库构建蛋白互作（proteinprotein interaction network，PPI）网络，将生物种类设为“Homo sapiens”，最小互作用阈值设定为“highest confidence”（0.9），其余为默认设置。导出结果保存为TSV文件，将其导入Cytoscape 3.7.2软件，对该网络进行拓扑分析。其中节点的大小、颜色的深浅变化代表度值的大小，并根据节点的度值筛选出核心靶点13。1.11黄芪桂枝五物汤治疗RA潜在靶点的生物过程分析将 HGWD 治 疗 RA 的 靶 点 录 入 Metascape（http：/metascape.org/gp/index.html）平台，对HGWD与 RA 疾病共有的关键靶点进行基因本体（geneontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，研究其治疗RA的作用靶点及相关信号通路分析，根据校正后P值，P值越小，显著性越强，筛选出相关性前20的分子功能及KEGG通路14。1.12黄芪桂枝五物汤治疗RA靶点与通路网络图的构建将以上筛选结果录入到 Cytoscape3.7.2 构建HGWD 活性成分-靶点-通路网络图，利用 CytoScape3.7.2 内置工具分析有效成分及靶点的网拓扑参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。1.13 Western blot验证靶点蛋白取大鼠膝关节滑膜组织，加入RIPA裂解液，冰上裂解后，12 000 r/min，离心 30 min，取上清。经BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样量为40 g，于8%表1 关节炎指数AI评分标准7Table 1 Arthritis index AI scoring criteria评分01234标准正常足趾关节红肿有多个足趾关节或趾跖关节肿胀踝关节以下的足爪肿胀全部足爪肿胀51广东药科大学学报第39卷SDS-PAGE凝胶上样，电泳80110V恒压，1h，320mA恒流3 h转膜，经5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤后，4 过夜孵育一抗（稀释体积比1 1 000），TBST洗涤，室温孵育二抗（稀释体积比1 2 000）2 h，TBST洗涤后，将膜置于多功能成像仪，加入显影液曝光成像，拍照记录并使用Image J软件进行灰度值的分析对比。1.14 统计学处理实验数据均以xs表示，采用t检验。经Graphpad Prism7统计软件处理，显著性One-way ANOVA分析，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 药物活性成分筛选通过TCMSP及相关文献并根据生物口服利用度 OB30%，类药性 DL0.18标准筛选，获得活性成分黄芪20种，桂枝7种，白芍13种，大枣26种，生姜5种，合并删除重复值后获得黄芪桂枝五物汤活性成分39种，见表2。2.2 黄芪桂枝五物汤活性成分潜在作用靶点的收集使用Uniprot转换取出重复值后获得HGWD潜在作用靶点275个。使用Cytoscape 3.7.2软件绘制出活性成分与作用靶点的相互作用关系网络图。见图1。2.3 黄芪桂枝五物汤治疗RA核心靶点收集经筛选后RA疾病靶点共3 756个，HGWD靶点共275个，故HGWD活性成分靶点与RA疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，得到共有靶点183个。将共有靶点提交至STRING11.0平台，得到PPI蛋白互作网络图，导入Cytoscape3.7.2软件对该网络进行拓扑分析，不同颜色的圆形节点为不同药物的活性成表2 黄芪桂枝五物汤活性成分Table 2 Active ingredients of HGWD编号AHQ1HQ2HQ3HQ4HQ5HQ6HQ7HQ8HQ9HQ10HQ11BHQ12GZ1CDEGZ2BS1BS2BS3DZ1DZ4DZ2DZ5MOLIDMOL000211MOL000239MOL000296MOL000033MOL000354MOL000371MOL000378MOL000379MOL000380MOL000387MOL000392MOL000417MOL000422MOL000098MOL001736MOL000358MOL000359MOL000492MOL000073MOL001918MOL001919MOL001924MOL012921MOL012946MOL012976MOL012981活性成分丁子香萜熊竹素常春藤皂苷元（3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R）-10，13-二甲基-17-（2R，5S）-5-丙烷-2-基-2-基-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢化-1H-环戊二烯-3-醇异鼠李素3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚7-O-甲基异微凸剑叶莎醇9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-D-葡萄糖苷黄芪紫檀烷苷联苯双酯芒柄花素毛蕊异黄酮山柰酚槲皮素（-）-花旗松素-谷甾醇谷甾醇（+）-儿茶素表儿茶素芍药总黄酮（3S，5R，8R，9R，10S，14S）-3，17-二羟基-4，4，8，10，14-五甲基-2，3，5，6，7，9-六氢-1H-环戊菲-15，16-二酮芍药苷光千金藤碱大枣皂苷拟雌内酯无次枣因S7OB/%55.3850.8350.8336.2349.6053.7474.6936.7464.2631.1069.6747.7541.8846.4360.5136.9136.9154.8348.9687.5943.5653.8731.5555.3850.8350.83DL0.780.290.750.780.310.480.300.920.420.670.210.240.240.280.270.750.750.240.240.370.530.790.330.780.290.7552第4期姜帆，等.基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制编号DZ6DZ3DZ7DZ8DZ9FDZ10DZ11DZ12DZ13DZ14SJ1SJ2MOLIDMOL012986MOL012989MOL012992MOL001454MOL001522MOL000449MOL004350MOL000627MOL007213MOL000787MOL002773MOL006129MOL001771活性成分枣树皂苷酸枣仁皂苷C滇刺枣碱D黄连素衡州乌药碱豆甾醇芸香苷光千金藤定碱荷叶碱原阿片碱-胡萝卜素6-甲基牙龈二乙酸酯卟啉司特-5-烯-3-醇OB/%36.2349.6053.7474.6936.7464.2631.1069.6747.7541.8846.4360.5136.91DL0.780.310.480.300.920.420.670.210.240.240.280.270.75续表2注：其中正八边形代表HGWD的组方中药并以拼音首字母标出，颜色越深活性成分度值（degree）越大；菱形（蓝色）代表活性成分潜在作用靶点；圆形代表黄芪桂枝五物汤五种组方的共有成分。图1 黄芪桂枝五物汤潜在作用靶点图Figure 1 Potential target maps of of HGWD53广东药科大学学报第39卷图3 KEGG 功能富集分析HGWD治疗RA的通路（前20）Figure 3 KEGG analysis of HGWD therapy pathways for RA（Top 20）图2 黄芪桂枝五物汤与RA关键潜在靶点图Figure 2 Key potential targets of HGWD and RA分，节点的面积及颜色透明度其代表其度值，面积越大、颜色越深说明该节点越重要。根据度值（degree）进行排序，筛选出前10的靶点为信号转导和转录激活因子3（STAT3）、丝裂原活化 蛋 白 激 酶 1（mitogen-activated protein kinase1,MAPK1）、核转录因子-B（nuclear factor kappa-B p65，RELA）、白介素-6（IL-6）及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（protein kinase B,AKT1）等靶点，颜色越深代表度值越大，与其他靶点之间的联系越紧密。见图2。2.4 黄芪桂枝五物汤治疗RA潜在靶点的生物过程分析将 183 个药物活性成分-疾病交集靶点导入Metascape数据库进行GO和KEGG分析，研究其治疗RA的作用靶点及相关信号通路分析。如图3。HGWD 治疗 RA 的 KEGG 富集分析结果见图3，根据校正后的 P 值筛选出前 20 个通路，可知HGWD治疗RA的机制主要与脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、白介素-17 通路（IL-17signaling pathway）、PI3K/AKT 通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK通路（MAPK signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）等信号通路有关。GO 分析结果显示生物过程（biologicalprocess,BP）主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopoly54第4期姜帆，等.基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制图4 BP、CC、MF合图Figure 4 BP,CC and MF composite diagramsaccharide）、细胞迁移的积极调节（positive regulationof cell migration）、炎症反应（inflammatory response）及对细胞因子的反应（response to cytokine）等；细胞组分（cellularcomponent，CC）主要涉及膜筏（membraneraft）、膜微域（membranemicrodomain）和质膜筏（plasmamembraneraft）等组分；分子功能（molecularfunction,MF）主要涉及转录因子结合（transcriptionfactorbinding）、RNA 聚合酶特异性 DNA 结合转录因子结合（RNApolymeraseII-specificDNA-bindingtranscription factorbinding）及DNA结合转录因子结合（DNA-bindingtranscriptionfactorbinding）等 分子功能。以上研究表明黄芪桂枝五物汤治疗 RA可能与炎症反应、AGE/晚期糖基化终产物受体（RAGE）、核受体、DNA转录结合因子、蛋白激酶结合密切相关。如图4。2.5 黄芪桂枝五物汤活性成分-靶点-通路网络构建运用 Cytoscape 3.7.2 内置的 Network Analyzer分析HGWD治疗RA网络拓扑学参数，得到HGWD活性成分-靶点-通路网络，见图5。由图5可知，癌症信号通路、Toll样受体通路、TNF-通路、炎症通路及白介素-17通路等是其防治RA的主要通路，IL-6、TNF-、STAT3、MAPK1、TP53、Bcl-2 是其主要作用靶点，槲皮素、山柰酚、芍药苷、儿茶素等是其主要活性成分。2.6 黄芪桂枝五物汤治疗RA机制预测2.6.1黄芪桂枝五物汤对 CIA 大鼠关节炎指数 AI的影响与正常组相比，模型组AI指数在初次免疫后第829天逐渐升高，并且在第29天达到最高，而后呈下降趋势；与模型组相比，阳性药组在初次免疫后第 22 天 AI 指数明显降低（P0.01）。与模型组相比，阳性药组在初次免疫后第22天AI指数明显降低（P0.05，P0.01）。如表3。2.6.2 黄芪桂枝五物汤对CIA模型大鼠踝关节组织病理形态的影响大鼠踝关节经HE染色如图6所示，正常组大鼠软骨细胞形态结构正常，两侧滑膜未见明显增生及炎症。与正常组相比，模型组（CIA）可见大量骨组织坏死溶解，大面积增生的结缔组织浸润，损伤侵袭至松质骨，且伴有较多新生血管，淋巴细胞散在，中性粒细胞及巨噬细胞浸润，局部可见新生软骨。与模型组比较，阳性药组及HGWD组大鼠结缔组织增生减轻，关节软骨表面结缔组织增生程度减轻，结缔组织排列疏松，伴有少量淋巴细胞点状浸润。富集度55广东药科大学学报第39卷2.6.3 黄芪桂枝五物汤对CIA大鼠血清TNF-、IL-1及IL-6水平的影响与正常组比较，模型组大鼠的TNF-、IL-1及IL-6水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，阳性药组与 HGWD组 TNF-、IL-1及 IL-6水平显著下降（P0.05，P0.01），如表4所示。2.6.4黄芪桂枝五物汤对 CIA 大鼠膝关节滑膜JAK2、STAT3蛋白表达的验证如表5、图7所示，与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织 JAK2、STAT3 蛋白表达量显著升高（P0.05）；与模型组比较，阳性药组、HGWD组大鼠膝关节滑膜组织JAK2、STAT3蛋白表达量显著降低（P0.01），且HGWD组JAK2、STAT3蛋白表达量降低优于阳性药组。图5 黄芪桂枝五物汤活性成分-靶点-通路网络Figure 5 Active ingredients-target-pathway network of HGWD图6 HGWD对 CIA 大鼠踝关节组织病理形态的影响Figure 6 Effect of HGWD on histopathological morphology of ankle joint in CIA rat(HE,200)正常组模型组阳性药组HGWD组表3 HGWD对 CIA 大鼠关节炎指数的影响Table 3 Effect of HGWD on arthritis index of CIA rats(xs,n=8)组别正常组模型组阳性药组HGWD组剂量/（gkg-1）-1.310-45.13第8天-第15天-3.750.89*4.001.074.001.07第22天-4.882.03*1.881.132.881.25第29天-6.251.98*2.251.673.381.51第36天-5.881.81*2.001.852.751.75第43天-5.501.69*1.751.982.001.85与正常组比较：*P0.01；与模型组比较：P0.05，P0.0156第4期姜帆，等.基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制3 讨论RA 发病机制复杂，其发病机制主要包括炎性细胞因子、炎性介质、自身抗体的介导及细胞内信号传递等15。研究表明自身抗原被主要组织相容性复合体II（MHC-II）型阳性抗原提呈细胞（APC）活化，启动特异性免疫应答，同时活化T细胞及巨噬细胞向滑膜迁移导致多种炎性因子分泌增加，浸润滑膜，形成滑膜炎，导致关节畸形和功能丧失，最终形成RA。RA炎症的发生和转归与抑炎因子与促炎因子的平衡与失平衡的转化有关。IL-4 能够活化 T 细胞，抑制 IL-1、TNF-的产生，同时促进 IL-1Ra 产生，抑制炎症；IL-1和TNF-是重要的促炎因子，尤其IL-1能够通过激活单核巨噬细胞、B细胞和T细胞释放细胞因子和抗体，促进破骨细胞分化；TNF-能够刺激滑膜细胞软骨合成前列腺素E2（PGE2），与胶原酶共同促进IL-1和TGF-水平升高，激活破骨细胞，导致滑膜炎与骨溶解等16。临床上 RA药物治疗主要是非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素、抗风湿药（DMARDs）等可有效阻止RA的病理发展17。中医常用中药复方对RA 相关细胞因子及免疫细胞为靶点进行治疗。化瘀通痹方能够减轻关节压痛和关节肿胀，下调TNF-，IL-1含量18；补阳还五汤可以降低胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠血清和关节液中TNF-、IL-1、IL-6和IL-17炎症因子的水平19。本文通过网络药理学方法预测得到HGWD治疗RA的潜在活性成分为槲皮素、山柰酚、芍药苷、儿茶素等。现研究表明，槲皮素20可通过抑制中性粒细胞活性来改善RA小鼠的炎症反应且抑制中性粒细胞浸润，降低血浆细胞因子表达。研究表明21山柰酚可通过阻断 MAPK 通路的激活，抑制 RAFLSs的迁移、侵袭、actin 细胞骨架重组和 MMP 表达，即山柰酚可能是RA的一种辅助治疗药物。另有文献表明芍药苷22通过影响滑膜细胞，降低滑膜中COX-2的表达来抑制大鼠模型关节炎。综上所述，HGWD可通过多成分多靶点治疗RA。通过动物实验，验证了HGWD可通过Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）通路，作为Toll样受体通路、TNF-通路、PI3K/AKT通路等通路的下游通路，对于类风湿关节炎23、银屑病24和溃疡性结肠炎等多种免疫性疾病的发病具有关键作用。例如 Toll 样受体活化后，细胞分泌的 IL-6、IL-1、TNF-及干扰素（IFNs）等多种促炎细胞因子与JAK受体结合后，启动受体亚基结合或重排，JAK受体磷酸化后，诱导STAT与受体结合并被磷酸化，磷酸化后的STAT与受体分离后形成同源或异源二聚体，转移至细胞核中，与DNA特定结合位点结合并诱导炎症联级反应25-26。JAK2是JAK激酶之一，广泛存在于体内各个组织细胞，JAK2抑制剂如托法替布可有效治疗 RA 相关动物模型以及 RA 患者27。STAT3是信号转导和转录激活因子之一，在RA发病机制中具有关键性作用，能够保护成纤维样滑膜细胞，激活T细胞，促进自身抗体类风湿因子或抗瓜氨酸蛋白抗体产生28-29，因此，JAK2/STAT3通路可调控抑制炎症反应，以达到治疗RA作用。表5 黄芪桂枝五物汤中JAK2/STAT3通路蛋白表达水平Table 5Effect of HGWD on the expressions of JAK2/STAT3pathway proteins(xs,n=3)组别正常组模型组阳性药组HGWD组剂量/（gkg-1）-1.310-45.13JAK2/GAPDH0.070.051.340.37*0.710.030.070.07STAT3/GAPDH0.140.061.280.24*0.520.310.090.07与正常组比较：*P0.05；与模型组比较：P0.01。表4 黄芪桂枝五物汤对 CIA 大鼠血清炎症因子水平的影响Table 4 Effect of HGWD on serum inflammatory factor levels in CIA rats(xs,n=8)组别正常组模型组阳性药组HGWD组剂量/（gkg-1）-1.310-45.13（TNF-）/（ngL-1）623.2525.46713.5843.65*618.5820.43636.3327.28（IL-1）/（ngL-1）226.0323.62370.9830.36*263.6710.75233.5025.36（IL-6）/（pgmL-1）171.277.71230.3311.77*181.024.58188.893.31与正常组比较：*P0.01；与模型组比较：P0.05，P0.01。正常模型阳性HGWD130 kDa88 kDa36 kDaJAK2STAT3GAPDH图7 HGWD对膝关节滑膜JAK2、STAT3蛋白表达的影响Figure 7Effect of HGWD on the expressions of JAK2 andSTAT3 proteins in synovial tissues of CIA rats(n=3)57广东药科大学学报第39卷综上所述，HGWD给药后，HE染色结果显示，HGWD能够缓解RA的滑膜增生和炎症，从而减轻大鼠脚部肿胀程度，缓解症状。HGWD 能够降低CIA 模型大鼠内促炎因子 TNF-、IL-1、IL-6 的水平，JAK2、STAT3蛋白表达显著降低